蛋白质的分离纯化优秀PPT.ppt

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1、第第9章章酶酶促反促反应动应动力学力学1、酶酶活力与活力与酶酶促反促反应应速度速度酶酶活活力力：在在确确定定条条件件下下，酶酶催催化化某某一一反反应应的的反反应应速度（一般速度（一般测测初速度）。初速度）。酶酶促促反反应应速速度度：单单位位时时间间、单单位位体体积积中中底底物物的削减量或的削减量或产产物的增加量。物的增加量。单单位：位：浓浓度度/单单位位时间时间酶的活力测定与分别纯化酶的活力测定与分别纯化探讨酶促反应速度，以酶促反应的初速度为准(底物消耗5%）。2、酶的活力单位（酶的活力单位（U）国际单位（国际单位（IU单位）单位）：在在最最适适反反应应条条件件下下，每每分分钟钟催催化化1mo

2、l底底物物转转化化为为产物所需的酶量，称一个国际单位（产物所需的酶量，称一个国际单位（IU），），1IU=1mol/min国际单位（国际单位（Katal,Kat单位）单位）：在在最最适适反反应应条条件件下下，每每秒秒钟钟催催化化1mol底底物物转转化化为为产产物所需的酶量，称物所需的酶量，称1Kat单位（单位（1Kat=1mols-1）1Kat=60106IU最适条件：最适温度（最适条件：最适温度（25或或37）,最适最适pH、最、最适缓冲液离子强度、最适底物浓度。适缓冲液离子强度、最适底物浓度。底物浓度底物浓度（1）通常很大，使酶饱和通常很大，使酶饱和（2）底物消耗）底物消耗5%sucros

3、eV零级反应零级反应enzymeV一级反应一级反应淀粉酶两种定义：淀粉酶两种定义：A：1g可溶性可溶性starch，在，在1h内液化所需的内液化所需的enzyme量。量。B：lml2%可溶性可溶性starch，在，在1h内液化所需的内液化所需的enzyme量。量。1g酶酶制制剂剂溶溶于于1000mlH2O，取取0.5ml与与2%的的starch20ml反应，反应，pH6.0，10分钟完全液化，求酶活力。分钟完全液化，求酶活力。A：202%1/0.5100060/10=4800u/克克enzyme制剂制剂B：20/0.5100060/10=240000u/克克enzyme制剂制剂3、酶酶的比活力

4、的比活力Specificactivity每毫克每毫克酶酶蛋白所具有的蛋白所具有的酶酶活力。活力。单单位：位：U/mg蛋白蛋白质质。酶酶的比活力是分析的比活力是分析酶酶的含量与的含量与纯纯度的重要指度的重要指标标。一个一个酶酶的分的分别纯别纯化分化分为为4步。步。步步骤骤1234总总活力（活力（U）6432总总蛋白蛋白质质（mg）201052比活力（比活力（U/mg）6/204/103/52/2酶酶的提的提纯过纯过程中，程中，总总蛋白削减，蛋白削减，总总活力削减，比活力增高。活力削减，比活力增高。酶酶的的纯纯化倍数：化倍数：酶酶的回收率：的回收率：100%酶的分别纯化过程中确定要随时追踪酶的活性

5、酶的分别纯化过程中确定要随时追踪酶的活性酶的分别纯化过程中确定要随时追踪酶的活性酶的分别纯化过程中确定要随时追踪酶的活性4、酶活力的测定方法、酶活力的测定方法P336分光光度法分光光度法荧光法荧光法同位素测定法同位素测定法电化学法电化学法探探讨讨酶酶促促反反应应的的速速度度以以及及影影响响酶酶促促反反应应速速度度的的各各种种因因素素，包包括括底底物物浓浓度度、酶酶浓浓度度、pH、温温度度、激激活剂与抑制剂等。活剂与抑制剂等。一、化学动力学基础一、化学动力学基础酶促反应动力学酶促反应动力学二、底物浓度对酶反应速率的影响二、底物浓度对酶反应速率的影响中间络合物学说中间络合物学说酶酶与与底底物物先先

6、络络合合成成一一个个中中间间产产物物，然然后后中中间间产产物物进一步分解成产物和游离的酶。进一步分解成产物和游离的酶。中中间间产产物物假假说说证证据据：P356竞争性抑制试验竞争性抑制试验底物爱护酶不变性底物爱护酶不变性结结晶晶ES复复合合物物的的获获得。得。酶促反应的动力学方程式酶促反应的动力学方程式酶促反应的动力学方程式酶促反应的动力学方程式米式方程：米式方程：Michaelis和Menten1913年Ks为底物解离常数（底物常数）为底物解离常数（底物常数）修正后的米式方程修正后的米式方程Briggs和和Haldane1925K Km m 即为米氏常数，即为米氏常数，V Vmaxmax为最

7、大反应速度为最大反应速度l当反应速度等于最当反应速度等于最大速度一半时大速度一半时,即即V V =1/2=1/2 V Vmax,max,K Km=m=S S l上式表示上式表示,米氏常米氏常数是反应速度为最数是反应速度为最大值的一半时的底大值的一半时的底物浓度。物浓度。l因此因此,米氏常数的米氏常数的单位为单位为mol/Lmol/L。酶催化的反应中各成份的变更S+EESE+PS:substrateP:productE:enzyme发生在发生在发生在发生在很短的很短的很短的很短的时间内时间内时间内时间内当SKm时当S=Km时由米式方程可知：由米式方程可知：米氏常数米氏常数Km的意义的意义（1）指

8、出了）指出了S与与V的关系的关系（2）指明白）指明白Km的定义的定义（3）Km不是不是ES的解离平衡常数，的解离平衡常数，Km近似地表明近似地表明E与与S的亲和力。的亲和力。Km大表明酶与底物亲和力弱，酶的催化大表明酶与底物亲和力弱，酶的催化活性低，活性低，Km小则表明酶与底物亲和力强，酶的催化活小则表明酶与底物亲和力强，酶的催化活性高。性高。（4）不同的酶具有不同）不同的酶具有不同Km值，它是酶的一个重要的特值，它是酶的一个重要的特征物理常数。征物理常数。（5）Km值只是在固定的底物，确定的温度和值只是在固定的底物，确定的温度和pH条件下，条件下，确定的缓冲体系中测定的，不同条件下具有不同的

9、确定的缓冲体系中测定的，不同条件下具有不同的Km值。值。（6）依据）依据Km可推断酶的自然底物。可推断酶的自然底物。在在确确定定的的酶酶浓浓度度下下，Vmax是是一一个个常常数数，它它只只与与底底物物的种类及反应条件有关。的种类及反应条件有关。Vmax=K3EK3代代表表酶酶被被底底物物饱饱和和时时每每秒秒钟钟每每个个酶酶分分子子转转换换底底物物的的分分子子数数，称称为为转转换换数数（TN，或或催催化化常常数数，Kcat）Kcat值越大，表明酶的催化效率越高。值越大，表明酶的催化效率越高。Vmax与与K3（Kcat）的意义）的意义K Kcatcat/K/Kmmrepresentsactualc

10、atalyticefficiencybecausein vivo SKm时：只有只有Kcat/Km可以客观地比较不同的酶或同一可以客观地比较不同的酶或同一种酶催化不同底物的催化效率种酶催化不同底物的催化效率。K Kmm和和和和V Vmaxmax的求解方法的求解方法的求解方法的求解方法1、Lineweaver-Burk双倒数作图法双倒数作图法1/Vmax1/Km1/S1/V斜率=Km/Vmax选底物浓度应考虑能否得到选底物浓度应考虑能否得到选底物浓度应考虑能否得到选底物浓度应考虑能否得到1/S1/S的常数增量：的常数增量：的常数增量：的常数增量：SS为为为为1.011.01、1.111.11、1

11、.251.25、1.421.42、1.661.66、2.02.0、2.52.5、3.333.33、5.05.0、1010时时时时1/S1/S为为为为0.10.1、0.20.2、0.30.3、0.40.4、0.50.5、0.60.6、0.70.7、0.80.8、0.90.9、1.01.0是常数增量。是常数增量。是常数增量。是常数增量。SS为常数增量为常数增量为常数增量为常数增量1.01.0、2.02.0、3.03.0、4.04.0、5.05.0、1010时，时，时，时，1/S1/S为为为为0.10.1、0.1110.111、0.1250.125、0.50.5、1.01.0，是特别数，是特别数，是

12、特别数，是特别数增量，点多集中在增量，点多集中在增量，点多集中在增量，点多集中在1/v1/v轴旁边。轴旁边。轴旁边。轴旁边。其他作图法其他作图法2、Eadie-HofsteeVV/S作图法P363图图9-113、Hanes-Woolf作图法作图法P363图图9-124、Eisenthal作图法作图法P363图图9-13多底物酶促反应有多底物酶促反应有多底物酶促反应有多底物酶促反应有 三种动力学机理三种动力学机理三种动力学机理三种动力学机理sequentialreactionssequentialreactions（single-displacementsingle-displacementre

13、actions):reactions):Orderedreaction(orderedBiBi)Orderedreaction(orderedBiBi)Randomreactions(randomBiBi)Randomreactions(randomBiBi)PingpongreactionsPingpongreactions（double-double-displacementreactions)displacementreactions)多底物的酶促反应动力学多底物的酶促反应动力学两种不同模式的双底物反应顺次式顺次式(sequential)乒乓式乒乓式(ping-pong)变性作用变性作用

14、(denaturation)：抑制作用抑制作用(inhibiton)：使酶活力下降或丢失：使酶活力下降或丢失但并不引起酶蛋白变性但并不引起酶蛋白变性变性剂没有选择性变性剂没有选择性抑制剂有不同程度的选择性抑制剂有不同程度的选择性三、酶的抑制作用三、酶的抑制作用探讨酶抑制作用及其抑制剂的意义探讨酶抑制作用及其抑制剂的意义在理论上，有助于阐明酶活性中心结构，催化机理，代谢途径以及代谢调整，有助于阐明药物和毒物作用机理；在实践上，可以为治疗人类和畜禽传染病而设计疗效更高的抗菌抗病毒药物；为歼灭农作物病虫害而设计更有效的杀虫剂和杀菌剂；为解除毒物对人畜的中毒而设计快速有效解毒药物。抑制程度的两种表示方

15、法抑制程度的两种表示方法相对活力分数相对活力分数相对活力百分数相对活力百分数a%=V1/V0100(%)2、抑制率、抑制率抑制分数抑制分数抑制百分数抑制百分数i%=(1-a)100(%)1、相对活力、相对活力1、不行逆的抑制作用、不行逆的抑制作用抑制剂与酶活性中心（外）的必需基团共价结合，抑制剂与酶活性中心（外）的必需基团共价结合，使酶的活性下降，无法用透析、超滤等物理方法除使酶的活性下降，无法用透析、超滤等物理方法除去抑制剂而使去抑制剂而使酶复活。酶复活。2、可逆的抑制作用可逆的抑制作用抑制剂与酶蛋白非共价键结合，可以用透折、超滤抑制剂与酶蛋白非共价键结合，可以用透折、超滤等物理方法除去抑制

16、剂而使等物理方法除去抑制剂而使酶复活。酶复活。抑制作用的类型抑制作用的类型竞争性抑制（竞争性抑制（Competitiveinhibition）l抑制剂具有与底物类似的结构，竞争酶的活性抑制剂具有与底物类似的结构，竞争酶的活性中心，并与酶形成可逆的中心，并与酶形成可逆的EI复合物，阻挡底物复合物，阻挡底物与酶结合。与酶结合。l可以通过增加底物浓度而解除此种抑制。可以通过增加底物浓度而解除此种抑制。lP369l丙二酸、戊二酸对琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制丙二酸、戊二酸对琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制竞争性可逆抑制图示竞争性抑制非竞争性抑制非竞争性抑制（noncompetitiveinhibition）l底底

17、物物和和抑抑制制剂剂可可以以同同时时与与酶酶结结合合，但但是是，中中间间的的三三元元复复合合物物ESI不不能能进进一一步步分分解解为为产产物物，因因此，酶的活性降低。此，酶的活性降低。l抑抑制制剂剂与与酶酶活活性性中中心心以以外外的的基基团团结结合合，其其结结构构可能与底物无关。可能与底物无关。l不不能能通通过过增增加加底底物物的的浓浓度度的的方方法法来来消消退退非非竞竞争争性抑制作用性抑制作用l某某些些重重金金属属离离子子对对酶酶的的抑抑制制属属于于非非竞竞争争性性抑抑制制：Cu2+、Hg2+、Pb2+非竞争性可逆抑制图示非竞争性抑制酶酶只只有有在在与与底底物物结结合合后后，才才能能与与抑抑

18、制制剂结合。剂结合。E+SES+IESIP常见于多底物的酶促反应中常见于多底物的酶促反应中反竞争性抑制反竞争性抑制1、通过透析、超滤、凝胶过滤等、通过透析、超滤、凝胶过滤等2、通过、通过V-E速度曲线速度曲线P370图图9-18图图9-193、通过可逆抑制剂的动力学曲线可以区分三、通过可逆抑制剂的动力学曲线可以区分三种可逆抑制作用种可逆抑制作用可逆抑制作用与不行逆抑制作用的鉴别可逆抑制作用与不行逆抑制作用的鉴别可逆抑制作用的动力学可逆抑制作用的动力学竞争性抑制竞争性抑制反竞争性抑制反竞争性抑制非竞争性抑制非竞争性抑制可逆抑制作用的动力学特征可逆抑制作用的动力学特征1 11.竞争性抑制竞争性抑制

19、l加入竞争性加入竞争性抑制剂后，抑制剂后，K Km m 变大，变大，酶促反应速酶促反应速度减小。度减小。无抑制剂无抑制剂竞争性抑制剂竞争性抑制剂1/VmaxVmax不变不变Km变大，而且随变大，而且随I浓度的增大而增大浓度的增大而增大交于y轴竞争性抑制作用小结：竞争性抑制作用小结：竞争性抑制作用小结：竞争性抑制作用小结：（1 1）VmaxVmax不变，不变，不变，不变，KmKm变大。变大。变大。变大。（2 2）抑制程度确定于）抑制程度确定于）抑制程度确定于）抑制程度确定于II、SS、KmKm和和和和KiKiA.A.抑制程度与抑制程度与抑制程度与抑制程度与II成正比，与成正比，与成正比，与成正比

20、，与SS成反比成反比成反比成反比II确定，增加确定，增加确定，增加确定，增加SS，可削减抑制程度。，可削减抑制程度。，可削减抑制程度。，可削减抑制程度。SS确定，增加确定，增加确定，增加确定，增加II，可增加抑制程度。，可增加抑制程度。，可增加抑制程度。，可增加抑制程度。B.B.在在在在确确确确定定定定II和和和和SS下下下下，KiKi越越越越大大大大，抑抑抑抑制制制制作作作作用用用用越越越越小小小小，KmKm值愈大，抑制程度愈大。值愈大，抑制程度愈大。值愈大，抑制程度愈大。值愈大，抑制程度愈大。2.2.非竞争性抑制非竞争性抑制l加入非竞争性加入非竞争性抑制剂后，抑制剂后，K Km m 虽然不

21、变，但虽然不变，但由于由于V Vmaxmax减小，减小，所以酶促反应所以酶促反应速度也下降了。速度也下降了。无抑制剂无抑制剂非竞争性抑制剂非竞争性抑制剂-1/km可逆抑制作用的动力学特征可逆抑制作用的动力学特征2交于x轴Km不变，不变，Vmax降至降至Vmax/（1+I/Ki）非竞争性抑制小结：非竞争性抑制小结：非竞争性抑制小结：非竞争性抑制小结：（1 1）KmKm不变，不变，不变，不变，VmaxVmax降至降至降至降至Vmax/Vmax/（1+I/Ki1+I/Ki）（2 2）抑制程度确定于）抑制程度确定于）抑制程度确定于）抑制程度确定于II和和和和KiKi，与底物的，与底物的，与底物的，与底

22、物的KmKm和和和和SS无关：无关：无关：无关：抑制程度与抑制程度与抑制程度与抑制程度与II成正比成正比成正比成正比 在确定在确定在确定在确定II下，下，下，下，KiKi越大，抑制作用越小越大，抑制作用越小越大，抑制作用越小越大，抑制作用越小Km及及Vmax都变小都变小一组平行直线反竞争性抑制小结：反竞争性抑制小结：反竞争性抑制小结：反竞争性抑制小结：KmKm及及及及VmaxVmax都变小都变小都变小都变小抑制程度确定于抑制程度确定于抑制程度确定于抑制程度确定于KmKm、KiKi、SS、II抑制程度既与抑制程度既与抑制程度既与抑制程度既与II成正比，又与成正比，又与成正比，又与成正比，又与SS

23、成正比成正比成正比成正比在在在在确确确确定定定定的的的的SS、II下下下下，KiKi越越越越大大大大，抑抑抑抑制制制制程程程程度度度度越越越越小小小小；KmKm越大，抑制程度越小。越大，抑制程度越小。越大，抑制程度越小。越大，抑制程度越小。抑制剂对酶活性的影响抑制剂对酶活性的影响l使酶的活性降低或丢失的现象，称为酶的抑制作使酶的活性降低或丢失的现象，称为酶的抑制作用。用。l能够引起酶的抑制作用的化合物则称为抑制剂。能够引起酶的抑制作用的化合物则称为抑制剂。l酶的抑制剂一般具备两个方面的特点：酶的抑制剂一般具备两个方面的特点：la.a.在化学结构上与被抑制的底物分子或底物的过在化学结构上与被抑制

24、的底物分子或底物的过渡状态相像。渡状态相像。lb.b.能够与酶的活性中心以非共价或共价的方式形能够与酶的活性中心以非共价或共价的方式形成比较稳定的复合体或结合物。成比较稳定的复合体或结合物。一些重要的抑制剂一些重要的抑制剂1.不行逆抑制剂：不行逆抑制剂：非专一性不行逆抑制剂非专一性不行逆抑制剂与与酶酶的的活活性性中中心心以以及及活活性性中中心心外外的的某某一一类类或几或几类必需基团反应类必需基团反应、有机磷的酰化物有机磷的酰化物二二异异丙丙基基磷磷酰酰氟氟（DFP，神神经经毒毒气气）和和很很多多有有机机磷磷农农药。药。374结构式：磷酰化剂与结构式：磷酰化剂与DFPP374反反应应式式：磷磷酰

25、酰化化剂剂与与胆胆碱碱酯酯酶酶形形成成磷磷酰酰化化胆胆碱碱酯酯酶酶抑抑制制机机理理：与与蛋蛋白白酶酶及及酯酯酶酶活活性性中中心心Ser的的OH形形成成磷脂键。磷脂键。毒理：猛烈抑制乙酰胆碱脂酶（神经毒剂）。毒理：猛烈抑制乙酰胆碱脂酶（神经毒剂）。解毒剂：解毒剂：PAM（解磷定）可以把酶上的磷酰基团除去。（解磷定）可以把酶上的磷酰基团除去。、有机汞、有机砷化合物、有机汞、有机砷化合物抑制机理抑制机理：使酶的巯基烷化使酶的巯基烷化P375：对氯汞苯甲酸（：对氯汞苯甲酸（PCMB）与巯基酶的反应）与巯基酶的反应毒毒理理：主主要要与与还还原原型型硫硫辛辛酸酸辅辅酶酶反反应应，抑抑制制丙丙酮酮酸酸氧氧化

26、酶系统。化酶系统。解解毒毒剂剂：二二巯巯基基丙丙醇醇（BAL）、Cys、GSH等等过过量量的的巯基化合物。巯基化合物。重金属重金属Ag、Cu、Hg、Cd、Pb能能使使大大多多数数酶酶失失活活，EDTA可解除。可解除。、烷化物、烷化物含含卤卤素素的的烷烷化化物物（碘碘乙乙酸酸、碘碘乙乙酰酰胺胺、卤卤乙乙酰酰苯等）常用于鉴定酶中巯基。苯等）常用于鉴定酶中巯基。氰化物、硫化物、氰化物、硫化物、CO与含铁卟啉的酶中的与含铁卟啉的酶中的Fe2+结合，阻抑细胞呼吸结合，阻抑细胞呼吸、青霉素、青霉素不行逆抑制糖肽转肽酶不行逆抑制糖肽转肽酶专一性不行逆抑制剂专一性不行逆抑制剂专一性不行逆抑制剂专一性不行逆抑制

27、剂此类抑制剂仅仅和某一种酶的活性部位的必需基团此类抑制剂仅仅和某一种酶的活性部位的必需基团此类抑制剂仅仅和某一种酶的活性部位的必需基团此类抑制剂仅仅和某一种酶的活性部位的必需基团反应。反应。反应。反应。KsKs型型型型不不不不行行行行逆逆逆逆抑抑抑抑制制制制剂剂剂剂（亲亲亲亲和和和和标标标标记记记记试试试试剂剂剂剂，亲亲亲亲合合合合修修修修饰饰饰饰试试试试剂）剂）剂）剂）（affinitylabelingreagent)affinitylabelingreagent)具具具具有有有有与与与与底底底底物物物物相相相相像像像像的的的的结结结结构构构构，同同同同时时时时还还还还带带带带有有有有一一一

28、一个个个个能能能能与与与与酶酶酶酶活活活活性中心或性中心或性中心或性中心或活性中心外的必需基团进行化学反应的活泼基团。活性中心外的必需基团进行化学反应的活泼基团。活性中心外的必需基团进行化学反应的活泼基团。活性中心外的必需基团进行化学反应的活泼基团。专专专专一一一一性性性性程程程程度度度度取取取取决决决决于于于于它它它它与与与与活活活活性性性性中中中中心心心心及及及及活活活活性性性性中中中中心心心心外外外外的的的的的的的的KsKs之比之比之比之比P376P376 图图图图9-259-25 胰胰胰胰蛋蛋蛋蛋白白白白酶酶酶酶的的的的底底底底物物物物及及及及其其其其KsKs型型型型不不不不行行行行逆

29、逆逆逆抑抑抑抑制剂制剂制剂制剂一些重要的抑制剂一些重要的抑制剂Kcat型不行逆抑制剂（自杀性底物型不行逆抑制剂（自杀性底物,suicidesubstrate）具有与底物相像的结构，不仅能与酶结合，而且潜具有与底物相像的结构，不仅能与酶结合，而且潜伏的反应基团（伏的反应基团（latentreactivegroup）能被酶催）能被酶催化而活化，并与酶活性中心必需基团进行不行逆结化而活化，并与酶活性中心必需基团进行不行逆结合合P376图图9-26-氯代氯代-D-Ala抑制丙氨酸消旋酶的抑制丙氨酸消旋酶的机制机制2、可逆抑制剂可逆抑制剂竞竞争性抑制争性抑制剂剂（Competitiveinhibitio

30、n）很多代很多代谢类谢类似物都是似物都是竞竞争性抑制争性抑制剂剂，可用作，可用作抗菌抗菌药药和抗癌和抗癌药药物物抗抗癌癌药药:氨氨基基叶叶酸酸、阿阿拉拉伯伯糖糖胞胞苷苷、5-氟氟尿尿嘧啶嘧啶等。等。磺胺类药物及其作用机理磺胺类药物及其作用机理对氨基苯磺酰胺或其衍生物对氨基苯磺酰胺或其衍生物对对氨氨基基苯苯甲甲酸酸的的结结构构类类似似物物，竞竞争争性性抑抑制制细细菌菌的的二二氢氢叶叶酸酸合合成成酶活性酶活性蝶呤对氨基苯甲酸Glu二氢叶酸合成酶二氢叶酸四氢叶酸嘌呤核苷酸二氢叶酸还原酶一碳单位磺胺类药物磺胺类药物的抗菌机理：磺胺类药物的抗菌机理：磺胺类药物的抗菌机理：磺胺类药物的抗菌机理：TMP抑制

31、剂与药物开发抑制剂与药物开发Kcat型不行逆抑制剂的专一性程度很强，前景广袤型不行逆抑制剂的专一性程度很强，前景广袤底物类似物型的竞争性抑制剂最易开发底物类似物型的竞争性抑制剂最易开发过渡态底物类似物型药物最具价值过渡态底物类似物型药物最具价值(高效高效特异特异)探讨抑制剂对酶的作用有重大的意义：探讨抑制剂对酶的作用有重大的意义：（1）药药物物作作用用机机理理和和抑抑制制剂剂型型药药物物的的设设计计与与开开发；发；（2）了了解解生生物物体体的的代代谢谢途途径径，进进行行人人为为调调控控或或代谢限制发酵；代谢限制发酵；（3）通通过过抑抑制制剂剂试试验验探探讨讨酶酶活活性性中中心心的的构构象象及及

32、其其化化学学功功能能基基团团，不不仅仅可可以以设设计计药药物物，而而且且也也是酶工程和化学修饰酶、酶工业的基础。是酶工程和化学修饰酶、酶工业的基础。1 1最适温度及影响因素最适温度及影响因素最适温度及影响因素最适温度及影响因素 提高温度，加快反应速度。提高温度，加快反应速度。提高温度，加快反应速度。提高温度，加快反应速度。提高温度，酶变性失活。提高温度，酶变性失活。提高温度，酶变性失活。提高温度，酶变性失活。温温温温度度度度系系系系数数数数Q10Q10：温温温温度度度度上上上上升升升升1010，反反反反应应应应速速速速度度度度与与与与原原原原来来来来的的的的反反反反应速度之比，大多数酶的应速度

33、之比，大多数酶的应速度之比，大多数酶的应速度之比，大多数酶的Q10Q10一般为一般为一般为一般为1212。温血动物的酶，最适温度温血动物的酶，最适温度温血动物的酶，最适温度温血动物的酶，最适温度35354040，植物酶最适温度植物酶最适温度植物酶最适温度植物酶最适温度40405050，细菌细菌细菌细菌TaqDNATaqDNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶7070。最最最最适适适适温温温温度度度度不不不不是是是是酶酶酶酶的的的的特特特特征征征征常常常常数数数数，它它它它与与与与底底底底物物物物种种种种类类类类、作作作作用用用用时时时时间、间、间、间、pHpH、离子强度、离子强度、离子强度、离子强度 等

34、因素有关。等因素有关。等因素有关。等因素有关。四、四、温度对酶反应的影响温度对酶反应的影响2 2、酶的稳定性温度、酶的稳定性温度、酶的稳定性温度、酶的稳定性温度在在在在某某某某一一一一时时时时间间间间范范范范围围围围内内内内，酶酶酶酶活活活活性性性性不不不不降降降降低低低低的的的的最最最最高高高高温温温温度度度度称称称称该酶的稳定性温度。该酶的稳定性温度。该酶的稳定性温度。该酶的稳定性温度。酶酶酶酶浓浓浓浓度度度度高高高高、不不不不纯纯纯纯、有有有有底底底底物物物物、抑抑抑抑制制制制剂剂剂剂和和和和爱爱爱爱护护护护剂剂剂剂会会会会使使使使稳定性温度增高。稳定性温度增高。稳定性温度增高。稳定性温

35、度增高。酶的保存：酶的保存：酶的保存：酶的保存：液液液液体体体体酶酶酶酶制制制制剂剂剂剂可可可可以以以以利利利利用用用用上上上上述述述述5 5种种种种因因因因素素素素中中中中的的的的几几几几种种种种，低温短暂保存。低温短暂保存。低温短暂保存。低温短暂保存。冻干粉可在在低温冰箱中较长期保存。冻干粉可在在低温冰箱中较长期保存。冻干粉可在在低温冰箱中较长期保存。冻干粉可在在低温冰箱中较长期保存。1.pH1.pH影响酶活力的因素影响酶活力的因素影响酶活力的因素影响酶活力的因素影响酶蛋白构象，过酸或过碱会使酶变性。影响酶蛋白构象，过酸或过碱会使酶变性。影影响响酶酶和和底底物物分分子子解解离离状状态态，尤

36、尤其其是是酶酶活活性性中中心心的的解离状态，最终影响解离状态，最终影响ES形成。形成。影影响响酶酶和和底底物物分分子子中中另另外外一一些些基基团团解解离离，这这些些基基团的离子化状态影响酶的专一性及活性中心构象。团的离子化状态影响酶的专一性及活性中心构象。五、五、pH对酶促反应速度的影响对酶促反应速度的影响2酶的最适酶的最适pH和稳定性和稳定性pH最适最适pH：使酶促反应速度达到最大时的介质：使酶促反应速度达到最大时的介质pH。最适最适pH与底物种类、浓度及缓冲液成分有关。与底物种类、浓度及缓冲液成分有关。几种酶的最适几种酶的最适pH，见，见P379表表9-7。虽虽然然大大部部分分酶酶的的pH

37、酶酶活活曲曲线线是是钟钟形形，但但也也有有半半钟形甚至直线形。钟形甚至直线形。1 1、无机离子的激活作用无机离子的激活作用无机离子的激活作用无机离子的激活作用（1 1）金金金金属属属属离离离离子子子子：K+K+、Na+Na+、Mg2+Mg2+、Zn2+Zn2+、FeFe2+2+、Ca2+Ca2+（2 2）阴离子：）阴离子：）阴离子：）阴离子：Cl-Cl-、Br-Br-、PO43-PO43-（3 3）氢氢氢氢离子离子离子离子 不同的离子激活不同的不同的离子激活不同的不同的离子激活不同的不同的离子激活不同的酶酶酶酶。不不不不同同同同离离离离子子子子之之之之间间间间有有有有拮拮拮拮抗抗抗抗作作作作用

38、用用用和和和和可可可可替替替替代代代代作作作作用用用用，如如如如Na+Na+与与与与K+K+、Mg2+Mg2+与与与与 Ca2+Ca2+之之之之 间间间间 常常常常 常常常常 拮拮拮拮 抗抗抗抗，但但但但 Mg2+Mg2+与与与与Mn2+Mn2+常可替代。常可替代。常可替代。常可替代。激激激激活活活活剂剂剂剂的的的的浓浓浓浓度度度度要要要要适适适适中中中中，过过过过高高高高往往往往往往往往有有有有抑抑抑抑制制制制作作作作用用用用，150mM150mM六、六、激活剂对酶反应的影响激活剂对酶反应的影响2 2、简洁简洁简洁简洁有机分子的激活作用有机分子的激活作用有机分子的激活作用有机分子的激活作用还还还还原原原原剂剂剂剂（如如如如CysCys、还还还还原原原原型型型型谷谷谷谷胱胱胱胱甘甘甘甘肽肽肽肽）能能能能激激激激活活活活某某某某些活性中心含有些活性中心含有些活性中心含有些活性中心含有SHSH的的的的酶酶酶酶。金金金金属属属属螯螯螯螯合合合合剂剂剂剂（EDTAEDTA）能能能能去去去去除除除除酶酶酶酶中中中中重重重重金金金金属属属属离离离离子子子子，解除抑制作用。解除抑制作用。解除抑制作用。解除抑制作用。3 3、蛋白、蛋白、蛋白、蛋白酶酶酶酶对对对对酶酶酶酶原的激活原的激活原的激活原的激活