钙成像实验操作及数据处理优秀PPT.ppt

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1、刘丝丝2017年8月25日钙成像试验操作及数据处理钙成像试验操作及数据处理钙成像试验操作1.钙成像原理钙成像原理基本原理：基本原理：利用钙离子指示剂监测组织或细胞内钙离子浓度，进而反映组织或细胞内某些活动或反应钙离子指示剂：钙离子指示剂：能够指示钙离子的可视化物质2.2.试验操作试验操作 操作步骤：操作步骤：（1 1）Fluo-4Fluo-4工作液配制：工作液配制：每管每管Fluo-4 AMFluo-4 AM：+8lDMSO +2lF-127+8lDMSO +2lF-127（2 2）Fluo-4Fluo-4工作液运用：工作液运用：储液稀释储液稀释10001000倍运用（倍稀释数可依据试验调整）

2、：倍运用（倍稀释数可依据试验调整）：1mlDMEM+1lFluo-41mlDMEM+1lFluo-4工工作液作液主要试剂及仪器：主要试剂及仪器：Fluo-4指示剂，DMSO，F-127，DMEM，HBSS，荧光显微镜或激光共聚焦显微镜2.2.试验操作试验操作 （3）Fluo-4指示剂孵育：将培育皿中原培育基弃去，加入500-1000lFluo-4溶液，37孵育20min。（4）清洗：将Fluo-4溶液弃去，用不含有钙、镁离子的HBSS溶液清洗3遍，每次2-3min，最终加上相应的浴液起先拍摄。（5）钙离子成像：运用一般荧光显微镜或者激光共聚焦显微镜进行拍摄。以Leica SP5的CLSM为例：

3、激发光：488nm接受xyt时间轴拍摄模式：Time interval：3s；Frames：200（依据试验而定）。钙成像数据处理必备软件必备软件 Image J MATLABOriginPhotoshopAdobe Illustrator1.图片处理，采集数据softstiffstiffstiffsoftsoft1.1.新建件夹X，将待分析的组图件（200张）考件夹X中1.2.导图：打开Image J 后，File-Import-Image sequence（会弹出新框Sequence Options,点OK）1.3.变换颜色：Image-Lookup Tables-16_colors（留意

4、：假如是彩色的先转成灰度图）1.4.调对度：Image-Adjust-Brightness/Contrast（会弹出新框B&C,将图调整到最佳）-Apply（会弹出新框Apply LUT to all 200image numbers slices in the stack?Choose YES）1.图片处理，采集数据softstiffstiffstiffsoftsoft1.5.选细胞：Analyze-Tools-ROI Manager（会弹出新框ROI Manager）-把Show all and Labels 前打钩-主菜单栏选择选择不同形态具圈细胞（PS.先选择背景，再选择细胞）-每圈个

5、细胞后点Add-圈完全部细胞后截屏保存图（PS.保存了标记细胞个数和依次）新建件夹X中 1.6.数据导出：ROI Manager-More-Multi Measure（会弹出新框Multi Measure）-将Measure All 200image numbers Slices打钩-OK-Results（会弹出新框Results）-File-Save as（将Results数据保存为Excel格式命名Results.xls新建件夹X中）1.图片处理，采集数据softstiffstiffsoftsoft1.7.在件夹X中，新建个Excel件，将数据粘贴新的Excel中命名为Results1.x

6、ls，只保留编号、Mean、Slice三列，将Area列删除1.8.Close the program Image J 在Analyze里面的Set Measurements可以设置Mean值2.Matlab数据处理softstiffstiffsoftsoft2.0.start the program Matlab2.1.复制程序：将程序件CalciumFlow20101105.m拷新建件夹X中，此时件夹X中应包括：原始图件夹、截屏图、Results.xls、Results1.xls、CalciumFlow20101105.m2.2.导件夹X：打开Matlab后，点右上按钮，会弹出新框阅读件夹

7、，选中需导的件夹X后点确定，此时Matlab程序左侧会出现Current Folder，列出了件夹X中全部件2.3.双击打开件夹X中新建的Excel件Results1.xls（切勿打开原Excel件），程序上会弹出Results1.xls中的数据，点按钮Import-Import Data2.Matlab数据处理softstiffstiffsoftsoft2.4.修改程序：双击左侧打开件夹X中CalciumFlow20101105.m，弹出程序语，依据每次图具体状况修改程序，包括修改三条路径（foutin=fopen、fin=fopen、fout=fopen），所圈细胞个数（nreg=），总图

8、数（np=），基线base line（nnp=20，15,10,5）的图数，以及拍摄时间间隔（tstep=）2.5.运程序：点击运按钮-如若运成功，左侧件夹X中会出现in.txt和out.txt件，则表明运成功，否侧会出现运错误提示2.6.Close the program Matlab 3.Origin数据作图softstiffstiffsoftsoft3.0start the program Origins3.1.打开OriginPro 8.5后，File-Import-Single ASCII-弹出新框导件夹X中out.txt件，弹出Book3.2.点击Book的左上全选后，右击，Plot-Line Line，弹出Graph1，保存3.3.Close the program Origins 4.文章作图softstiffstiffsoftsoftThanks for your attention!