输血相关传染病的检测技术概述课件优秀PPT.ppt

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1、输血相关传染病检测技术概 述甘肃省平凉市中心血站试验室 吴 宏 涛输血相关传染病种类病毒性肝炎 乙、丙、丁、庚型肝炎艾滋病梅毒巨细胞病毒EBV感染HTLV感染（美国、欧盟及我国的厦门血站开展）疟疾弓形体病等输血相关传染病检测方法酶联免疫吸附试验ELISA*免疫荧光法IFA放射免疫法RIA免疫印迹法WB*重组免疫印迹法RIBA颗粒凝集试验PA病毒检测VT病毒核酸检测NAT*酶联免疫吸附试验ELISA建于1971年。开创了运用酶标记免疫技术进行液体标本中微量物质的测定，是检验医学的里程碑式的发展。特点：敏感性高，特异性强，操作简便，即可测定抗原，也可测定抗体。类型：间接法，干脆法，双抗体夹心法，竞

2、争抑制法或竞争法。免疫荧光法IFA荧光抗体技术荧光抗原技术原理：以特异抗原抗体反应为基础，利用荧光素作为标记物标记已知抗原（或抗体），在确定条件下与被测标本中相应的抗体（或抗原）结合，形成抗原抗体复合物，此时荧光素起示踪物作用。再通过有紫外光源的荧光显微镜就可以分辨出特异性抗原抗体复合物的存在。放射免疫法RIA一种用放射性同位素为标记物的免疫学测定方法，具有很高的敏感性与特异性。其原理与ELISA大致相同，所不同的是用放射性同位素为标记物而不是用酶为标记物。免疫印迹试验WB又名蛋白印迹试验，其原理是在病毒裂解后将不同分子量的病毒蛋白经十二烷基硫酸钠（SDS）聚丙烯胺凝胶电泳（PAGE）分别后，

3、经过电转移将凝胶上的蛋白条带转移到位硝酸纤维素膜上，以此作为抗原进行病毒特异性抗体检测。重组免疫印迹试验RIBA原理：应用重组蛋白或合成肽（而不是干脆应用病毒裂解的蛋白）以条带形式吸附在硝酸纤维素膜条上，当条上加入被测血清标本温育后，假如标本中含有特异性抗体时，则和相应抗原带结合形成抗原抗体复合物。通过洗涤，去掉未结合的血清，然后加入酶标IgG二抗，再温育，则酶结合物就结合到抗原抗体复合物上，再洗涤，加入底物。颗粒凝集试验PA是一种简便快速的筛检试验，其原理为病毒裂解物或重组抗原包被于颗粒载体（红细胞，乳胶颗粒，明胶颗粒），使之成为致敏颗粒，再加入血清标本，如被测血清中含有特异性抗体，则因抗体

4、与抗原间桥联作用，使致敏颗粒发生凝集。病毒检测VT可通过病毒的分别和培育后进行。培育可通过动物培育，鸡胚培育和细胞培育进行，其中以细胞培育方法最敏感、经济和最有前途。病毒感染细胞后，多数病毒能引起病变，可干脆镜检视察，或通过血清学检查作出鉴定。病毒的核酸检测NAT病毒核酸分子杂交聚合酶链反应PCR乙型肝炎的检测技术1 乙肝病毒的生物学性状形态与结构基因结构与复制方式抗原组成动物模型与细胞培育反抗力1.1 HBV形态与结构HBV结构为双层球形，直径42nm，具有双层衣壳。1.2 HBV基因结构与复制方式HBV的DNA基因较小，仅含约3200个核苷酸，负股DNA核苷酸序列含有4个开放读码框架（OP

5、R）分别称为S、C、P和X区。基因及其编码的抗原：S区基因区基因 C区基因区基因 P区基因区基因 X区基因区基因 S基因HBsAg C基因 HBcAg 前S1 Pre-S1 前C基因 HBeAg DNA多聚酶 HBXAg前S2基因Pre-S21.3 HBV抗原的组成表面抗原HBsAg三种形态 小球型颗粒、管形颗粒、Dane颗粒亚型 各亚型均有共同抗原确定簇，称为a抗原，此外还有2组相互排斥的亚型抗原确定簇（d/y和w/r）。按不同的组合方式构成HBsAg四个基本亚型，即adr,adw,adr,ayw。亚型的分布有明显的地区差异和种族相关性，汉族以adr，少数民族为ayw，欧美以adw占优势，a

6、yw主要分布在北非和西非。乙肝ELISA诊断试剂的标准要求adr,adw,ayw三个亚型的最小检出量为0.5ng/L。核心抗原HBcAg为内衣壳部分，不易在血循环中检测，抗原性强。e抗原HBeAg病毒复制和具有强感染性的指标。1.4 HBV动物模型与细胞培育黑猩猩是对HBV最敏感的动物。目前接受的细胞培育系统是病毒DNA传染系统。将病毒DNA导入肝癌等细胞后，病毒可整合并复制，在细胞中表达HBV抗原。1.5 HBV反抗力HBV 的反抗力较强，在30-32可存活6个月，在-20可存活15年，对低温、干燥、紫外线均有耐受。不能被70%乙醇灭活，因此不能用这一常规方法来消毒。但6510 小时、煮沸1

7、0 分钟 或高压蒸气均可灭活HBV。含氯制剂、环氧乙烷、戊二醛、0.5%过氧乙酸和碘伏等也有较好的灭活效果。消毒可以使HBV失去传染性，但是HBsAg的抗原性仍可保留。1.6 HBV markers during early infectionInfectionDay 0HBV DNAVariable,up to 31 days prior to HBsAg by ID NAT(9-11 days by MP NAT)HBsAgDay 59;disappears Day 120Infection1200102030405060708090100110InfectionDay 0HBV DNAV

8、ariable,up to 31 days prior to HBsAg by ID NAT(9-11 days by MP NAT)HBsAgDay 59;disappears Day 120HBVHBVDNADNAAnti-HBcAnti-HBcInfectionHBsAgHBsAgALT2 乙型肝炎病原体检测病毒干脆标记物病毒抗原：HBsAg、HBeAg、Pre-S1、Pre-S2病毒核酸：HBV DNA间接性标记物抗病毒抗体：HBsAb、HBeAb、HBcAb2.1乙肝抗原抗体的检测及结果分析HBsAg 阳性表示HBV 感染;抗-HBs 为爱护性抗体;HBeAg阳性可作为HBV 复制和

9、传染性高的指标;抗-HBe 阳性表示HBV 复制水平低(但有前C 区突变者例外);抗-HBc 总抗体主要是抗-HBc IgG,只要感染过HBV,无论病毒是否被清除,此抗体均为阳性;抗-HBc IgM 阳性提示HBV 复制,多见于乙型肝炎急性期。近些年有很多试验室开展了乙肝前S1 抗原检测,前S1 抗原在病毒感染、装配、复制和刺激机体产生免疫反应等方面起着特别重要的作用,被认为是比HBeAg 更敏感的病毒复制标记,尤其适合无条件开展HBV DNA 检测的医疗单位。微粒子酶免分析法(MEIA)及化学发光法虽然灵敏度更高,但由于价格昂贵并未能广泛开展。HBV 血清学标记物检测技术的发展趋势是从定性检

10、测转变为定量分析。HBV 血清学标记传统上包括HBsAg、抗-HBs、HBeAg、抗-HBe、抗-HBc 和抗-HBc Ig M。2.2 HBV DNA 2.2 HBV DNA 及其基因型、变异和及其基因型、变异和及其基因型、变异和及其基因型、变异和cccDNA cccDNA 的检测的检测的检测的检测1 1HBV DNA 检测检测HBV DNA 定性和定量检测反映了病毒复制状况或水平定性和定量检测反映了病毒复制状况或水平,主要用于慢性主要用于慢性HBV 感染的诊断、血清感染的诊断、血清HBV DNA 水平的监测水平的监测,以及评价抗病毒疗效以及评价抗病毒疗效,多运用各多运用各种种PCR 技术。

11、技术。基因型和变异的检测基因型和变异的检测HBV 病毒可分为病毒可分为8 型型,分别为分别为A、B、C、D、E、F、G、H。HBV 基因分基因分型常用的方法有型常用的方法有:多重多重PCR 法法;限制性片段长度多态性分析法限制性片段长度多态性分析法;线性探针反线性探针反向杂交法向杂交法;全基因序列测定法等。全基因序列测序分型的结果精确性高全基因序列测定法等。全基因序列测序分型的结果精确性高,尤尤其是能发觉两种不同基因型的重组体感染其是能发觉两种不同基因型的重组体感染,被公认为被公认为HBV 基因分型的金标基因分型的金标准准,但比较昂贵繁琐但比较昂贵繁琐,不适合常规应用。不适合常规应用。目前的研

12、发趋势是针对有重要临床意义的目前的研发趋势是针对有重要临床意义的HBV 变异进行快速、定量的多变异进行快速、定量的多位点联合检测。位点联合检测。2.2 HBV DNA 2.2 HBV DNA 及其基因型、变异和及其基因型、变异和及其基因型、变异和及其基因型、变异和cccDNA cccDNA 的检测的检测的检测的检测2 2cccDNA（共价闭合（共价闭合DNAcovalent closed circular）的检的检测测cccDNA 是是HBV 的原始复制模板的原始复制模板,对乙肝病毒的复制及感对乙肝病毒的复制及感染状态的建立具有特别重要的意义。染状态的建立具有特别重要的意义。Southern

13、blot 是检测是检测HBV cccDNA 的经典方法的经典方法,但是该方法过程比较困难但是该方法过程比较困难,而且灵而且灵敏度不高。实时荧光定量敏度不高。实时荧光定量PCR 不需对不需对PCR 反应产物进行开盖反应产物进行开盖检测检测,从而削减了从而削减了PCR 产物污染的可能产物污染的可能,可对可对cccDNA 进行定进行定量分析量分析,多被试验室接受。多被试验室接受。2.3 乙肝病毒微生物学检查法HBV感染宿主的免疫学监测感染宿主的免疫学监测HBV 感染的病程很大程度上取决于宿主的免疫机感染的病程很大程度上取决于宿主的免疫机能能,不同病程时期的机体免疫特点、体内病毒水平不同病程时期的机体

14、免疫特点、体内病毒水平和肝脏损伤程度均不相同和肝脏损伤程度均不相同,临床免疫学检测对临床免疫学检测对HBV 感染的各病程阶段的免疫状态推断、指导治疗和感染的各病程阶段的免疫状态推断、指导治疗和评价疗效等方面都有重要的意义。评价疗效等方面都有重要的意义。流式细胞仪可以同时精确检测几种流式细胞仪可以同时精确检测几种T淋巴细胞亚群淋巴细胞亚群的数量的数量,监控病人的免疫状态监控病人的免疫状态,被试验室广泛应用。被试验室广泛应用。3 乙肝诊断试剂的研制进展抗-HBs诊断血清血凝试验 反向被动血凝试验 RPHA 被动血凝试验PHA放射免疫试验RIA酶联免疫测定法（ELISA）试剂DNA聚合酶链反应PCR

15、HBsAg全血金标检测试纸条4 检测乙肝时常见问题1阳性漏检的问题一步法试剂的钩端效应，后带现象。试剂的标准中对一步法试剂有3份1：64效价的HBsAg阳性血清，检测结果要求为阳性。灵敏度：灵敏度对于早期检出有利。窗口期：美国探讨表明90%的HBsAg漏检是因为窗口期。国内探讨表明30%40%是因为窗口期。亚型问题ad型检出率要高于ay型变异HBsAg变异类型有很多，5070变异 株与抗野生株单抗的免疫反应减弱或消逝。有部分变异株与野生株在立体构型和抗原反应性上有明显的差异,因此防治困难。4 检测乙肝时常见问题2乙肝假阳性问题类风湿因子RF与抗体结合，造成ELISA和金标法的假阳性。补体与Ig

16、G的Fc段结合，造成ELISA和金标法的假阳性。纤维蛋白原与酶结合物粘附于微板上洗不掉，造成ELISA假阳性。稀释液推动剂，金标法中应先加样品，后加释释剂，否则易出现假阴性。丙型肝炎的检测技术1 丙肝病毒的生物学性状形态与结构基因结构与功能丙肝病毒抗体的特点与临床意义丙肝病毒感染后ALT特点与意义丙肝病毒的生物学检测丙肝病毒简介1974年Golafield首先报告输血后非甲非乙型肝炎。1989年Choc等应用分子克隆技术获得本病毒基因克隆，并命名本病及其病毒为丙型肝炎（HepatitisC）和丙型肝炎病毒（HCV）。由于HCV基因组在结构和表型特征上与人黄病毒和瘟病毒相类似，1991年，国际病

17、毒命名委员会(ICTV)将其归为黄病毒科丙型肝炎病毒属。1.1 形态与结构HCV病毒体呈球形，直径小于80nm（在肝细胞中为36-40nm，在血液中为36-62nm），为单股正链RNA病毒，在核衣壳外包绕含脂质的囊膜，囊膜上有剌突。HCV体外培育尚未找到敏感有效的细胞培育系统，但黑猩猩对HCV很敏感。1.2 HCV基因结构与功能丙型肝炎病毒是单股正链RNA病毒其基因组含有一个大约9033个核苷酸构成的大开放读码框(0RF)，可编码30103033个氨基酸的多蛋白前体，多蛋白N端的14依次为核心蛋白(c)和包膜蛋白(El和E2)等结构蛋白，其余依次为NS2、NS3、NS4和NS 5等非结构蛋白，

18、膜蛋白分布于病毒表面，NS3蛋白具有蛋白酶的功能，NS5蛋白为一依靠于RNA的RNA多聚酶1.3 HCV抗体的特点与临床意义1 抗核心区抗体抗-C22-3核心区抗体，核心区基因保守性强，其抗体出现较早（感染后8-10周），持续时间长，与HCV RNA高度相关，其血液有较大的传染性。抗-HCe被膜区抗体，被膜区基因（E1，E2/NS1）变异程度高，其抗体可用于血清学分型，用于感染的流行病学探讨。1.3HCV抗体的特点与临床意义2 抗非结构区抗体抗-C33C 编码C33C多肽的基因位于NS3中区，与HCV的复制有关，用于HCV感染检测，抗-C33C 与抗-C22-3同时或稍早出现，两者对HCV感染

19、具有互补作用，但不能相互替代。抗-C100-3 C100-3多肽编码基因位于NS4区，从感染后4-32周出现，最长可达1年以上，对感染早期诊断意义不大，在鉴别急性、慢性感染和推断上有确定价值。但假阳性比例较高，血清中类风湿因子，过氧化物歧化酶、球蛋白、自身抗体等与多肽呈低亲和结合；标本放置过长或反复冻融也可出现假阳性。抗-NS5 抗-NS5 持续阳性者，ALT多明显上升，而持续阴性者，ALT多正常或轻度上升，与疾病活动相关。IgM抗体 先于IgG抗体出现，对感染早期诊断及急、慢性感染具有重要意义。HCV感染后标记物出现的次序：HCV RNA（2周）ALT（4周）抗体-NS5（6周）抗-C22-

20、3（7周）抗-C33C（8周）抗-C100-3（9周）1.4丙肝感染后标记物的产生2 丙肝病毒微生物学检查法酶联免疫吸附试验ELISA放射免疫测定法RIA重组免疫印迹试验（确认试验）血清HCV RNA检测双抗体夹心法测HCV病毒抗原2.1丙肝抗体ELISA检测第一代抗第一代抗-HCV试剂盒试剂盒 接受的抗原接受的抗原C100-3 是是HCV非结非结构基因构基因(NS3NS4)和人超氧化物歧化酶基因嵌合后表达的和人超氧化物歧化酶基因嵌合后表达的融合蛋白，灵敏度低，漏检率较高；融合蛋白，灵敏度低，漏检率较高；其次代抗其次代抗-HCV试剂盒试剂盒 在第一代基础上增加了核心区重在第一代基础上增加了核心

21、区重组蛋白组蛋白C22-3和和NS3区重组蛋白区重组蛋白-C33C，虽然在灵敏度和特，虽然在灵敏度和特异忡上有很大改善，但仍不能解除由于重组融合蛋白带来异忡上有很大改善，但仍不能解除由于重组融合蛋白带来的少数假阳性和极少数的漏检的少数假阳性和极少数的漏检。第三代抗第三代抗-HCV试剂盒试剂盒 其包被抗原为其包被抗原为HCV核心抗原、核心抗原、NS3、NS4和和NS5抗原，特异性超过抗原，特异性超过99，虽然目前缺乏，虽然目前缺乏推断其敏感性的金标准，但对于免疫功能正常的推断其敏感性的金标准，但对于免疫功能正常的HCV RNA阳性感染者，阳性感染者，抗一抗一HCV检出率也高于检出率也高于99。2

22、.2丙肝病毒核酸RNA的检测HCV RNA检测包括定性和定量两种，定性PCR的灵敏度高于定量PCR，因此定性PCR主要用于急慢性丙型肝炎诊断，而定量PCR则用于疗效监测但该方法在技术和设备上要求较高，且费时，检出率较低，主要缘由是：HCV在血液和肝组织中的感染滴度很低，且有确定波动：HCV RNA易被血细胞中的RNA酶降解，因此假如被检标本保存不当(例如反复冻融)将影响检测结果：HCV RNA还受进食的影响，易与血中脂质及脂蛋白结合，降低检出率：另外，RT-PCR的多步骤试验中任何步骤的问题均易影响其检出该方法也简洁因污染而出现假阳性。为了使HCV RNA的规范化检测：对患者在空腹条件下抽血，

23、及早分别血清和进行检测，避开对标本反复冻融，PCR的整个过程应避开RNA酶及DNA酶对标本的降解和对模板的污染。2.3丙肝病毒核心抗原的检测HCV核心抗原的检出比抗一HCV的检出约早49 d，用双抗体夹心法定性或定量检测血清样品中总的或游离的HCV核心抗原，方法简洁、时间短、对环境要求低以及假阳性率低的特点。用途：可用于HCV血清学转换前的早期急性丙型肝炎诊断、抗一HCV阳性感染者的病毒血症分析以及HCV感染者治疗前后病毒血症追踪分析等。局限性：由于方法敏感性的限制，HCV RNA水平低于20 000 kTUL时不适用。3检测丙肝时常见问题假阳性比较高HCV基因组的变异较大血清中抗-HCV出现

24、较晚不同厂家的试剂对同一标本检验结果存在差异梅毒螺旋体的检测技术1 梅毒螺旋体的生物学性状形态结构与染色培育特性反抗力梅毒螺旋体抗体抗TP抗体抗心磷脂抗体，称反应素基本概念1.病原性螺旋体（Spirochetes）：是一群瘦长而松软、波状或螺旋状，运动活泼的原核细胞微生物。主要有钩端螺旋体，梅毒螺旋体，雅司螺旋体和回来热螺旋体等。2.梅毒螺旋体（Treponema pallidum）学名苍白密螺旋体，梅毒病原体，对人有致病性的密螺旋体中最重要的一种。1.2 TP形态结构与染色TP直径0.1-0.2微米，长6-15微米，有8-14年致密而规则的螺旋，两端尖直，运动活泼。电镜下菌体内为轴丝，最外层

25、为外膜，其内为胞质膜，二者之间为鞭毛样结构。菌体有蛋白质、类脂及糖类，外膜蛋白质中P47和轴丝P37抗原具有高度免疫原性，在免疫学诊断和预防中可能起重要作用。TP用一般染料不易着色；病灶取材干脆检查，可用不染色簇新标本在暗视野显微镜下视察形态和运动方式。1.3TP培育特性人工体外培育尚未成功。毒力株螺旋体能在家兔部分组织中繁殖，并保持其对人及家兔的致病力，但因其分裂繁殖缓慢，30-33小时才能分裂1次。1.4TP反抗力 梅毒螺旋体反抗力极弱，对温度和干燥特殊敏感，离体后干燥1-2小时；血液中4放置3天；加热50 5分钟即灭活；对化学消毒剂亦敏感，对青霉素、四环素、红霉素或砷剂敏感。1.5梅毒螺

26、旋体抗体1、抗TP抗体（P15，P17，P47）当补体存在时，可将螺旋体杀死或溶解，也对吞噬细胞发挥调理作用。在梅毒潜藏期即产生，一期梅毒时增高，主要是IgM型，二期梅毒时达到高峰，有IgG和IgM型，三期梅毒略降低，主要是IgG型，但不是爱护性抗体，晚期梅毒或治疗后仍保持阳性。2、抗心磷脂抗体，称反应素reagin。同生物组织中的脂质发生反应，反应素无爱护作用，仅可用作梅毒血清学诊断。一期梅毒时增高，二期梅毒时达到高峰，三期梅毒略降低。1.6TP抗原 主要为外膜蛋白抗原：p47、p45、p17、p15。p47具有强免疫原性，是梅毒螺旋体的主要优势抗原，与另外两种密螺旋体有交叉反应。p17也具

27、有梅毒螺旋体抗原特异性，与人类正常血成分无交叉反应。2梅毒螺旋体检查法梅毒螺旋体显微镜检查（干脆查病原体）主要梅毒血清学检查非密螺旋体抗原试验快速反应素试验RPR甲苯胺红不加热血清试验TRUST不加热血清反应素玻片试验USR密螺旋体抗原试验酶联免疫吸附试验ELISA梅毒螺旋体血凝集试验TPHA荧光密螺旋体抗体吸取试验FTA-ABS金标快速试纸条法2.1梅毒螺旋体检测方法的评价RPR：用于普查，适用于一、二期梅毒反应素检测，有假阳性。FTA-ABS适用于诊断各期梅毒，敏感性和特异性都很高，狼疮病有假阳性反应。TPHA：敏感性和FTA-ABS相像，但特异性更高。不用于一期诊断，结缔组织病、麻风等可

28、出现假阳性。WB：能检出其四种特异性抗体，作为确认试剂有较强的牢靠性；ELISA：灵敏度和特异性好；TRUST：同时存在较高的假阳性及假阴性问题。3检测梅毒时常见问题生物学真阳性反应密螺旋体属的螺旋体均具有与梅毒螺旋体完全一样的类脂质抗原，产生的反应素的生物学性状与梅毒一样。生物学假阳性反应其他非密螺旋体疾病的病原体和其他致病因素所引起的反应素反应，如：疟疾、斑疹伤寒、猩红热、乙肝、麻风、红斑狼疮等。人为假阳性反应采集标本过程中注射器上有类脂质，标本运输保存不当，血液游离出脂肪酸，人血白蛋白增高等；试剂中胆固醇含量增高；检验人员技术水平和推断误差；反应时间过长。艾滋病的检测技术1 艾滋病毒的生

29、物学性状形态与结构基因结构与功能病毒复制培育特性反抗力HIV感染的免疫应答HIV HIV基因组包括了逆转录病毒所共有的3个基因和6个调整蛋白基因以及5LTR(long terminal repeat 长末端重复序列)3LTR，它们从左至右分别为：gag，pol，调整蛋白，env的依次排列HIV gag基因编码的核心多肽有4个主要部分：p25和p24、p7、p9、p17，其中p24的特异性最高。HIV env基因编码糖基化的前体gp160。该蛋白后来分为gp120和gp41。gp120为最外包膜上的糖蛋白，gp41为跨膜蛋白。pol基因编码病毒复制所需酶。HIV的免疫诊断运用的抗原确定簇包括：g

30、p41的包膜外侧区段。另外gp36为HIV II型特异性包被抗原片断。HIV Viremia during early infection110102030405060708090100HIV RNA(plasma)1622HIV p24 AgRamp-up viremiaDT=21.5 hrsHIV Antibody 1st gen2nd gen3rd genp24 Ag EIA-HIV MP-NAT-HIV ID-NAT-Peak viremia:106-108 gEq/mL“blip”viremiaViral set-point:102-105 gEq/mL艾滋病试验室检查法HIV1/2抗体检测（包括筛查和确证试验）酶联免疫吸附试验ELISA快速试纸条明胶颗粒凝集试验PA蛋白印迹试验WB艾滋病试验室检查法病毒载量检测逆转录PCR系统RT-PCR核酸序列依靠性扩增技术NASBA分枝DNA信号放大系统bDNACD4+T淋巴细胞检测艾滋诊断试剂的研制进展第一代抗-HIV试剂盒其次代抗-HIV试剂盒第三代抗-HIV试剂盒第四代抗-HIV试剂盒检测艾滋时常见问题假阳性结果假阴性结果确证不确定结果拖带污染