环境微生物实验指导书.doc

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1、试验一 培育基的配制及灭菌【目的要求】1. 了解培育基的概念、种类及用途2. 了解培育基的配制原理及其常规配制程序3. 学习和把握细菌、放线菌、霉菌、酵母菌常用培育基的配制方法。【根本原理】培育基是指利用人工方法将适合微生物生长生殖或积存代谢产物的各种养分物质混合 配制而成的养分基质，主要用于微生物的分别、培育、鉴定、菌种保藏等方面。自然界中微生物种类繁多，养分类型多样，加之试验和争辩的目的不同，所以培育基种类很多。不同培 养基一般都应含有微生物生长生殖所需的碳源、氮源、能源、无机盐、生长因子和水等养分 成分。此外，为了满足微生物生长生殖的要求，还必需把握培育基的pH 值。牛肉膏蛋白胨培育基是

2、一种用于培育细菌的培育基，属于半合成培育基。高氏一号培育基是一种用于培育放线菌的合成培育基。马丁氏培育基和豆芽汁葡萄糖培育基分别用于霉菌和酵母菌的分别培育。【材料与用品】1材料与试剂牛肉膏、蛋白胨、葡萄糖、可溶性淀粉、琼脂、黄豆芽、NaCl、KNO 、K HPO 、MgSO 、3244FeSO 、KH PO 、MgSO 7H O、NaOH 溶液1mol/L。42442【仪器与用品】天平、高压蒸汽灭菌锅、移液管、试管、烧杯、量筒、锥形瓶、培育皿、pH 试纸、棉花、纱布、牛皮纸、线绳、报纸等。一、肉膏蛋白胨培育基的配制1. 培育基成分牛肉膏蛋白陈0. 3g1gNaCl0.5g琼脂1.5g水100m

3、lpH7.27.42. 配制方法（1） 称量及溶化：分别称取蛋白胨和NaCl 的所需量，置于唐瓷缸中，参加所需水量的 23 左右的蒸馏水；用玻璃棒挑取牛肉膏置于另一小烧杯中，进展称量。然后参加少量蒸馏水于小烧杯中，加热溶化，倒入上述唐瓷缸中。将唐瓷缸加热，用玻璃棒搅拌，使药品全部溶化。（2） 加琼脂：参加所需量的琼脂，加热溶化。（3） 定容：将溶液倒入量筒中，补充水量至所需体积。（4） 调pH：待溶液冷至室温时，用 1mol/l NaOH 溶液调pH 至 7.27.4。（5） 分装、加塞、包扎。（6） 高压蒸汽灭菌 20 分钟。待培育基冷却至 50左右时，倒入已灭菌的培育皿中，等到培育基完全凝

4、固后，放入冰箱中保存。二、高氏一号培育基的配制1. 培育基成分可溶性淀粉20gKNO1g3NaCl0.5gK HPO0.5g24MgSO0.5g4FeSO0.01g4琼脂20g水1000mlpH7.27.42. 配制方法（1） 称量及溶化：量取所需水量的 2/3 左右参加到搪瓷缸中，加热至沸腾。称量可溶性淀粉，置于另一小烧杯中，参加少量冷水，将淀粉调成糊状，然后到如上述沸水的搪瓷缸中，连续加热，使淀粉完全溶化。分别称量KNO3、NaCl、K2HPO4、MgSO4，依次逐一参加水中溶解。（2） 加琼脂：参加所需量的琼脂，加热溶化。（3） 定容：将溶液倒入量筒中，补充水量至所需体积。（4） 调pH

5、：待溶液冷至室温时，用 1mol/l NaOH 溶液调pH 至 7.27.4。（5） 分装、加塞、包扎。（6） 高压蒸汽灭菌 20 分钟。待培育基冷却至 50左右时，倒入已灭菌的培育皿中，等到培育基完全凝固后，放入冰箱中保存。三、马丁氏培育基的配制1培育基成分葡萄糖10g蛋白胨5gK HPO1g24MgSO 7H O0.5g42琼脂16g水1000ml链霉素溶液10000U/ml3.3ml临用前参加的2配制方法（1） 称量：称取培育基各成分的所需量。（2） 溶化：在搪瓷缸中参加约 2/3 所需水量，然后依次逐一参加并溶化培育基各成分，再按 1000ml 培育基参加 3.3ml 的 0.1孟加拉

6、红溶液。（3） 加琼脂：参加所需量的琼脂，加热溶化。（4） 定容：将溶液倒入量筒中，补充水量至所需体积。（5） 分装、加塞、包扎。（6） 高压蒸汽灭菌 20 分钟。（7） 临用前，加热溶化培育基，待冷却至 60左右，按每 1000ml 培育基以无菌操作参加3.3 ml 的链霉素溶液，快速混匀。四、豆芽汁葡萄糖培育基的配制1. 培育基成分黄豆芽10g葡萄糖5g水100ml2. 配制方法（1） 称取颖黄豆芽 10g，置于烧杯中，再参加 100ml 水，小火煮沸 30min，用纱布过滤，补足失水，即制成 10豆芽汁。（2） 按 100ml 10豆芽汁参加 5g 葡萄糖，煮沸后参加 2g 琼脂，连续加

7、热溶化，补足失水。（3） 分装、加塞、包扎。（4） 高压蒸汽灭菌 20 分钟。待培育基冷却至 50左右时，倒入已灭菌的培育皿中，等到培育基完全凝固后，放入冰箱中保存。【思考题】1. 制作平板培育基的留意事项是什么？2. 培育基配好后，为什么必需马上进展高压蒸汽灭菌？如不能准时灭菌时，应将培育基临时放置何处？3. 如何检查灭菌后的培育基是否无菌？4. 在马丁氏培育基的配制中，链霉素为什么要临用前才参加？5. 假设你需要配制一种含有某抗生素的牛肉膏蛋白胨培育基，其抗生素的终浓度(或工作浓度)为 50g/m，l 你将如何操作?试验二 四大类微生物的分别和培育【目的要求】1. 把握细菌、放线菌、酵母菌

8、和霉菌稀释分别、划线分别技术。2. 学习从样品种分别、纯化出所需菌株。3. 了解培育细菌、放线菌、酵母菌以及霉菌四大类微生物的培育条件和培育时间。【根本原理】土壤是微生物生活的大本营，是查找和觉察有重要应用潜力的微生物的主要菌源。不同 土样中各类微生物数量不同，一般土壤中细菌数量最多，其次为放线菌和霉菌。一般在较干 燥、偏碱性、有机质丰富的土壤中放线菌数量较多；酵母菌在一般土壤中的数量较少，而在 水果表皮、葡萄园、果园土中数量较多。本试验从土壤中分别细菌、放线菌和霉菌，从面曲中分别酵母菌。为了分别和确保获得某种微生物的单菌落，首先要考虑制备不同稀释度的菌悬液。各类 菌的稀释度因菌源、采集样品的

9、季节、气温条件而异。其次，应考虑各类微生物的不同特性， 避开样品种各类微生物相互干扰。细菌或放线菌在中性或微碱性环境较多，但细菌比放线菌 生长快，分别放线菌时，一般在制备土壤稀释液时添加 10酚或在分别培育基中加相应的抗生素以抑制细菌和霉菌。酵母菌和霉菌都宠爱酸性环境，一般酵母菌只能以糖为碳源，不 能直接利用淀粉，酵母菌在pH5 时生长极快。而细菌生长适宜的酸碱度为pH7，所以，分别酵母菌时只要选择适宜的培育基和 pH，可降低细菌增值率，霉菌生长慢，也不干扰酵母菌分别。假设分别霉菌，需降低细菌增值率，一般培育基临用前添加灭过菌的链霉素。【材料与用品】1菌源选定采土地点后，铲去表涂层 23cm，

10、取 310cm 深层土壤 10g，酵母菌分别承受面曲。2培育基肉膏蛋白胨培育基、马丁氏培育基、高氏合成一号培育基、豆芽汁葡萄糖培育基3. 无菌水4. 其他试剂与用品无菌培育皿、无菌移液管、玻璃涂棒、1重铬酸钾等。【试验步骤】一、细菌分别1. 制备土壤稀释液称取土样 1g，参加盛有 99ml 无菌水的锥形瓶中，振荡 10min，使土壤中菌体、芽孢或孢子均匀分散，制成102 稀释度的土壤稀释液。然后按10 倍稀释法进展稀释分别，以制备107 稀释度为例，具体操作过程如下：取 4.5ml 无菌水试管 6 支，按 103107 挨次编号， 放置在试管架上。取移液管一支，准确吸取0.5ml102 土壤稀

11、释液，此为103 稀释度的土壤稀释液，依次操作，制成 104、105、106、107 的土壤稀释液。2. 涂布分别用无菌移液管分别吸取上述 107、106、105、三个稀释度菌悬液 0.1ml，依次参加对应编号已经预备好的平板上。右手持无菌玻璃涂棒，左手那培育皿，并用拇指将皿盖翻开一缝，在火焰旁右手持玻璃涂棒将菌也自平板中心均匀向四周涂布集中，切忌用力过猛将菌液直接推向平板边缘或将培育基划破。每个稀释度涂两个平板。3. 恒温培育将平板置于 30恒温培育箱中培育 24h 后观看结果。二、放线菌分别1. 制备土壤稀释液称取土样 1g，参加盛有 99ml 无菌水的锥形瓶中，并参加 10 滴 1重铬酸

12、钾溶液。振荡后静置 5min，即成 102 稀释度的土壤稀释液。2. 涂布分别用无菌移液管分别吸取上述 105、104、103、三个稀释度菌悬液 0.1ml，涂平板。每个稀释度涂两个平板。3. 培育将涂好的平板放于 28恒温培育箱中培育 57d 后观看结果。三、霉菌的分别1. 制备土壤稀释液称取土样 5g，参加盛有 95ml 无菌水的锥形瓶中，振荡后静置 5min，即成 102 稀释度的土壤稀释液。2. 涂布分别将已灭菌的培育基溶化，参加链霉素溶液，待培育基凝固后，用无菌移液管分别吸取104、103、102、三个稀释度菌悬液 0.1ml，涂平板。每个稀释度涂两个平板。3. 培育将涂好的平板放于

13、 28恒温培育箱中培育 35d 后观看结果。四、酵母菌的分别1. 制备菌悬液称取面曲 1g，参加参加盛有 99ml 无菌水的锥形瓶中，用玻璃帮将面曲捣碎，振荡 20min，即成 102 稀释度的面曲稀释液。2. 涂布分别用无菌移液管分别吸取 106、105、104、三个稀释度菌悬液 0.1ml，涂平板。每个稀释度涂两个平板。3. 培育将涂好的平板放于 30恒温培育箱中培育 23d 后观看结果。【思考题】1. 稀释分别时，为何要将溶化的培育基冷却到 50左右，才倒入装有菌液的培育皿内？2. 在恒温培育箱中培育微生物时为什么培育皿需倒置？试验三 显微镜的使用【目的要求】1. 了解一般光学显微镜的构

14、造和原理。2. 正确把握使用显微镜的方法。【根本原理】显微镜由机械装置和光学系统两大局部组成图 1-1。光学显微镜的构造(图 1-1)1. 物镜转换器 2. 接物镜 3.游标卡尺 4.载物台 5.聚光器 6. 彩虹光阑7.光源8. 镜座9. 电源开关10. 光源滑动变阻器11. 粗调螺旋12. 微调螺旋13.镜臂14.镜筒 15.目镜16.标本移动螺旋1. 机械装置镜座base和镜臂arm镜座位于显微镜底部，呈马蹄形，它支持全镜。镜臂有固定式和活动式两种，活动式的镜臂可转变角度。镜臂支持镜筒。镜筒body tube是由金属制成的圆筒，上接目镜，下接转换器。镜筒有单筒和双筒两种，单筒又可分为直立

15、式和后倾式两种。而双筒则都是倾斜式的，倾斜式镜筒倾斜45。双筒中的一个目镜有屈光度调整装置，以备在两眼视力不同的状况下调整使用。转换器no sepiece为两个金属碟所合成的一个转盘，其上装34 个物镜，可使每个物镜通过镜筒与目镜构成一个放大系统。载物台stage又称镜台，为方形或圆形的盘，用以载放被检物体，中心有一个通光孔。在载物台上有的装有两个金属压夹称标本夹，用以固定标本；有的装有标本推动器，将标本固定后，能向前后左右推动。有的推动器上还有刻度，能确定标本的位置，便于找到变换的视野。调焦装置 是调整物镜和标本间距离的机件，有粗动螺旋coarse adjustment即粗调整器和微动螺旋f

16、ine adjustment即细调整器，利用它们使镜筒或镜台上下移动，当物体在物镜和目镜焦点上时，则得到清楚的图像。2. 光学系统物镜objective物镜安装在镜筒下端的转换器上，因接近被观看的物体，故又称接 物镜。其作用是将物体作第一次放大，是打算成像质量和区分力量的重要部件。物镜上通常 标有数值孔径、放大倍数、镜筒长度、焦距等主要参数。如：NA030；10；160/017； 16mm。其中“NA030”表示数值孔径numerical aperture，简写为NA，“10”表示放大倍数，“160/017”分别表示镜筒长度和所需盖玻片厚度mm，16mm 表示焦距。目镜ocular lens装

17、于镜筒上端，由两块透镜组成。 镜把物镜造成的像再次放大， 不增加区分力，上面一般标有7、10、15等放大倍数，可依据需要选用。一般可按与 物镜放大倍数的乘积为物镜数值孔径的500700 倍，最大也不能超过 1000 倍的选择。目镜的放大倍数过大，反而影响观看效果。聚光器condenser光源射出的光线通过聚光器会聚成光锥照耀标本，增加照明度和 造成适宜的光锥角度，提高物镜的区分力。聚光器由聚光镜和虹彩光圈iris diaphragm 组成，聚光镜由透镜组成，其数值孔径可大于1，当使用大于 1 的聚光镜时，需在聚光镜和载玻片之间加香柏油，否则只能到达10。虹彩光圈由簿金属片组成，中心形成圆孔，推

18、 动把手可任凭调整透进光的强弱。调整聚光镜的高度和虹彩光圈的大小，可得到适当的光照 和清楚的图像。光源light source较式的显微镜其光源通常是安装在显微镜的镜座内，通过按钮开关来把握；老式的显微镜大多是承受附着在镜臂上的反光镜，反光镜是一个两面镜子，一 面是平面，另一面是凹面。在使用低倍和高倍镜观看时，用平面反光镜；使用油镜或光线弱时可用凹面反光镜。滤光片filter可见光是各种颜色的光组成的，不同颜色的光线波长不同。如只需某 一波长的光线时，就要用滤光片。选用适当的滤光片，可以提高区分力，增加影像的反差和清楚度。滤光片有紫、青、蓝、绿、黄、橙、红等各种颜色的，分别透过不同波长的可见光

19、， 可依据标本本身的颜色，在聚光器下加相应的滤光片。三、油镜物镜的根本原理微生物学争辩用的显微镜的物镜通常有低倍物镜16mm，10、高倍物镜4mm，4045和油镜18 mm，95100三种。油镜通常标有黑圈或红圈，也有的以“OIoil immer-sion字样表示，它是三者中放大倍数最大的。依据使用不同放大倍数的目镜， 可使被检物体放大 10002 000 多倍。从图-3 中可看出油镜的焦距和工作距离标本在焦点上看得最清楚时，物镜与样品之间的距离最短，光圈则开得最大，因此，在使用油镜观看时，镜头离标本格外近，需特别留神。使用时，油镜与其他物镜的不同是载玻片与物镜之间不是隔一层空气，而是隔一层油

20、质， 称为油浸系。这种油常选用香柏油，因香柏油的折射率n=152，与玻璃一样。当光线通过 载玻片后，可直接通过香柏油进入物镜而不发生折射。假设玻片与物镜之间的介质为空气， 则称为枯燥系，当光线通过玻片后，受到折射发生散射现象，进入物镜的光线明显削减，这 样就减低了视野的照明度图 1-2。(图 1-1)利用油镜不但能增加照明度，更主要的是能增加数值孔径，由于显微镜的放大效能是由 其数值孔径打算的。所谓数值孔径，即光线投射到物镜上的最大角度称为镜口角的一半正弦，乘上玻片与物镜间介质的折射率所得的乘积，可用以下公式表示：NAnsin式中 NA=数值孔径；n=介质折射率； =最大入射角的半数，即镜口角

21、的半数。因此，光线投射到物镜的角度愈大，显微镜的效能就愈大，该角度的大小打算于物镜的直径和焦距。同时， 的理论限度为 90，sin90=1，故以空气为介质时n=1，数值孔径不能超过 1，如以香柏油为介质时，则n 增大，其数值孔径也随之增大。如光线入射角为 120，其半数的正弦为sin60=087，则：以空气为介质时：NA=1087=087以水为介质时：NA=133087=115以香柏油为介质时：NA=152087=132显微镜的区分力是指显微镜能够区分两点之间最小距离的力量。它与物镜的数值孔径成 正比，与光波长度成反比。因此，物镜的数值孔径愈大，光波波长越短，则显微镜的区分力愈大，被检物体的微

22、小构造也愈能明晰地区分出来。因此，一个高的区分力意味着一个小的 可区分距离，这两个因素是成反比关系的，通常有人把区分力说成是多少微米或纳米，这实 际上是把区分力和最小区分距离混淆起来了。显微镜的区分力是用可区分的最小距离来表示 的。式中 =光波波长。我们肉眼所能感受的光波平均长度为055 m，假设数值孔径为 065 的高倍物镜， 它能区分两点之间的距离为 042 m。而在 042 m 以下的两点之间的距离就区分不出， 即使用倍数更大的目镜，使显微镜的总放大率增加，也仍旧区分不出。只有改用数值孔径更 大的物镜，增加其区分力才行。例如用数值孔径为125 的油镜时，能区分两点之间的因此，我们可以看出

23、，假设承受放大率为40 倍的高倍物镜NA=065，和放大率为24 倍的目镜，虽然总放大率为 960 倍，但其区分的最小距离只有 042 m。假设承受放大率为 90 倍的油镜NA=125，和放大率为 9 倍的目镜，虽然总的放大率为810 倍，但却能区分出 022 m 间的距离。【材料与器材】显微镜、香柏油、擦镜纸、吸水纸等。细菌，酵母菌，霉菌等标本。【试验步骤】1. 观看前的预备11、显微镜从显微镜柜或镜箱内拿出时，要用右手紧握镜臂，左手托住镜座，平稳地将显微镜搬运到试验桌上。（2） 将显微镜放在自己身体的左前方，离桌子边缘约10cm 左右，右侧可放记录本或绘图纸。（3） 调整光照:不带光源的显

24、微镜，可利用灯光或自然光通过反光镜来调整光照， 光线较强的自然光源宜用平面镜；光线较弱的自然光源或人工光源宜用凹面 镜，但不能用直射阳光，直射阳光会影响物像的清楚并刺激眼睛。将 10物镜转入光孔，将聚光器上的虹彩光圈翻开到最大位置，用左眼观看目镜中视野的亮度，转动反光镜，使视野的光照到达最光明最均匀为止。自带光源的显微镜， 可通过调整电流旋钮来调整光照强弱。凡检查染色标本时，光线应强；检查未染色标本时，光线不宜太强。可通过扩大或缩小光圈、升降聚光器、旋转反光镜调整光线。2. 低倍镜观看镜检任何标本都要养成必需先用低倍镜观看的习惯。由于低倍镜视野较大，易于觉察目标和确定检查的位置。将标本片放置在

25、载物台上，用标本夹夹住，移动推动器，使被观看的标本处在物镜正下方，转动粗调整旋钮，使物镜调至接近标本处，用目镜观看并同时用粗调整旋钮渐渐下降载物台，直至物像消灭，再用细调整旋钮使物像清楚为止。用推动器移动标本片，找到适宜的目的像并将它移到视野中心进展观看。3. 高倍镜观看在低倍物镜观看的根底上转换高倍物镜。较好的显微镜，低倍、高倍镜头是同焦的，在 转换物镜时要从侧面观看，避开镜头与玻片相撞。然后从目镜观看，调整光照，使亮度适中， 缓慢调整粗调整旋钮，渐渐下降载物台直至物像消灭，再用细调整旋钮调至物像清楚为止， 找到需观看的部位，并移至视野中心进展观看,并预备用油镜观看。4. 油镜观看（1） 用

26、粗调整器将镜筒提起约 2cm，将油镜转至正下方。（2） 在玻片标本的镜检部位滴上一滴香柏油。（3） 从侧面注视，用粗调整器将镜筒留神地降下，使油镜浸在香柏油中，其镜头几乎与标 本相接，应特别留意不能压在标本上，更不行用力过猛，否则不仅压碎玻片，也会损坏镜头。（4） 从接目镜内观看，进一步调整光线，使光线光明，再用粗调整器将镜筒缓缓上升，直至视野消灭物像为止，然后用细调整器校正焦距。如油镜已离开油面而仍未见物像，必需再 从侧面观看，将油镜降下，重复操作至物像看清为止。5. 观看完后复原下降载物台，将油镜头转出，先用擦镜纸擦去镜头上的油，再用擦镜纸蘸少许乙醇擦去镜头上残留油迹，最终再用擦镜纸擦拭2

27、3 下即可，留意向一个方向擦拭。将各局部复原，转动物镜转换器，使物镜头不与载物台通光孔相对，而是成八字形位置， 再将载物台下降至最低，降下聚光器，反光镜与聚光器垂直，最终用松软纱布清洁载物台等 机械局部，然后将显微镜放回柜内或镜箱中。【留意事项】1. 不准擅自拆卸显微镜的任何部件,以免损坏2. 镜面只能用擦镜纸擦，不能用手指或粗布，以保证光滑度。4. 观看标本时，必需依次用低、高倍镜，最终用油镜。当目视接目镜时，特别在使用油镜时， 切不行使用粗调整器，以免压碎玻片或损伤镜面。5. 观看时，两眼睁开，养成两眼能够轮换观看的习惯，以免眼睛疲乏，并且能够在左眼观看时，右眼注视绘图。思考题1. 油镜与

28、一般物镜在使用方法上有何不同？应特别留意些什么？2. 使用油镜时，为什么必需用香柏油？3. 镜检标本时，为什么先用低倍镜观看，而不是直接用高倍镜或油镜观看？4. 绘出你所观看微生物的根本形态。试验四 纯培育菌种的菌体、菌落形态观看【目的要求】1. 学习并把握观看细菌、放线菌、酵母菌以及霉菌个体形态的根本方法。2. 初步了几种中细菌的个体形态以及与其相应的菌落形态特征。3. 通过观看和比较分别出来的细菌以及放线菌、酵母菌及霉菌的菌落特征，把握初步鉴别上述微生物的方法。【材料与用品】上个试验培育出来的各种细菌，酵母菌，霉菌以及放线菌。【操作步骤】一、细菌、霉菌、放线菌、酵母的培育。略 二、菌落形态

29、特征的观看由于微生物个体外表构造、分裂方式、运动力量、生理特征及产生色素的力量等各不相 同，因而个体及它们的群体在固体培育基上的生长状况也不一样。依据微生物的固体培育基 上相成的菌落特证，可初步区分它们的分类地位。观看时，应留意菌落的外形，大小、外表构造、边缘构造、颜色、透亮度、气味、黏滞性、质地软硬状况、外表光滑与粗糙状况等。通常，细菌菌落多为光滑型、潮湿、质地软，外表构造及边缘构造特征很多，具有各种颜色。但也有枯燥、粗糙的菌落，甚至呈霉状但不起绒毛。酵母菌菌落呈圆形，比细菌菌落大，外表光滑，质地软，颜色多为白色或红色。放线菌的菌落硬度较大，枯燥致密，且与培育基结合严密，不易被挑取。菌落外表

30、呈粉状或皱褶呈龟裂状，具有各种颜色，正面和反面颜色不同。霉菌菌落长成绒状或棉絮状，能集中生长，疏松，很简洁挑取。也具有各种颜色，如白色，绿色，灰色等，正面和反面不尽一样。三、细菌、放线菌、酵母菌及霉菌菌落特征的比较对分别培育出来的细菌，酵母菌，放线菌及霉菌的菌落特征认真观看，并将上述四种微生物进展比较，做认真记录。【试验结果】填写下表菌落特征外形菌落大小cm外表光泽与培育基结合程名称度细菌放线菌霉菌酵母菌思考题1. 菌落枯燥与潮湿的缘由是什么？2. 具有鞭毛、荚膜的细菌在它们形成菌落时，一般会有哪些相应的特征？试验五微生物细胞大小的测定一、目的要求1. 学会测微尺的使用和计算方法。2. 把握酵

31、母菌细胞大小测定的方法。二、根本原理三、器材微生物细胞大小，是微生物的形态特征之一，也是分类鉴定的依据之一。由于菌体很小，只能在显微镜下测量。用来测量微生物细胞大小的工具有目镜测微尺和镜台测微尺。镜台测微尺是中心局部刻有准确等分线的载玻 片。一般将 1mm 等分为 100 格或 2mm 等分为 200 格，每格长度等于 001mm即 106m。是专用于校正目镜测微尺每格长度的。目镜测微尺是一块可放在接目镜内的隔板上的 圆形小玻片，其中心刻有准确的刻度，有等分50 小格或 100 小格两种，每 5 小格间有一长线相隔。由于所用接目镜放大倍数和接物镜放大倍数的不同，目镜测微尺每小格所代表的实际长度

32、也就不同，因此，目镜测微尺不能直接用来测量微生物的大小，在使用前必需用镜台测微尺进展校正，以求得在肯定放大倍数的接目镜和接物镜下该目镜测微尺每小格的相对值， 然后才可用来测量微生物的大小。酵母菌悬液，目镜测微尺，镜台测微尺，显微镜，擦镜纸，香柏油等。四、操作步骤1. 目镜测微尺的标定(1) 放置目镜测微尺取出接目镜，旋开接目镜透镜，将目镜测微尺的刻度朝下放在接目 镜筒内的隔板上图-4，B，然后旋上接目透镜，最终将此接目镜插入镜筒内图-4， C。(2) 放置镜台测微尺将镜台测微尺置于显微镜的载物台上，使刻度面朝上。(3) 校正目镜测微尺先用低倍镜观看，对准焦距，当看清镜台测微尺后，转动接目镜，

33、使目镜测微尺的刻度与镜台测微尺的刻度平行，移动推动器，使目镜测微尺和镜台测微尺的 某一区间的两对刻度线完全重合，然后计数出两对重合线之间各自所占的格数图-6。依据计数得到的目镜测微尺和镜台测微尺重合线之间各自所占的格数，通过如下公式换算出目镜测微尺每小格所代表的实际长度。目镜测微尺每小格长度m=同法校正在高倍镜和油镜下目镜测微尺每小格所代表的长度。2. 菌体大小的测定目镜测微尺校正后，移去镜台测微尺，换上酵母玻片标本，校正焦距使菌体清楚，转动 目镜测微尺或转动染色标本，测出酵母的长和宽各占几小格，将测得的格数乘以目镜测 微尺每小格所代表的长度，即可换算出此单个菌体的大小值，在同一涂片上需测定1

34、0 至 20 个菌体，求出其平均值，才能代表该菌的大小。而且一般是用对数生长期的菌体来进展测定。3. 取出目镜测微尺，将接目镜放回镜筒，再将目镜测微尺和镜台测微尺分别用擦镜纸擦拭后，放回盒内保存。YPD(YEPD)培育基YPD 是用于酵母常规生长的复合培育基。酵母提取物 10g蛋白胨 20 g葡萄糖 20g加水至 1000 ml制备平板时，在高压灭菌前参加 20 g 细菌培育用琼脂(终浓度为 2)。五、试验报告1. 结果(1) 将目镜测微尺校正结果填入下表。(2) 将测量酵母大小结果填入下表。2. 思考题当接目镜不变，目镜测微尺也不变，只转变接物镜，目镜测微尺每格所量的镜台上物体的实际长度是否

35、一样？为什么？试验六微生物显微计数-血球计数板法一、目的要求1. 了解血球计数板的构造和使用方法。2. 学会用血球计数板对酵母细胞进展计数。二、根本原理利用血球计数板在显微镜下直接计数，是一种常用的微生物计数方法。此法的优点是直 观、快速。将经过适当稀释的菌悬液或孢子悬液放在血球计数板载玻片与盖玻片之间的计数室中，在显微镜下进展计数。由于计数室的容积是肯定的 01mm3，所以可以依据在显微镜下观看到的微生物数目来换算成单位体积内的微生物总数目。由于此法计得的是活 菌体和死菌体的总和，故又称为总菌计数法。血球计数板，通常是一块特制的载玻片，其上由四条槽构成三个平台。中间的平台又被一短横槽隔成两半

36、，每一边的平台上各刻有一个方格网，每个方格网共分九个大方格，中间的大方格即为计数室，微生物的计数就在计数室中进展。计数室的刻度一般有两种规格，一种是一个大方格分成16 个中方格，而每个中方格又分成25 个小方格；另一种是一个大方格分成 25 个中方格，而每个中方格又分成 16 个小方格。但无论是哪种规格的计数板，每一个大方格中的小方格数都是一样的，即1625=400 小方格。每一个大方格边长为 1mm，则每一大方格的面积为 1mm2，盖上盖玻片后，载玻片与盖玻片之间的高度为 01mm，所以计数室的容积为 01mm3。在计数时，通常数五个中方格的总菌数，然后求得每个中方格的平均值，再乘上16 或

37、25，就得出一个大方格中的总菌数，然后再换算成1ml 菌液中的总菌数。下面以一个大方格有 25 个中方格的计数板为例进展计算：设五个中方格中总菌数为 A， 菌液稀释倍数为B，那么，一个大方格中的总菌数因 1ml=1cm3=1000mm3，=50000AB个同理，假设是 16 个中方格的计数板，设五个中方格的总菌数为A，则三、器材酿酒酵母菌悬液，血球计数板，显微镜，盖玻片，无菌毛细管。四、操作步骤1. 稀释将酿酒酵母菌悬液进展适当稀释，菌液如不浓，可不必稀释。2. 镜检计数室在加样前，先对计数板的计数室进展镜检。假设有污物，则需清洗后才能进展计数。3. 加样品将清洁枯燥的血球计数板盖上盖玻片，再

38、用无菌的细口滴管将稀释的酿酒酵母菌液由盖玻片边缘滴一小滴不宜过多，让菌液沿缝隙靠毛细渗透作用自行进入计数室，一般计数室均能布满菌液。留意不行有气泡产生。4. 显微镜计数静止 5 分钟后，将血球计数板置于显微镜载物台上，先用低倍镜找到计数室所在位置， 然后换成高倍镜进展计数。在计数前假设觉察菌液太浓或太稀，需重调整稀释度后再计数。一般样品稀释度要求每小格内约有 510 个菌体为宜。每个计数室选 5 个中格可选 4 个角和中心的中格中的菌体进展计数。位于格线上的菌体一般只数上方和右边线上的。如遇酵 母出芽，芽体大小到达母细胞的一半时，即作两个菌体计数。计数一个样品要从两个计数室 中计得的值来计算样

39、品的含菌量。5. 清洗血球计数板使用完毕后，将血球计数板在水笼头上用水柱冲洗，切勿用硬物洗刷，洗完后自行晾干或用吹风机吹干。镜检，观看每小格内是否有残留菌体或其他沉淀物。假设不干净，则必需重复洗涤至干净为止。五、试验报告1. 结果将结果记录于下表中。 A 表示五个中方格中的总菌数； B 表示菌液稀释倍数。2. 思考题依据你试验的体会，说明用血球计数板计数的误差主要来自哪些方面？应如何尽量削减误差，力求准确？试验七 革兰氏染色法一、目的要求1、学习并初步把握革兰氏染色法2、了解革兰氏染色的原理及其在细菌分类鉴定中的重要性。二、根本原理革兰氏染色反响是细菌分类和鉴定的重要性状。它是 1884 年由

40、丹麦医师Gram 创立的。革兰氏染色法Gram stain不仅能观看到细菌的形态而且还可将全部细菌区分为两大类： 染色反响呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌，用G+表示；染色反响呈红色复染颜色的称 为革兰氏阴性细菌，用 G-表示。细菌对于革兰氏染色的不同反响，是由于它们细胞壁的成分和构造不同而造成的。革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是由肽聚糖形成的网状构造组成的， 在染色过程中，当用乙醇处理时，由于脱水而引起网状构造中的孔径变小，通透性降低，使 结晶紫-碘复合物被保存在细胞内而不易脱色，因此，呈现蓝紫色；革兰氏阴性细菌的细胞 壁中肽聚糖含量低，而脂类物质含量高，当用乙醇处理时，脂类物质溶解，细胞壁的通透性

41、 增加，使结晶紫-碘复合物易被乙醇抽出而脱色，然后又被染上了复染液番红的颜色，因此呈现红色。革兰氏染色需用四种不同的溶液：碱性染料basic dye初染液；媒染剂mordant；脱色剂decolorising agent和复染液counterstain。碱性染料初染液的作用象在细菌的单染色法根本原理中所述的那样，而用于革兰氏染色的初染液一般是结晶紫crystal violet。媒染剂的作用是增加染料和细胞之间的亲和性或附着力，即以某种方式帮助染料固定在细胞 上，使不易脱落，碘iodine是常用的媒染剂。脱色剂是将被染色的细胞进展脱色，不同 类型的细胞脱色反响不同，有的能被脱色，有的则不能，脱色

42、剂常用 95的酒精ethanol。复染液也是一种碱性染料，其颜色不同于初染液，复染的目的是使被脱色的细胞染上不同于 初染液的颜色，而未被脱色的细胞仍旧保持初染的颜色，从而将细胞区分成 G+和G-两大类群，常用的复染液是番红。三、器材1、菌种：大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌。2、其他：革兰氏染色液，载玻片，显微镜、盖玻片、吸水纸，接种针。四、操作步骤1. 涂片将培育 1416 小时的枯草芽孢杆菌和培育 24 小时的大肠杆菌分别作涂片留意涂片切不行过于深厚，枯燥、固定。固定时通过火焰12 次即可，不行过热，以载玻片不烫手为宜。2. 染色（1） 初染 加草酸铵结晶紫一滴，约一分钟，水洗。（2

43、） 媒染 滴加碘液冲去残水，并掩盖约一分钟，水洗。（3） 脱色 将载玻片上面的水甩净，并衬以白背景，用 95酒精滴洗至流出酒精刚刚不消灭紫色时为止，约 2030 秒钟，马上用水冲净酒精。（4） 复染 用番红液染 12 分钟，水洗。（5） 镜检 枯燥后，置油镜观看。革兰氏阴性菌呈红色，革兰氏阳性菌呈紫色。以分散开的细菌的革兰氏染色反响为准，过于密集的细菌，经常呈假阳性。（6） 同法在一载玻片上以大肠杆菌与枯草芽孢杆菌混合制片，作革兰氏染色比照。 革兰氏染色的关键在于严格把握酒精脱色程度，如脱色过度，则阳性菌可被误染为阴性菌；而脱色不够时，阴性菌可被误染为阳性菌。此外，菌龄也影响染色结果，如阳性菌

44、培育时间过长，或已死亡及局部菌自行溶解了，都常呈阴性反响。培育基成分牛肉膏0. 3g蛋白陈1gNaCl0.5g琼脂1.5g水100mlpH7.27.4五、试验报告1. 结果：在你所作的革兰氏染色制片中，大肠杆菌和枯草芽孢杆菌各染成何色？它们是革兰氏阴性菌还是革兰氏阳性菌？2. 思考题(1)你认为哪些环节会影响革兰氏染色结果的正确性？其中最关键的环节是什么？ (2)为什么要求制片完全枯燥后才能用油镜观看?(3)假设你的涂片未经热固定，将会消灭什么问题?假设加热温度过高、 时间太长，又会怎么样呢？（4） 革兰氏染色涂片为什么不能过于深厚？其染色成败的关键一步是什么？（5） 进展革兰氏染色时，为什么特别强调菌龄不能太老，用老龄细菌染色会消灭什么问题？（6） 革兰氏染色时，初染前能加碘液吗？乙醇脱色后复染之前，革兰氏阳性和革兰氏阴性菌分别是什么颜色？（7） 当你对一株未知菌进展革兰氏染色时，怎样能确证你的染色技术操作正确，结果牢靠？