口食品中大肠菌群、粪大肠菌群大肠杆菌检验方法.docx

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1、口食品中大肠菌群、粪大肠菌群大肠杆菌检验方法2004-02-04 10:03:53. 563中华人民共和国进出口商品检验行业标准 中华人民共和国进出U商品检验行业标准和大肠杆菌检验方法和大肠杆菌检验方法代替 ZB X09 002 一 88 coliform出II食品中大肠菌群、粪大肠菌群SN 0169-92Method for examination of coliform, fecal and escherichia coli in food for export1主题内容与适用范围本标准规定了出口食品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌的检验方法。 本标准适用于出口食品的检验。2设备和材料1吸

2、管:1mL,具0. 1mL刻度;5mL和10mL,具1mL刻度。2.2 水浴箱：44.5+0. 5o培养箱：36l,44.50.5o2.3 冰箱：05和-15-20o均质器。2.4 乳钵和研棒。2. 7平皿：直径90mm。2. 8天平：感量0.1g。2.9显微镜。2. 10稀释瓶：100mL. 200mL和500mL三角烧瓶及广口瓶。2. 11玻璃珠：直径约5nim。2. 12菌落计数器。3培养基及试剂月桂基硫酸盐胰蛋白(月示)(LST)肉汤。2.1 煌绿乳糖胆盐(BGLB)肉汤。2.2 EC肉汤。2.3 伊红美蓝琼脂(EMB)。2.4 营养琼脂斜面。2.5 色氨酸肉汤。2.6 MR-VP培养

3、基。3. 8 Korser氏枸椽酸盐肉汤。3.9结晶紫中性红胆盐琼脂(VRBA)。3. 10 Butterfield氏磷酸盐缓冲稀释液。3. 11生理盐水。3.12革兰氏染色液。3. 13 Kovacs氏靛基质试剂。3. 14甲基红指示剂。3. 15 Voges-pros kauer （V-P）试剂。4样品制备以无菌操作取有代表性的样品。如有包装则用75%乙醇在开口处擦拭后取样。若 不能及时检验,应将冷冻样品置.于T5C保存；非冷冻而易腐的食品,应置4C冰箱保存。检验前冷冻样品可于25 18h内解冻，或在45c以下15min内解冻。3.1 不同食品样品匀液的制备2. 1液体食品以灭菌吸管取样2

4、5mL放入装有225mL稀释剂的灭菌玻璃瓶（瓶内预置适当数量的玻璃 珠），以30cm幅度、于7s内振摇25次（或以机械振荡器振摇），制成1:10的样品匀液。4. 2.2固体和半固体食品以无菌操作取25 g样品，放入装有225 mL稀释剂的灭菌均质杯内，于8000 r/min 均质l-2min,制成1:10样品匀液（也可用灭菌乳钵研磨的方法代替）。4. 3稀释样品匀液根据对样品污染情况的估计,用稀释剂将样品匀液制成一系列十倍 递增的样品稀释液，如10*-2、10*-3、10*-4。从制备样品匀液至稀释完毕，全过 程不得超过15mino5大肠菌群的测定5. 1大肠菌群MPN值的测定对每个样品，选择

5、适宜的三个连续稀释度的样品稀释液。每个稀释度接种三管 月桂基硫酸盐胰蛋白（月示）（LST）肉汤，每管接种ImLo5. 1.2将接种管置于361培养482h。5. 1. 3观察试管的产气情况：检查倒管内是否有气泡产生,记录在24h和48h内产气 的LST肉汤管数。如所有LST肉汤管均未产气,则可报告为大肠菌群阴性；如有产气者，则进步作证实试验。5.2大肠菌群的证实试验2. 1将所有产气管用直径为3mm的接种环移种到煌绿乳糖胆盐（BGLB）肉汤管中。5. 2.2 置BGLB肉汤管于36 培养482h。6. 2. 3记录所有BGI,B肉汤管的产气管数。7. 2.4结果报告：按BGLB肉汤产气管数，查

6、MPN表见附录B （补充件）报告每克（亳 升）样品中大肠菌群的MPN值。6粪大肠菌群测定1用直径为3nlm的接种环将所有482h内产气的LST肉汤管培养物移种于EC肉汤 管中。6.2将所有接种的EC肉汤管在30min内放入带盖44.50.5水浴箱内，培养242h. 水浴箱的水平面应高于肉汤培养基液面。应以已知为44. 5产气阳性的大肠杆菌和44.5C 不产气的产气肠杆菌或其他大肠菌群细菌作阳性和阴性对照。6.3记录EC肉汤管的产气情况。产气管为粪大肠菌群试验阳性；不产气管为粪大肠 菌群试验阴性。6.4结果报告：按产气管数，查MPN表报告每克（亳升）样品中粪大肠菌群的MPN值。7大肠杆菌测定7.

7、1将6. 3条中的EC肉汤管继续培养24h,取其产气管的培养物划线接种于伊红美蓝 （EMB）平板,361培养242ho2检查平板上有无具黑色中心有光泽或无光泽的典型菌落。7. 3如有典型菌落，则从每个平板上至少挑取2个典型菌落；如无典型菌落,则从每个 平板上至少挑取2个可疑菌落。用接种针接触菌落中心部位,移种到营养琼脂斜面上,361培养1824h。7. 4将斜面培养物移种到下列培养基中进行生化试验。7 . 4. 1色氨酸肉汤:在361培养242h后，加Kovacs氏试剂0. 20. 3mL,上层出 现红色为靛基质阳性反应。8 .4.2 MR-VP培养基：在361培养482h。以无菌操作移取培养

8、物1 mL至13mmX100mm试管中，加5% a -茶酚乙醇溶液0. 6mL, 40%氢氧化钾溶液0. 2mL和少许肌酸结晶,振摇 试管后静置2h,如出现伊红色,为VP试验阳性。将MR-VP培养物的剩余部分再培养48h滴加5滴甲基红溶液。如培养物变红色， 为甲基红试验阳性,若变黄色则为阴性反应。7. 4. 3 Koser氏枸椽酸盐肉汤：361培养96h记录有无生长。7. 4.4 LST肉汤：于361培养482h,观察试管中是否产气。7. 4. 5革兰氏染色：取18h营养琼脂斜面培养物作革兰氏染色。大肠杆菌为革兰氏阴 性。6. 4. 6大肠杆菌与非大肠杆菌生化鉴别如下： 靛基质I MR | V

9、P |枸椽酸盐|鉴定（型别）+ I + I - I - I典型大肠杆菌I + I - I - |非典型大肠杆菌+ I + I - I + I典型中间型I + I I + I非典型中间型-I- I+ I+I典型产气肠杆菌+I I+ I+I非典型产气肠杆菌如出现上表以外的生化反应类型,表明培养物可能不纯,应重新划线分离,必要时 做 重复试验。7.5结果报告：大肠杆菌为革兰氏阴性无芽抱杆菌，发酵乳糖产酸产气试验为 + +或一 + ，再根据LST肉汤阳性管数查MPN表，报告每克(亳升)样品中大肠杆菌 MPN 值。8大肠菌群固体培养基测定法样品制备同第4章。8.1 计数8. 2.1选取适宜的三个连续稀释

10、度的样品液,每个稀释度接种两个灭菌平皿,每皿 ImLo另取1mL稀释剂加入一个灭菌平皿中，作空白对照。8. 2. 2将冷至45 + 0. 5的结晶紫中性红胆盐琼脂(VRBA) 1015mL倾注于每个平皿 中。小心旋转平皿,将培养基与样液充分混匀。8. 2. 3待琼脂凝固后，再加34mL VRBA覆盖平板表层。8. 2.4翻转平板，置于361培养1824h。8. 2.5选用有30150个菌落的平板，计数平板上出现的典型大肠菌群菌落。典型菌 落为紫红色,菌落周围有红色的胆盐沉淀环。菌落直径为0. 5mm或更大。8. 2. 6证实8. 2. 6. 1从VRBA平板上挑取10个不同类型的典型和可疑菌落

11、,移种于BGLB肉汤管内， 36 1培养24h和48h,观察产气情况。8. 2. 6. 2将出现产气的肉汤管判为大肠菌群阳性。对形成菌膜的阳性管，应进行革兰 氏染色，以便排除革兰氏阳性杆菌。8. 2.7结果报告经最后证实为阳性(产气,革兰氏阴性杆菌)的试管百分比乘以于8. 2. 5条中计数 的平板菌落数,再乘以稀释倍数,即为每克(亳升)样品中大肠菌群数。例：10*-4样品稀释液1mL,在VRBA平板上有100个典型和可疑菌落,挑取其中10 个接种BGLB肉汤管，证实有6个阳性管，则该样品的大肠菌群数为：100X6/10X10*-4/g(mL) =6.0X10*5/g(mL)培养基和试剂（补充件

12、）A1月桂基硫酸盐胰蛋白（月示）（LST）肉汤胰蛋白（月示）或胰酪族（Trypticasc） 20g氯化钠5.0g乳糖5.0g磷酸氢二钾（K2HPO4） 2. 75g磷酸二氢钾（KH2P04） 2. 75g月桂基硫酸钠0. 1g蒸储水1000. 0mL将各成分溶解于蒸储水中。分装到有倒立发酵管的20mmX 150mm试管中，每管10矶。 121c高压灭菌 15min。最终 pH6.80.2。A2煌绿乳糖胆盐（BGAB）肉汤蛋白陈10. 0g乳糖10.0g牛胆粉（oxgall 或 oxbile）溶液 200. 0mL0.1 %煌绿水溶液13. 3mL蒸镭水将蛋白陈乳糖溶于约500mL蒸镭水中，加

13、入牛胆粉溶液200nli，（将20. 0g脱水牛胆粉 溶于200 ml.蒸储水中,pH7.。7. 5）,用蒸储水稀释到975mL,调pH7. 4。再加入0. 1%煌绿水 溶液13. 3mL,用蒸储水补足到1000mL,用棉花过滤后，分装到20mmX 150mm试管（管内有倒 立的小发酵管）中，每管10mL。121高压灭菌15min。最终pH7.20. 1。A3 EC肉汤胰蛋白（月示）或胰酪（月示）20. 0g3号胆盐或混合胆盐1.5g乳糖5.0g磷酸氢二钾（K2HPO4） 4. 0g磷酸二氢钾（KH2P04） 1.5g氯化钠5.0g蒸储水1000. 0mL将以上成分溶解于蒸储水中，分装16mm

14、X 150mm试管（管内有倒立的小发酵管），每 管8mLo 121C高压灭菌 15min,最终 pH6.90. 1。A4伊红美蓝琼脂（EMB）蛋白陈10. 0g乳糖10. 0g磷酸氢二钾（K2HP04） 2. 0g琼脂15. Og伊红Y (水溶性)0. 4g或2%水溶液20mL美蓝0. 065g或0. 5%水溶液13mL蒸储水1000.0mL在1000mL蒸储水中煮沸溶解蛋白陈、磷酸盐和琼脂，加水补足至原量。分装三 角烧瓶中。每瓶100mL或200mL,高压灭菌15min(最终pH7. 10. 2。使用前将琼脂融化, 于每100mL琼脂中加5mL灭菌的20%乳糖水溶液、2mL的2%伊红y水溶液

15、和1. 3mL0. 5% 的美蓝水溶液,摇匀，冷至4550倾注平皿。A5营养琼脂斜面牛肉膏3.0g蛋白陈5.0g琼脂15. 0g蒸储水1000. 0mL将各成分加于蒸储水中，煮沸溶解,分装合适的试管。121C高压灭菌最终 PH7.3+0. Io灭菌后摆成斜面备用。A5色氨酸肉汤胰豚或胰酪陈10.0g蒸储水1000. 0mL加热搅拌溶解胰豚或胰酪陈于蒸储水中。分装试管，每管5mL。121高压灭菌15mino最终 pH6.90.2oA7 MR-VP培养基(月示)腺7. 0g葡萄糖5.0g磷酸氢二钾(K2HP04) 5. 0g蒸镭水1000. 0mL将各成分溶于蒸储水中，分装试管，121高压灭菌15

16、min,最终pH6. 90. 2。A8 Koser氏枸椽酸盐肉汤磷酸氢铉钠(NaNH4HPO4 4H20)1.5g磷酸氢二钾(K2HP04) 1.0g硫酸镁(MgS04 7H20)0.2g枸椽酸钠(含2H20)3.0g蒸储水1000. 0mL将各成分溶解于蒸储水中，分装试管,每管10 mL, 121高压灭菌15min。最终pH6. 7 0.2。A9结晶紫中性红胆盐琼脂(VRBA)蛋白陈7.0g酵母育3.0g乳糖10.0g氯化钠5.0g1.5g1.5g胆盐或3号胆盐中性红0.03g结晶紫0.002g琼脂1518g蒸储水1000.0mL将上述成分溶于蒸储水中，静置几分钟，充分搅拌,调至pH7. 4

17、0. Io煮沸2min,将 培养基冷至4550倾注平板。临用时制备,不得超过3h。A10 Butterfield氏磷酸盐缓冲稀释液贮存液磷酸二氢钾（KH2P04） 34.0g蒸储水500mL将磷酸二氢钾溶于蒸储水中，用1 mol/L氢氧化钠约175 mL调至pH7. 2。用蒸储水 加至1000mL贮存于冰箱。稀释液取贮存液1. 25mL,用蒸储水稀释至1000mL,分装于合适容器后，121高压灭菌AU生理盐水氯化钠8.5g蒸储水1000. 0mL将氯化钠溶于蒸储水中，121高压灭菌15minA12革兰氏染色液结晶紫染色液：结晶紫L（）g95% 乙醇 20. 0mL1 %草酸铉水溶液80. 0m

18、L将结晶紫完全溶解于乙醉中，然后与草酸核溶液混合。革兰氏碘液：碘1.0g碘化钾2.0g蒸播水300.0mL将碘与碘化钾先行混合,加入蒸储水少许充分振摇,待完全溶解后,再加蒸储水至 300mLo沙黄复染液：沙黄0.25g95% 乙醇 10. 0mL蒸饰水90. 0mL将沙黄溶解于乙醇中,然后用蒸镭水稀释。染色法a.将涂片在火焰上固定,滴加结晶紫染液,染Imin,水洗。b.滴加革兰氏碘液，作用Imin,水洗。c.滴加93%乙醇脱色约1530s,直至染色液被洗掉,不要过分脱色,水洗。d.滴加复染液，复染Imin,水洗、待干、镜检。结果：革兰氏阳性菌呈紫色，革兰氏阴性菌呈红色。A13 Kovacs氏靛

19、基质试剂对二甲氨基苯甲醛5.0g戊醇75. 0mL盐酸（浓）25. 0mL将对二甲氨基苯甲醛溶于戊醇中，然后慢慢加入浓盐酸即可。A14甲基红指示剂甲基红（）.1g95% 乙醇 300mL将甲基红溶解于300mL乙醇中，加水稀释至500mL.A15 Voges-Pros kauer（V-P）试剂甲液a -蔡酚5. 0g无水乙醇100. 0mL乙液氢氧化钾40. 0g用蒸锵水加至100. 0mL附录B1g检样中最近似值（MPN）表（补充件）使用三管法,接种量分别为0. 1, 0. 01和0. OOlgo11I阳性管数1 1阳性管数1MPM | UDMlx 1| Ml N0. 1 0.01 0. 0

20、01 | | 0. 1 0.01 0. 001 | 11000 |110011注：本表采用3个稀释度0. Ig(mL), 0. 01g(mL)和0.00lg(mL),每个稀释度接种3 管。表内所列检样量如改用Ig(mL), 0. Ig(mL)和O.Olg(mL)时,表内数字应相应降低 10倍；如改用0.01g(mL) (). OOlg(mL)和0. OOOlgGnL)时，则表内数字应相应增加10倍， 其余类推。附加说明：本标准由中华人民共和国国家进出口商品检验局提出。本标准由中华人民共和国秦皇岛进出口商品检验局、安徽进出口商品检验局、山西进 出口商品检验局负责起草。本标准主要起草人李桂生、汤鹏K、于桂华。本标准主要参考美国公职分析化学家协会(AOAC)法定分析方法第14版第46章(1984 年)。中华人民共和国国家进出口商品检验局1992-12-28批准1993-05-01实施