纳米金属氧化物-米诺环素纳米缓释凝胶及其制备方法和应用.docx

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1、纳米金属氧化物米诺环素纳米缓释凝胶及其制备方法和应用纳米金属氧化物-米诺环素纳米缓释凝胶及其制备方法和应用技术领域本发明涉及纳米材料 与抗菌药物协同作用的临床研究，用于制备牙科用药品，特别用于治疗急慢性牙周炎和牙龈 病。背景技术牙周病是指侵犯牙龈和牙周支持组织的一类慢性、感染性、破坏性疾病，在 世界范围内患病率较高，是导致成人失牙的主要原因。牙周病的发病机制复杂，普遍认为细 菌是导致牙周病发生的最关键因素。目前牙周病治疗的主要手段是洁刮治与根面平整，这两 种方法虽然可以减少部分龈下致病菌的数量，但不能完全消除龈下致病菌，洁刮治术后龈下 细菌会缓慢增长，逐渐恢复到治疗前水平。自20世纪80年代以

2、来，将抗菌药物制成局部制 剂，作为洁刮治与根面平整的辅助手段，日益受到关注。盐酸米诺环素，化学名为7,7-二甲 胺四环素，是一种速效、长效的半合成四环素。本品为无臭、味苦的黄色结晶粉末，遇光易 变质，微溶于水，易溶于乙醇、碳酸氢钠、氢氧化钠溶液中。盐酸米诺环素能抑制98 %的 牙周病原菌（如牙龈吓咻单胞菌（Pg）、伴放线杆菌（Aa）等），抗菌作用为四环素类药物中 最强（最低抑菌浓度5咫/mL）。该药物还可粘附在牙根表面，不易被龈沟液冲离牙周袋， 可长期保存其抗菌活性和对宿主的调节作用，因此盐酸米诺环素可作为牙周炎的首选药物。 但米诺环素是高脂溶性药物，易进入人体组织，半衰期长达20小时，具有较

3、强的肝肾毒性。米诺环素在龈沟液中药物浓度比血浆中高5倍，易于螯合金属离子沉积在牙齿表面，导致牙 齿变色，影响美观。因此常用米诺环素局部缓释制剂来解决这一问题。目前已有研究报道的 米诺环素局部缓释制剂主要有五种类型：一、30 %米诺环素乙基纤维素薄膜。该缓释剂的载 体中含有乙醇、氯仿和聚乙烯乙二醇,它的不足之处是聚乙烯乙二醇是人工合成高分子材料, 长期使用易在人体组织内积蓄，通过体内、体外代谢产生有毒物质；二、米诺环素可吸收微 球。它的不足之处包括：药物包封率及载药量低；由于微球形状和体内生物降解等造成的药 物非零级释放；尚未实现药物在最合适的时间内释放；对缓释系统内药物的不同释放程序和 速度的

4、研究不足;三、2 %米诺环素凝胶。但浓度波动较大,用药后GCF浓度可达1000 咫/mL, 3小时后下降3g/mL；四、米诺环素软膏。但药物释放速度不稳定，有效药物浓度低。五、 米诺环素脂质体。液态脂质体的贮存稳定性较差，易发生团聚、融合及药物渗漏，同时脂质 体受温度、光线等影响会产生乳析、凝聚、融合和粒径变大等现象，这些不足之处使脂质体 的应用受到了很大限制。因此提高米诺环素局部制剂的药物释放稳定性和有效性成为研究的 热点之一。发明内容本发明所解决的技术问题是提供一种纳米氧化锌-米诺环素纳米凝胶及 其制备方法和应用。本发明的技术方案如下：一种含有活性金属氧化物和盐酸米诺环素的纳 米凝胶，其组

5、分包括米诺环素药物、金属氧化物、生物可降解高分子材料、卡波姆胶940、 化学交联剂；所述重量百分比为：米诺环素0.005 %0.5% （W/W）,生物可降解高分子材 料20%40%（W/W）,纳米金属氧化物0.2%0.6% （W/W）,卡波姆胶CBM-940 60% 80%, 卡波姆胶与化学交联剂之比为：10mL:lg10mL:2nL。所述的活性金属氧化物纳米材料包 括纳米氧化锌、纳米氧化银、纳米二氧化钛中的一种或几种。所述的生物可降解高分子材料 包括白蛋白、明胶、竣甲基纤维素钠等多种材料中的一种或几种。所述的化学交联剂包括 磷酸、戊二醛、多聚甲醛、多聚磷酸等化合物中的一种或几种。活性金属氧化

6、物米诺环素纳 米凝胶的制备方法如下：步骤1、本发明中纳米氧化锌的制备方法：精确配置lmol/L的乙 酸锌水溶液待用；然后，称量0.3644 g的十六烷基三甲基溟化镂（CTAB）,加入到10 ml 的环己烷中；随后向溶液中精确滴加5ml的异丙醇（IPA）,持续搅拌至形成均匀的乳白色乳 液;保持搅拌的状态，向溶液中缓慢滴加之前配置的乙酸锌水溶液，直到溶液体系瞬间澄清， 说明两相体系已经形成了反胶束微乳液；继续滴加乙酸锌水溶液，该透明状态仍会在一定范 围内保持澄清。30004000 rpm旋转离心得纳米氧化锌颗粒，粒径保持在20200纳米。步 骤2、本发明中盐酸米诺环素纳米蛋白纳米粒的制备方法：将1

7、00 mg盐酸米诺环素溶于200 mL水中，充分搅拌后过滤取清液，用氢氧化钠的甲醇溶液（pH值为7.5）配成不同浓度的米诺环素溶液。取0.5%的米诺环素溶液0.1ml溶于0.9 ml缓冲溶液（磷酸二氢钾一氢氧化 钠，pH约为8）中配置成0.05%米诺环素缓冲液。取缓冲液1mL于西林瓶中，再分别加入 一定量的纳米氧化锌固体和白蛋白，500 rpm匀速搅拌10 min后，加入45倍体积的乙醇, 稍微搅拌1 min后加入混合液体积比2 %的多聚磷酸（20日1_）,搅拌3060 min得到白蛋白 纳米粒，粒径控制在300 nm左右。步骤3、本发明中纳米氧化锌一米诺环素纳米凝胶的制 备方法：用蒸储水配制

8、10 %的卡波姆胶40 oC条件下搅拌至其完全溶解。冷却至室温后， 放置到搅拌器中，边搅拌边加入质量分数为0%, 0.2%, 0.4%, 0.6%的纳米氧化锌一米诺 环素的蛋白纳米粒，搅拌混匀，用三乙醇胺调节pH值至7形成凝胶，超声波脱气30 mino 本发明的有益效果如下：（1）活性氧化物纳米粒子携带药物分子通过内吞作用进入细胞并聚 集在靶细胞的特定部位，提高靶区的药物浓度、药物利用率和疗效，降低药物的毒副作用以 及一些不良反应。（2）缓控释效果好。可降解生物高分子材料和凝胶都具有缓控释作用，可 以在牙周袋内维持较长时间的药物浓度，可持续起效10天。附图说明 图1是本发明的 活性氧化物一米诺

9、环素纳米粒电镜图。图2是本发明的体外实验结果：活性氧化物一米诺环 素纳米粒凝胶细胞毒性研究。图3是本发明的体外实验结果：活性氧化物一米诺环素纳米粒 凝胶的抑菌性能测试。具体实施方式以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。实施 例1：纳米氧化锌一米诺环素白蛋白凝胶的制备一、纳米氧化锌的制备十六烷基三甲基溟化 钱CTAB 0.3644 g、环己烷10 ml置于反应瓶中，精确滴加异丙醇IPA 5 mI,室温搅拌至形成 均匀的乳白色乳液；保持搅拌的状态，向溶液中缓慢滴加lmol/L的乙酸锌水溶液，直到溶 液体系瞬间澄清。30004000 rpm旋转离心得纳米氧化锌颗粒，粒径保持在20 200纳米。

10、二、米诺环素缓冲液的制备100 mg盐酸米诺环素胶囊内容物置于500 mL烧杯中，加入200 mL蒸储水溶解，充分搅拌后过滤取清液，用氢氧化钠的甲醇溶液调至pH值为7.5,得50% 浓度的米诺环素溶液。取27.22 g磷酸二氢钾于1000 mL容量瓶中，用水溶解并稀释至刻度，得0.2 mol/L磷酸二氢钾溶液。取8.00 g氢氧化钠于1000 mL容量瓶中，用水溶解并稀 释至刻度，得0.2 mol/L氢氧化钠溶液。取250 ml磷酸二氢钾溶液（0.2 mol/L）与230.5 mL 氢氧化钠溶液（0.2 mol/L）于1000mL容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，即得磷酸二氢钾 一氢氧化钠缓冲液

11、（pH值为8）o取0.5%的米诺环素溶液0.1 ml于10 mL容量瓶中，加0.9 ml 磷酸二氢钾一氢氧化钠缓冲溶液至刻度，摇匀，即得0.05%米诺环素缓冲液。三、纳米氧化 锌一米诺环素蛋白纳米粒的制备取纳米氧化锌固体0.1 mg、白蛋白4 mg于10 mL西林瓶中， 加入0.05%米诺环素磷酸盐缓冲液1mL,室温下500 rpm匀速搅拌10 min后，加入4 mL乙 醇，稍微搅拌1 min后，加入多聚磷酸20同，继续搅拌30 min后得纳米氧化锌一米诺环素 蛋白纳米粒，粒径仪检测粒径发现粒径控制在300 nm左右。按照上述方法分别制备含氧化 锌质量分数为0 %、0.2 %. 0.4%、0.

12、6 %的纳米氧化锌一米诺环素的蛋白纳米粒。四、 纳米氧化锌一米诺环素凝胶的制备取卡波姆胶固体1 g于100 mL烧杯中，加入100 mL蒸储 水，置于40 oC水浴搅拌至固体完全溶解。冷却至室温后，放置到搅拌器中，边搅拌边加入 含氧化锌质量分数为0 %、0.2%、0.4%. 0.6%等不同浓度的纳米氧化锌一米诺环素的蛋 白纳米粒，搅拌混匀，逐滴滴加三乙醇胺调节pH值，pH值为7时形成透明凝胶，超声波 脱气30 min后即得目标产品。实施例2：纳米氧化银一米诺环素白蛋白凝胶的制备一、纳 米氧化银的制备向含0.04 mol/L NaOH溶液和环己烷各10 mL的反应瓶中加入0.3688 g CTA

13、B 固体，室温搅拌至固体完全溶解，向溶液中缓慢滴加0.04 mol/L的硝酸银水溶液，40oC搅 拌1 h,溶液有黑褐色混浊生成。反应结束后,用低速自动平衡离心机在4000 rpm离心分离， 产物依次用无水乙醇、蒸谓水各洗涤3次以除去残留的离子和CTAB。洗涤后的产物置于60 oC真空干燥箱中干燥Id,得到最终的纳米氧化银粉末，粒径保持在70100纳米，粒径分 布均匀，分散性较好。二、米诺环素缓冲液的制备100 mg盐酸米诺环素胶囊内容物置于500 mL烧杯中，加入200 mL蒸储水溶解，充分搅拌后过滤取清液，用氢氧化钠的甲醇溶液调至 pH值为75 得50 %浓度的米诺环素溶液。取27.22

14、g磷酸二氢钾于1000 mL容量瓶中，用 水溶解并稀释至刻度，得0.2mol/L磷酸二氢钾溶液。取8.00 g氢氧化钠于1000 mL容量瓶 中，用水溶解并稀释至至刻度，得0.2 mol/L氢氧化钠溶液。取250 ml磷酸二氢钾溶液(0.2mol/L)与230.5 mL氢氧化钠溶液(0.2 mol/L)于1000 mL容量瓶中，用水稀释至刻度， 摇匀，即得磷酸二氢钾一氢氧化钠缓冲液(pH值为8)。取0.5 %的米诺环素溶液0.1 ml于 10 mL容量瓶中，加0.9 ml磷酸二氢钾一氢氧化钠缓冲溶液至刻度，摇匀，即得0.05 %米诺 环素缓冲液。三、纳米氧化银一米诺环素蛋白纳米粒的制备取纳米氧

15、化银固体0.1 mg、白蛋 白4 mg于10 mL西林瓶中，加入0.05 %米诺环素磷酸盐缓冲液1 mL,室温下500 rpm匀速 搅拌10 min后，加入4 mL乙醇，稍微搅拌1 min后，加入化学交联剂多聚磷酸20同，继 续搅拌30min后得纳米氧化银一米诺环素蛋白纳米粒，粒径仪检测粒径发现粒径控制在300 nm左右。按照上述方法分别制备含氧化银质量分数为0 %、0.2 % 0.4%、0.6 %的纳米 氧化银一米诺环素的蛋白纳米粒。四、纳米氧化银一米诺环素凝胶的制备取卡波姆胶固体1 g于100 mL烧杯中，加入100 mL蒸储水，置于40 oC水浴搅拌至固体完全溶解。冷却至室 温后,放置到

16、搅拌器中，边搅拌边加入质量分数为0%、0.2%、0.4%、0.6%等不同浓度的 纳米氧化银一米诺环素的蛋白纳米粒，搅拌混匀，逐滴滴加三乙醇胺调节pH值，pH值为7 时形成透明凝胶，超声波脱气30 min后即得目标产品。实施例3：纳米氧化钛一米诺环素白 蛋白凝胶的制备一、纳米氧化钛的制备取6 g硫酸钛于1000 mL容量瓶中，用水溶解并稀释 至刻度，得0.05 mol/L硫酸钛溶液。取0.05 mol/L的硫酸钛溶液1000 mL置于烧杯中，在搅 拌条件下，加入浓度为0.01 mol/L的EDTA溶液50 mL,静置一段时间后，用氢氧化钠溶液(0.1 mol/L)调节溶液pH值至出现白色沉淀为止

17、。水浴加热到80 oC保温2小时，沉淀洗 涤直到无硫酸根离子为止。洗涤后的产物置于150真空干燥箱中干燥2 h,在红外线炉中 在500 oC下煨烧2小时，得到最终的纳米氧化钛颗粒，粒径保持在40100纳米，粒径分 布均匀，分散性较好。二、米诺环素缓冲液的制备100 mg盐酸米诺环素胶囊内容物置于500 mL烧杯中，加入200 mL蒸储水溶解，充分搅拌后过滤取清液，用氢氧化钠的甲醇溶液调至 pH值为75 得50 %浓度的米诺环素溶液。取27.22 g磷酸二氢钾于1000 mL容量瓶中，用 水溶解并稀释至刻度，得0.2 mol/L磷酸二氢钾溶液。取8.00 g氢氧化钠于1000 mL容量瓶 中，用

18、水溶解并稀释至至刻度，得0.2 mol/L氢氧化钠溶液。取250 ml磷酸二氢钾溶液(0.2 mol/L)与230.5 mL氢氧化钠溶液(0.2 mol/L)于1000 mL容量瓶中，用水稀释至刻度，摇 匀，即得磷酸二氢钾一氢氧化钠缓冲液(pH值为8)o取0.5%的米诺环素溶液0.1 ml于10 mL 容量瓶中，加0.9 ml磷酸二氢钾一氢氧化钠缓冲溶液至刻度，摇匀，即得0.05%米诺环素缓 冲液。三、纳米氧化钛一米诺环素蛋白纳米粒的制备取纳米氧化钛固体0.1 mg、白蛋白4 mg 于10 mL西林瓶中，加入0.05 %米诺环素磷酸盐缓冲液1 mL,室温下500 rpm匀速搅拌10 min 后

19、，加入4 mL乙醇，稍微搅拌1 min后，加入多聚磷酸20同，继续搅拌30min后得纳米氧 化钛一米诺环素蛋白纳米粒，粒径仪检测粒径发现粒径控制在200 nm左右。按照上述方法 分别制备含氧化钛质量分数为0 %、0.2 %、0.4 %、0.6 %的纳米氧化钛一米诺环素的蛋 白纳米粒。四、纳米氧化钛一米诺环素凝胶的制备取卡波姆胶固体1 g于100 mL烧杯中， 加入100 mL蒸僧水，置于40 oC水浴搅拌至固体完全溶解。冷却至室温后，放置到搅拌器 中，边搅拌边加入质量分数为0%、2%、4%、6 %等不同浓度的纳米氧化钛一米诺环素的 蛋白纳米粒，搅拌混匀，逐滴滴加三乙醇胺调节pH值，pH值为7时

20、形成透明凝胶，超声 波脱气30 min后即得目标产品。图1是氧化锌一米诺环素白蛋白纳米粒粒径图，结果显示 氧化锌一米诺环素纳米粒粒径保持在100 nm以下，属于纳米粒。细胞毒性试验：收集对数 期L929小鼠成纤维细胞，加入96孔平底板，每孔加入100山 在5%CO2, 37 oC孵育至 细胞单层铺满孔底。加入浓度梯度的药物，5%CO2, 37 0c孵育1648小时，倒置显微镜下 观察。每孔加入20川MTT溶液(5mg/ml,即0.5%MTT),继续培养4 h后终止培养，小心 吸去孔内培养液。每孔加入1503二甲基亚碉，置摇床上低速振荡10 min,使结晶物充分 溶解。在酶联免疫检测仪OD 49

21、0 nm处测量各孔的吸光值，计算细胞存活率。图2是盐酸 米诺环素溶液不同作用时间的细胞毒性实验结果；p B:口腔链球菌/缓症链球菌(S.oralis/S. mitis)为需氧菌的代表、C中间普氏菌/黑普氏菌(Prevotella intemedia, Pi)和D牙龈口卜琳单胞 菌(Porphyromonas gingivalis, Pg)为厌氧菌的代表，用打孔法来评价水凝胶的抑菌效果。将四 种不同的菌接种到琼脂平板上，用直径为4mm的打孔器在每个营养琼脂平板上均匀打出4 个孔。用微量移液器加入35Hl配置好的不同纳米氧化锌含量的凝胶(米诺环素浓度为5 |ig/mL)o静置，倒置培养皿于37 0

22、c培养24 h后，用游标卡尺测量抑菌直径。抑菌圈直径 /mm二总抑菌直径一孔直径(4 mm)o图3是本发明的抑菌性能体外实验结果：抑菌圈直径 大于7 mm视为有抑菌活性。可以看出，虽然未添加纳米氧化锌的凝胶对细菌有一定的抑菌 作用，但是明显低于添加了不同含量纳米氧化锌的抑菌效果，且抑菌效果随着纳米氧化锌含 量的增加而增强。当添加到0.6%时，其抑菌作用显著增强(P B： 口腔链球菌/缓症链球菌(S.oralis/S. mitis)、C：中间普氏菌/黑普氏 菌(Prevotella intemedia, Pi)、D：牙龈口卜咻单胞菌(Porphyromonas gingivalis, Pg)。由此可知， 纳米氧化锌作为抑菌因子提高了凝胶的抑菌性能。添加的纳米氧化锌越多，对细菌的抑制效 果越明显。由此可以推断，抑菌性能高低和纳米粒子的多少成正比，纳米氧化锌越多，具备 抑菌活性的金属离子溶出越多，进而提高了凝胶的抑菌性能。应当理解的是，对本领域普通 技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明 所附权利要求的保护范围。