荧光定量PCR原理--Ct值优秀PPT.ppt
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1、荧光定量荧光定量PCR技术专题技术专题内容概要内容概要1荧光定量荧光定量PCR的原理的原理1荧光定量荧光定量PCR的标记方法的标记方法1荧光定量荧光定量PCR解析方法解析方法1SYBR法试验流程及留意事项法试验流程及留意事项1TIANGEN公司荧光定量产品选择指南公司荧光定量产品选择指南实时定量实时定量PCR技术:技术:利用荧光信号的变更实时检测利用荧光信号的变更实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩扩增反应中每一个循环扩增产物量的变更,通过增产物量的变更,通过Ct值和标准曲线的关系对起始模板进值和标准曲线的关系对起始模板进行定量分析行定量分析与常规与常规PCR技术比较:技术比较:对对PCR扩增
2、反应的终点产物进行定量和定性分析,无法对起始模扩增反应的终点产物进行定量和定性分析,无法对起始模板精确定量,无法对扩增反应实时检测板精确定量,无法对扩增反应实时检测荧光定量荧光定量PCR原理原理定义定义+扩增曲线扩增曲线+荧光阈值荧光阈值+Ct值值荧光定量荧光定量PCR原理原理常用名词概念常用名词概念Cycle(循环数)(循环数)Rn(荧光强度)(荧光强度)BaselineLogliner phaseLogliner phase荧光基团荧光检测元件荧光定量荧光定量PCR原理原理扩增曲线扩增曲线Cycle(循环数)(循环数)Rn(荧光强度)(荧光强度)BaselineLogliner phase
3、Logliner phase1 前15个循环信号作为荧光本底信号(baseline)1 荧光域值的缺省设置是315个循环的荧光信号的标准偏差的10倍1 手动设置:大于荧光背景值和阴性比照的荧光最高值;进入指数期的最初阶段1 真正的信号:荧光信号超过域值Threshold荧光定量荧光定量PCR原理原理荧光域值荧光域值Ct值的定义:值的定义:PCR扩增过程中,扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数Cycle(循环数)(循环数)Rn(荧光强度)(荧光强度)Ct value 荧光定量荧光定量PCR原理原理CtCt值值Cycle numberCk 104Ck 102SampleLog o
4、f DNA concentration0 模板DNA量越多,荧光达到域值的循环数越少,即Ct值越小。0 Log模板起始浓度与Ct值呈线性关系。荧光定量荧光定量PCR原理原理CtCt值与模板起始量的关系值与模板起始量的关系线性关系、扩增效率确认线性关系、扩增效率确认检测灵敏度确认检测灵敏度确认No template controlNo template control确认确认PCRPCR扩增效率(扩增效率(E E)35Cycles35Cycles内可得到好的定量结果内可得到好的定量结果假如接受假如接受SYBRSYBR检测方法,检测方法,30Cycles30Cycles内内无非特异性产物扩增无非特
5、异性产物扩增35 Cycles35 Cycles内无引物二聚体产生内无引物二聚体产生相关系数(相关系数(r r2 2):大于):大于0.980.98荧光定量荧光定量PCR反应性的确认反应性的确认.定性分析探讨:杂合或纯合子鉴定,(SNPs)分析等.确定定量探讨:病毒和病原菌定量分析,基因拷贝数定量,GMO定量检测等.相对定量探讨:mRNA表达量分析,siRNA效果确认,基因芯片结果验证,差异显示结果验证等荧光定量荧光定量PCR技术的应用技术的应用内容概要内容概要1荧光定量荧光定量PCR的原理的原理1荧光定量荧光定量PCR的标记方法的标记方法1荧光定量荧光定量PCR的解析方法的解析方法1SYBR
6、法试验流程及留意事项法试验流程及留意事项1TIANGEN公司荧光定量产品选择指公司荧光定量产品选择指南南非特异性荧光标记非特异性荧光标记 SYBR Green I特异性荧光标记特异性荧光标记 TaqMan Probe常用荧光标记方法常用荧光标记方法SYBRGreenI染料法染料法原理原理 SYBR Green I是一种结合于全部dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料。SYBR Green ISYBR Green ISYBR Green ISYBR Green I热热热热 变变变变 性性性性引物退火引物退火引物退火引物退火延长反应延长反应延长反应延长反应SYBRGreenI染料法染料法
7、作用机理作用机理问题点:问题点:SYBRGreenI与双链与双链DNA进行结合后散发荧光,因此如进行结合后散发荧光,因此如果反应体系中有非特异性扩增或引物二聚体的产生,也将果反应体系中有非特异性扩增或引物二聚体的产生,也将同时被检测,从而可能导致检测结果不精确。同时被检测,从而可能导致检测结果不精确。SYBRGreenI染料法染料法问题点与关键点问题点与关键点关键点:关键点:设计合适引物,防止非特异性扩增!设计合适引物,防止非特异性扩增!将温度与荧光强度的变更求导将温度与荧光强度的变更求导将温度与荧光强度的变更求导将温度与荧光强度的变更求导(-dI/dT)(-dI/dT)原始图谱原始图谱对数图
8、谱对数图谱SYBRGreenI染料法染料法融解曲线融解曲线融解曲线分析,单一峰融解曲线分析,单一峰无非特异性荧光无非特异性荧光定量准确定量准确融解曲线分析,出现杂峰融解曲线分析,出现杂峰其他产物出现非特异性荧其他产物出现非特异性荧光,因此定量不准确光,因此定量不准确SYBRGreenI染料法染料法融解曲线融解曲线%对对DNA模板没有选择性模板没有选择性%适用于任何适用于任何DNA%运用便利,不必设计困难运用便利,不必设计困难%探针探针%具有价格优势具有价格优势优优点点%简洁与非特异性双链简洁与非特异性双链DNA结合,结合,产生假阳性产生假阳性但可以通过融解曲线但可以通过融解曲线的分析,优化反应
9、条件的分析,优化反应条件%对引物特异性要求较高对引物特异性要求较高%不能进行多重定量不能进行多重定量缺缺 点点SYBRGreenI染料法染料法优缺点优缺点Taqman探针法探针法原理原理+5端标记有报告基团(Reporter,R),如FAM、VIC等+3端标记有荧光淬灭基团(Quencher,Q)+探针完整,R放射的荧光能量被Q基团吸取,无荧光,R与Q分开,发荧光+Taq酶有 53外切核酸酶活性,可水解探针Taqman探针法探针法工作机理工作机理热变性热变性热变性热变性引物和探针与模板退火引物和探针与模板退火引物和探针与模板退火引物和探针与模板退火延伸反应延伸反应延伸反应延伸反应探针探针探针探
10、针报告基团报告基团报告基团报告基团淬灭基团淬灭基团淬灭基团淬灭基团探针探针探针探针DNADNADNADNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶引物引物引物引物R RR RR RR R1、引物、探针的设计:、引物、探针的设计:探针Tm为68-70,30 bp,5不能有G,G可能会淬灭荧光素,引物尽量靠近探针,扩增片段400 bp,引物Tm为59-60 2、反应参数的确定:、反应参数的确定:一般为:94,10-20S 60,30-60S(Taq酶53外切核酸酶活性在60 最高),也可通过温度梯度优化退火温度 3、优化引物和探针浓度:获得最小、优化引物和探针浓度:获得最小Ct值,最大信号值,最大信号/背景比值背
11、景比值 引物浓度:50-900nM 探针浓度:50-250nM4、其他与常规、其他与常规PCR相同相同Taqman探针法探针法PCR体系的建立体系的建立3 3 3 3 淬灭基淬灭基淬灭基淬灭基团团团团淬灭基团性质淬灭基团性质淬灭基团性质淬灭基团性质建议使用的建议使用的建议使用的建议使用的5 5 5 5 报告基团报告基团报告基团报告基团TAMRATAMRATAMRATAMRA荧光物质荧光物质荧光物质荧光物质FAM,HEX,TET,JOEFAM,HEX,TET,JOEFAM,HEX,TET,JOEFAM,HEX,TET,JOE等等等等EclipseEclipseEclipseEclipse非荧光物
12、质非荧光物质非荧光物质非荧光物质FAM,HEX,TET,FAM,HEX,TET,FAM,HEX,TET,FAM,HEX,TET,JOE,TAMRA,ROXJOE,TAMRA,ROXJOE,TAMRA,ROXJOE,TAMRA,ROX等等等等Taqman探针法探针法荧光标记物的选择荧光标记物的选择%高度特异性高度特异性%重复性好重复性好%可进行多重定量可进行多重定量优优 点点%只适合一个特定的目标只适合一个特定的目标%托付公司标记,价格较高托付公司标记,价格较高%不易找到本底低的探针不易找到本底低的探针缺缺 点点Taqman探针法探针法优缺点优缺点不同定量方法的比较不同定量方法的比较方法方法优点
13、优点缺点缺点适用范围适用范围SYBR Green I SYBR Green I 方法方法适用性广适用性广灵敏灵敏方便方便便宜便宜引物要求高引物要求高易出现非特异性带易出现非特异性带不能进行多重定量不能进行多重定量适合科研中对各种目的适合科研中对各种目的基因定量分析,基因表基因定量分析,基因表达量的研究,转基因重达量的研究,转基因重组动植物的研究组动植物的研究TaqMan TaqMan 方法方法特异性高特异性高重复性好重复性好多重定量多重定量价格高价格高只适合特定目标只适合特定目标病原体检测,疾病耐药病原体检测,疾病耐药基因研究基因研究,药物疗效考核药物疗效考核遗传疾病的诊断遗传疾病的诊断内容概
14、要内容概要1荧光定量荧光定量PCR原理原理1荧光定量荧光定量PCR的标记方法的标记方法1荧光定量荧光定量PCR的解析方法的解析方法1SYBR法试验流程及留意事项法试验流程及留意事项1TIANGEN公司荧光定量产品选择指公司荧光定量产品选择指南南确定定量解析方法确定定量解析方法Sample25确定定量的定义确定定量的定义0 Log(起始浓度)与循环数呈线性关系,通过已知起始拷贝数的标准品 可作出标准曲线,即得到该扩增反应存在的线性关系0 依据样品Ct值,就可以计算出样品中所含的模板量质粒标准品的制备质粒标准品的制备PCRPCR目的基因克隆目的基因克隆质粒提取,质粒提取,质粒提取,质粒提取,ODO
15、DODOD值定量,将质粒梯度稀释作为标准品运用值定量,将质粒梯度稀释作为标准品运用值定量,将质粒梯度稀释作为标准品运用值定量,将质粒梯度稀释作为标准品运用目的基因目的基因目的基因目的基因目的基因目的基因目的基因目的基因目的基因目的基因目的基因目的基因质粒质粒目的基因目的基因目的基因目的基因基因组基因组DNADNA拷贝数的计算:拷贝数的计算:待测样本浓度(ng/ul)OD26040稀释倍数样本分子量=碱基数324待测样本拷贝数(copies/ul)=待测样本浓度/样本分子量61014倍比梯度稀释方法:倍比梯度稀释方法:1v原液(标准品i)+9v稀释缓冲液,得标准品ii1v标准品ii+9v稀释缓冲
16、液,得标准品iii1v标准品iii+9v稀释缓冲液,得标准品iv1v标准品iv+9v稀释缓冲液,得标准品v质粒标准品稀释方法与拷贝数计算质粒标准品稀释方法与拷贝数计算 方 法:从血液中提取病毒DNA,以TaqMan探针法进行荧光定量检测 试 剂:TIANGEN公司探针法试剂RealMasterMix(Probe)(书目号:FP203)标准品:质粒标准品浓度为106、105、104、103;2个重复;设阴性空白比照 试验步骤:提取HBV DNA;设计特异引物;设计TaqMan探针并标记探针;荧光定量扩增;结果分析:获得血液样品中HBV DNA的精确copy数。确定定量试验例确定定量试验例乙肝病人
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