蛋白质工程原理及其在食品工业中的应用.ppt

《蛋白质工程原理及其在食品工业中的应用.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《蛋白质工程原理及其在食品工业中的应用.ppt（99页珍藏版）》请在淘文阁 - 分享文档赚钱的网站上搜索。

1、第六章第六章蛋白质工程原理及其蛋白质工程原理及其在食品加工中的应用在食品加工中的应用王继刚王继刚第一节第一节 蛋白质工程的原理和方法蛋白质工程的原理和方法 以蛋白质结构和功能的研究为基础，运以蛋白质结构和功能的研究为基础，运用基因工程的方法，借助计算机信息处理技用基因工程的方法，借助计算机信息处理技术的支持，从改变或合成基因入手，定向地术的支持，从改变或合成基因入手，定向地改造天然蛋白质或设计全新的人工蛋白质分改造天然蛋白质或设计全新的人工蛋白质分子，使之具有特定的结构、性质和功能，能子，使之具有特定的结构、性质和功能，能更好地为人类服务的一种生物技术。更好地为人类服务的一种生物技术。一、蛋白

2、质工程的概念一、蛋白质工程的概念 天然的正常构象是蛋白质的最佳状态，天然的正常构象是蛋白质的最佳状态，它既能高效地发挥功能，又便于机体的正常它既能高效地发挥功能，又便于机体的正常调控，因而极易失活而中止作用。但在生物调控，因而极易失活而中止作用。但在生物体外，特别是工业化的粗放生产条件下，这体外，特别是工业化的粗放生产条件下，这种可被灵敏调节的特性就表现为酶分子性质种可被灵敏调节的特性就表现为酶分子性质的极不稳定性，导致难以持续发挥应有的功的极不稳定性，导致难以持续发挥应有的功能，成为限制其推广应用的主要原因。如温能，成为限制其推广应用的主要原因。如温度、压力、机械力、重金属、有机溶剂、氧度、

3、压力、机械力、重金属、有机溶剂、氧化剂以及极端化剂以及极端pHpH值等都会影响它的作用。值等都会影响它的作用。蛋白质工程技术针对这一现状，对天然蛋白质工程技术针对这一现状，对天然蛋白质进行改造改良或全新设计模拟，使目蛋白质进行改造改良或全新设计模拟，使目的蛋白质具有特殊的结构和性质，能够抵御的蛋白质具有特殊的结构和性质，能够抵御外界的不良环境，即使在极端恶劣条件下也外界的不良环境，即使在极端恶劣条件下也能继续发挥作用，因而蛋白质工程具有广阔能继续发挥作用，因而蛋白质工程具有广阔的应用前景的应用前景。主要包括：主要包括：分子遗传学、蛋白质结构功能相分子遗传学、蛋白质结构功能相关的理论与技术。关的

4、理论与技术。分子遗传学：完整分子遗传学：完整cDNAcDNA的克隆技术、的克隆技术、DNADNA序列序列的快速测定技术、的快速测定技术、DNADNA序列推测蛋白质序列的多维序列推测蛋白质序列的多维程序系统、原核生物及真核生物基因表达过程的程序系统、原核生物及真核生物基因表达过程的调控、基因的定位诱变及随机诱变理论与技术等。调控、基因的定位诱变及随机诱变理论与技术等。蛋白质结构功能分析：蛋白质一级结构氨蛋白质结构功能分析：蛋白质一级结构氨基酸序列的分析；基酸序列的分析；X X光单晶衍射结构分析技术；两光单晶衍射结构分析技术；两维和三维核磁共振结构分析技术；蛋白质结构数维和三维核磁共振结构分析技术

5、；蛋白质结构数据库的建立；蛋白质功能的酶学和免疫研究技术；据库的建立；蛋白质功能的酶学和免疫研究技术；蛋白质分子力场、能态、自由能等生物物理学研蛋白质分子力场、能态、自由能等生物物理学研究技术；计算机模拟处理结构分析系统等。究技术；计算机模拟处理结构分析系统等。两大类理论与技术相互关联、相互促进，两大类理论与技术相互关联、相互促进，借助其他多类学科的支持，完成对蛋白质借助其他多类学科的支持，完成对蛋白质分子结构与功能分析、归类，进一步展开分子结构与功能分析、归类，进一步展开突变蛋白质的分子模拟与预测，实现蛋白突变蛋白质的分子模拟与预测，实现蛋白质的改造，以及全新蛋白质的分子结构与质的改造，以及

6、全新蛋白质的分子结构与功能的设计，在计算机模拟的基础上，进功能的设计，在计算机模拟的基础上，进行蛋白质分子的化学修饰、合成的实际操行蛋白质分子的化学修饰、合成的实际操作，验证分子设计的结果，获得具有特定作，验证分子设计的结果，获得具有特定结构、性质和功能的目的蛋白质。结构、性质和功能的目的蛋白质。蛋白质的生物学功能蛋白质的生物学功能1.1.催化功能：催化功能：酶酶2.2.调节功能：调节功能：激素激素3.3.结构功能：结构功能：皮、毛、骨、牙、细胞骨架皮、毛、骨、牙、细胞骨架4.4.运输功能：运输功能：血红蛋白血红蛋白5.5.免疫功能：免疫功能：免疫球蛋白免疫球蛋白6.6.运动功能：运动功能：鞭

7、毛、肌肉蛋白鞭毛、肌肉蛋白7.7.储藏功能：储藏功能：酪蛋白酪蛋白8.8.生物膜功能：生物膜功能：及神经传导等及神经传导等由于蛋白质是由许多由于蛋白质是由许多氨基酸氨基酸按一定顺序按一定顺序连接而成的，每一种蛋白质有自己独特的氨连接而成的，每一种蛋白质有自己独特的氨基酸顺序，所以改变其中关键的氨基酸就能基酸顺序，所以改变其中关键的氨基酸就能改变蛋白质的性质。改变蛋白质的性质。而氨基酸是由三联体密而氨基酸是由三联体密码决定的，只要码决定的，只要改变构成遗传密码的一个或改变构成遗传密码的一个或两个碱基就能达到改造蛋白质的目的。两个碱基就能达到改造蛋白质的目的。蛋白蛋白质工程的一个重要途径就是根据人

8、们的需要，质工程的一个重要途径就是根据人们的需要，对负责编码某种蛋白质的基因重新进行设计，对负责编码某种蛋白质的基因重新进行设计，使合成的蛋白质变得更符合人类的需要。使合成的蛋白质变得更符合人类的需要。天然蛋白质的合成过程天然蛋白质的合成过程DNADNA（基因）（基因）转录转录mRNAmRNA翻译翻译蛋白质蛋白质基因基因表达（转录和翻译）表达（转录和翻译）形成氨基酸序列的多肽形成氨基酸序列的多肽链链形成具有高级结构的蛋白质形成具有高级结构的蛋白质行使生物功能行使生物功能思考：对天然蛋白质进行改造，你认为应该直接对蛋思考：对天然蛋白质进行改造，你认为应该直接对蛋白质分子进行操作，还是通过对基因的

9、操作来实现？白质分子进行操作，还是通过对基因的操作来实现？应该应该从对基因的操作来实现从对基因的操作来实现对天然蛋白质改造，对天然蛋白质改造，主要原因如下：主要原因如下：（1 1）任何一种天然蛋白质都是由）任何一种天然蛋白质都是由基因基因编码的，编码的，改造了基因即对蛋白质进行了改造，而且改造了基因即对蛋白质进行了改造，而且改造过改造过的蛋白质可以遗传下去的蛋白质可以遗传下去。如果对蛋白质直接改造，如果对蛋白质直接改造，即使改造成功，被改造过的蛋白质分子还是无法即使改造成功，被改造过的蛋白质分子还是无法遗传的。遗传的。（2 2）对基因进行改造比对蛋白质直接改造要）对基因进行改造比对蛋白质直接改

10、造要容容易操作，难度要小得多易操作，难度要小得多。二、蛋白质工程的原理二、蛋白质工程的原理（一）蛋白质工程的（一）蛋白质工程的目的目的 对目的蛋白质进行结构和功能上的设计对目的蛋白质进行结构和功能上的设计与改造，以满足人们特定条件下的需要。以与改造，以满足人们特定条件下的需要。以蛋白质结构与功能的研究为基础，掌握蛋白蛋白质结构与功能的研究为基础，掌握蛋白质活性中心的结构，包括催化中心和调节中质活性中心的结构，包括催化中心和调节中心的空间构象，了解构成中心的各氨基酸残心的空间构象，了解构成中心的各氨基酸残基及其侧链基团的位置，再借助计算机图像基及其侧链基团的位置，再借助计算机图像与处理系统的模拟

11、进行分子辅助设计，提出与处理系统的模拟进行分子辅助设计，提出对目的蛋白质的改建或构建方案，确定活性对目的蛋白质的改建或构建方案，确定活性中心的氨基酸残基组成，并辅助设计和预测中心的氨基酸残基组成，并辅助设计和预测其结构功能的变化。其结构功能的变化。（二）蛋白质工程的组成部分（二）蛋白质工程的组成部分 1.1.蛋白质放大扩增系统蛋白质放大扩增系统 由由组组织织提提取取的的少少量量纯纯化化的的蛋蛋白白质质，通通常常只只有有。作作为为出出发发蛋蛋白白质质分分子子，先先解解析析部部分分肽肽段段的的一一级级结结构构，根根据据遗遗传传密密码码设设计计并并合合成成相相应应的的同同位位素素标标记记寡寡聚聚核核

12、苷苷酸酸片片段段，再再由由此此从从基基因因文文库库中中调调出出该该蛋蛋白白质质的的克克隆隆化化基基因因，转转入入DNADNA序序列列分分析析系系统统测测定定DNADNA序序列列并并克克隆隆化化，最最后后通通过过表表达达载载体体系系统统扩扩增增蛋蛋白白质质的的量量，达达到到能能够够分分析析出出发发蛋蛋白白质质的的结结构构功功能能的的水水平平，通通常常需需要要蛋蛋白白质质量为量为。2.2.蛋白质结构功能分析及分子设计系统蛋白质结构功能分析及分子设计系统 由上一系统获得足量的出发蛋白质后，由上一系统获得足量的出发蛋白质后，通过目前已经具备的蛋白质结构分析方法，通过目前已经具备的蛋白质结构分析方法，分

13、析蛋白质的一级结构和空间结构。分析蛋白质的一级结构和空间结构。X X光衍射光衍射分析晶体蛋白质的结构，而三维核磁共振法分析晶体蛋白质的结构，而三维核磁共振法研究溶液中的蛋白质结构，同时研究该蛋白研究溶液中的蛋白质结构，同时研究该蛋白质结构与功能的关系，并将结果输入计算机质结构与功能的关系，并将结果输入计算机图像处理系统和结构处理系统，根据生物物图像处理系统和结构处理系统，根据生物物理学原理以及已知蛋白质结构功能数据库的理学原理以及已知蛋白质结构功能数据库的基本规律，从结构与功能研究出发，进行分基本规律，从结构与功能研究出发，进行分子结构分析与模拟，进一步辅助设计和功能子结构分析与模拟，进一步辅

14、助设计和功能预测，提出分子的预期性质、改造或构建方预测，提出分子的预期性质、改造或构建方案，完成突变蛋白质的分子设计或构建过程。案，完成突变蛋白质的分子设计或构建过程。3.3.突变蛋白质的合成表达系统突变蛋白质的合成表达系统 将突变方案通过分子遗传学方法实施即将突变方案通过分子遗传学方法实施即蛋白质的定点突变技术，改造或构建方案通蛋白质的定点突变技术，改造或构建方案通过合成突变寡聚核苷酸，引入定位突变，或过合成突变寡聚核苷酸，引入定位突变，或采用其他方法引入突变，并进入克隆系统分采用其他方法引入突变，并进入克隆系统分离出突变离出突变DNADNA，以此作为模板，引入载体表，以此作为模板，引入载体

15、表达系统，扩增表达获得大量的突变蛋白质。达系统，扩增表达获得大量的突变蛋白质。对获得的突变蛋白质进行结构、性质和功能对获得的突变蛋白质进行结构、性质和功能的分析、测试与判定，如符合分子设计的要的分析、测试与判定，如符合分子设计的要求，则获得目的蛋白质；如不能满足实际要求，则获得目的蛋白质；如不能满足实际要求，则再由分子设计系统重新指导设计，进求，则再由分子设计系统重新指导设计，进入新一轮循环，最终获得满足人们要求的目入新一轮循环，最终获得满足人们要求的目的蛋白质的蛋白质。（三）蛋白质工程操作中的问题（三）蛋白质工程操作中的问题 1.1.有关分子遗传学和基因工程的问题有关分子遗传学和基因工程的问

16、题 例如更有效的例如更有效的cDNAcDNA克隆技术，精确高效的定克隆技术，精确高效的定位突变技术，高效目的基因表达系统等。位突变技术，高效目的基因表达系统等。2.2.有关蛋白质结构功能研究的理论和技术有关蛋白质结构功能研究的理论和技术 例如准确地由一级结构推测高级结构，肽链例如准确地由一级结构推测高级结构，肽链折叠的精确控制，蛋白质的翻译后修饰，蛋白质折叠的精确控制，蛋白质的翻译后修饰，蛋白质结构可变性，分子动力学与蛋白质功能的关系，结构可变性，分子动力学与蛋白质功能的关系，蛋白质在晶体、溶液以及细胞中的不同存在状态蛋白质在晶体、溶液以及细胞中的不同存在状态及其对蛋白质性质、功能的影响等。及

17、其对蛋白质性质、功能的影响等。3.3.一些相关辅助技术一些相关辅助技术 例如微量蛋白质的纯化鉴定技术、更有效的例如微量蛋白质的纯化鉴定技术、更有效的蛋白质结晶方法、计算机辅助系统的有效性等。蛋白质结晶方法、计算机辅助系统的有效性等。三、蛋白质工程的基本步骤三、蛋白质工程的基本步骤 1.1.分分离离纯纯化化目目的的蛋蛋白白，使使之之结结晶晶并并作作X X晶晶体体衍衍射射分分析析，结结合合核核磁磁共共振振技技术术等等其其他他方方法法的的分分析析结结果，得到其空间结果尽可能多的信息。果，得到其空间结果尽可能多的信息。2.2.对对目目的的蛋蛋白白质质功功能能作作详详细细的的研研究究，确确定定它它的功能

18、域。的功能域。3.3.通通过过对对蛋蛋白白质质的的一一级级结结构构、空空间间结结构构和和功功能之间相互关系的分析，找出关键的基团和结构。能之间相互关系的分析，找出关键的基团和结构。4.4.围围绕绕这这些些关关键键的的基基团团和和结结构构提提出出对对蛋蛋白白质质进行改造的方案，并用基因工程的方法实施。进行改造的方案，并用基因工程的方法实施。5.5.对对经经过过改改造造的的蛋蛋白白质质进进行行功功能能测测定定，看看看看改造的效果如何。改造的效果如何。6.6.重复重复4 4和和5 5两个步骤，直到获得理想的结果。两个步骤，直到获得理想的结果。蛋白质工程的基本途径蛋白质工程的基本途径预期的蛋白质功能预

19、期的蛋白质功能设计预期的蛋白质结构设计预期的蛋白质结构推测应有的氨基酸序列推测应有的氨基酸序列找到相对应的脱氧核苷酸序列找到相对应的脱氧核苷酸序列（基因）（基因）讨论：某多肽链的一段氨基酸序列是：讨论：某多肽链的一段氨基酸序列是：丙氨酸丙氨酸色氨酸色氨酸赖氨酸赖氨酸甲硫氨酸甲硫氨酸苯丙氨酸苯丙氨酸（1 1）怎样得出决定这一段肽链的脱氧核苷酸序列？）怎样得出决定这一段肽链的脱氧核苷酸序列？请把相应的碱基序列写出来。请把相应的碱基序列写出来。首先应该根据三联密码子推出首先应该根据三联密码子推出mRNAmRNA序列，序列，每种氨基每种氨基酸都有对应的三联密码子，只要查一下遗传密码子酸都有对应的三联密

20、码子，只要查一下遗传密码子表，就可以将上述氨基酸序列的编码序列查出来。表，就可以将上述氨基酸序列的编码序列查出来。再根据碱基互补配对规律推出脱氧核苷酸序列再根据碱基互补配对规律推出脱氧核苷酸序列。但。但是由于上述氨基酸序列中有几个氨基酸是由多个三是由于上述氨基酸序列中有几个氨基酸是由多个三联密码子编码，因此其碱基排列组合起来就比较复联密码子编码，因此其碱基排列组合起来就比较复杂，至少可以排列出杂，至少可以排列出1616种种。GCUGCU（或（或C C或或A A或或G G）UGGAAAUGGAAA（或（或G G）AUGUUUAUGUUU（或（或C C）mRNAmRNA序列序列 脱氧核苷酸脱氧核苷

21、酸序列序列GCT(GCT(或或C C或或A A或或G)TGGAAA(G)TGGAAA(或或G)ATGTTT(G)ATGTTT(或或C)C)CGA(CGA(或或G G或或T T或或C)ACCTTTC)ACCTTT（或（或C)TACAAA(C)TACAAA(或或G)G)（2 2）确定目的基因的碱基序列后，怎样才能）确定目的基因的碱基序列后，怎样才能合成或改造目的基因（合成或改造目的基因（DNADNA）？）？确定目的基因的碱基序列后，就可以根据确定目的基因的碱基序列后，就可以根据人类的需要改造它，通过人类的需要改造它，通过人工合成的方法人工合成的方法或从基因库中获取。或从基因库中获取。蛋白质工程与基

22、因工程的关系蛋白质工程与基因工程的关系 蛋白质工程是在基因工程的基础上蛋白质工程是在基因工程的基础上，延，延伸出来的伸出来的第二代基因工程第二代基因工程，是包含多学科的，是包含多学科的综合科技工程领域。综合科技工程领域。基因工程基因工程是通过基因操作把外源基因转是通过基因操作把外源基因转入适当的生物体内，并在其中进行表达，它入适当的生物体内，并在其中进行表达，它的产品是的产品是该基因编码的该基因编码的天然存在的蛋白质天然存在的蛋白质。蛋白质工程蛋白质工程就是根据蛋白质的精细结构与功能之就是根据蛋白质的精细结构与功能之间的关系，利用基因工程的手段，按照人类自身的需间的关系，利用基因工程的手段，按

23、照人类自身的需要，定向地改造天然的蛋白质，甚至要，定向地改造天然的蛋白质，甚至创造新的、自然创造新的、自然界本不存在的、具有优良特性的蛋白质分子。界本不存在的、具有优良特性的蛋白质分子。蛋白质工程自诞生之日起，就蛋白质工程自诞生之日起，就与基因工程密不可与基因工程密不可分分。蛋白质工程根据对分子预先设计的方案，通过对。蛋白质工程根据对分子预先设计的方案，通过对天然蛋白质的基因进行改造，来实现对它所编码的蛋天然蛋白质的基因进行改造，来实现对它所编码的蛋白质进行改造。因此，它的产品已不再是天然的蛋白白质进行改造。因此，它的产品已不再是天然的蛋白质，而是经过改造的、具有了人类所需要的优点的蛋质，而是

24、经过改造的、具有了人类所需要的优点的蛋白质。白质。蛋白质工程与酶工程的关系蛋白质工程与酶工程的关系v绝大多数酶都是蛋白质，酶工程与蛋白质绝大多数酶都是蛋白质，酶工程与蛋白质工程有什么区别？工程有什么区别？v 酶工程酶工程就是指将酶所具有的生物催化作用，就是指将酶所具有的生物催化作用，借助工程学的手段，应用于生产、生活、医借助工程学的手段，应用于生产、生活、医疗诊断和环境保护等方面的一门科学技术。疗诊断和环境保护等方面的一门科学技术。概括地说，酶工程是由酶制剂的生产和应用概括地说，酶工程是由酶制剂的生产和应用两方面组成的。酶工程的应用主要集中于食两方面组成的。酶工程的应用主要集中于食品工业、轻工

25、业以及医药工业中。品工业、轻工业以及医药工业中。通常所说的通常所说的酶工程是用工程菌生产酶制剂酶工程是用工程菌生产酶制剂，而没有经过由酶的功能来设计酶的分子结构，而没有经过由酶的功能来设计酶的分子结构，然后由酶的分子结构来确定相应基因的碱基序然后由酶的分子结构来确定相应基因的碱基序列等步骤。因此，列等步骤。因此，酶工程的重点在于对已存酶酶工程的重点在于对已存酶的合理充分利用，的合理充分利用，而蛋白质工程的重点则在于而蛋白质工程的重点则在于对已存在的蛋白质分子的改造。当然，随着对已存在的蛋白质分子的改造。当然，随着蛋蛋白质工程白质工程的发展，其的发展，其成果也会应用到酶工程中，成果也会应用到酶工

26、程中，使酶工程成为蛋白质工程的一部分使酶工程成为蛋白质工程的一部分。蛋白质的结构蛋白质的结构蛋白质分子的生物功能，与蛋白质分子蛋白质分子的生物功能，与蛋白质分子的结构密不可分的结构密不可分。决定蛋白质这种特殊生决定蛋白质这种特殊生物功能的关键因素是它的分子构象物功能的关键因素是它的分子构象。基本组成单位基本组成单位-氨基酸氨基酸组成生物体蛋白质的组成生物体蛋白质的2020种氨基酸种氨基酸氨基酸氨基酸英文英文氨基酸氨基酸英文英文赖赖组组脯脯苏苏丝丝色色天冬天冬精精LysHisProThrSerTryAspArgLysineHistidineProlineThreonineSerineTrypto

27、phanAsparticacidArginine谷谷缬缬半胱半胱丙丙亮亮酪酪甲硫甲硫(蛋蛋)GluValCysAlaLeuTyrMetGlutamicacidValineCysteineAlanineLeucineTyrosineMethionine甘甘苯丙苯丙GlyPheGlycinePhenylalanine谷酰谷酰天冬酰天冬酰异亮异亮GlnAsnIleGlutamineAsparagineIsoleucine 肽肽（肽键与肽（肽键与肽2)2)肽键就是由氨基酸的肽键就是由氨基酸的-羧基与相邻的氨基酸的羧基与相邻的氨基酸的-氨基脱水缩合而形成的氨基脱水缩合而形成的化学键化学键肽肽（肽键与肽（

28、肽键与肽3)3)肽肽:氨基酸通过肽键连结起来的化合物氨基酸通过肽键连结起来的化合物二肽二肽:两个氨基酸形成的肽两个氨基酸形成的肽三肽三肽:三个氨基酸形成的肽三个氨基酸形成的肽多肽多肽:许多氨基酸形成的肽许多氨基酸形成的肽蛋白质蛋白质:大多为大多为100100个以上氨基酸组成的多肽个以上氨基酸组成的多肽氨基酸残基氨基酸残基:多肽链中多肽链中不完全不完全的氨基酸。的氨基酸。氨基酸由于形成肽键而失去了一分子水，因氨基酸由于形成肽键而失去了一分子水，因此表现出其分子的不完整。此表现出其分子的不完整。氨基末端：氨基末端：多肽链中含有自由多肽链中含有自由-氨基的一氨基的一端。端。简称简称N-N-端端羧基末

29、端：羧基末端：多肽链中含有自由多肽链中含有自由-羧基的一羧基的一端。端。简称简称C-C-端端蛋白质的一级结构蛋白质的一级结构蛋白质的一级结构是指氨基酸按一定的顺序通过肽键蛋白质的一级结构是指氨基酸按一定的顺序通过肽键相连而成的多肽链，也是蛋白质最基本的结构相连而成的多肽链，也是蛋白质最基本的结构。每一种蛋白质分子都有自己特有的氨基酸的组成和排每一种蛋白质分子都有自己特有的氨基酸的组成和排列顺序即一级结构，由这种氨基酸排列顺序决定它的列顺序即一级结构，由这种氨基酸排列顺序决定它的特定的空间结构，也就是蛋白质的一级结构决定了蛋特定的空间结构，也就是蛋白质的一级结构决定了蛋白质的二级、三级等高级结构

30、白质的二级、三级等高级结构 。蛋白质分子的一级结构蛋白质分子的一级结构牛牛胰胰岛岛素素的的一一级级结结构构（1 1）氢氢键键：氢氢原原子子与与负负电电性性强强的的原原子子（如如氧氧、氮氮等等）间间形形成成。对对蛋蛋白白质质分分子子三三维构象的维护很重要。维构象的维护很重要。（2 2）静静电电引引力力：正正负负带带电电基基团团之之间间的的吸吸引引力力。对对蛋蛋白白质质分分子子三三维维构构象象的的稳稳定定贡贡献献不是很大不是很大，也称为离子键或盐键，也称为离子键或盐键（3 3）范范德德华华力力：原原子子团团相相互互接接近近时时诱诱导导所所致致。它它变变化化多多样样，对对维维持持蛋蛋白白质质活活性性

31、中中心的构象心的构象影响很大影响很大维持蛋白质空间结构的化学键维持蛋白质空间结构的化学键（4 4）疏疏水水相相互互作作用用：是是非非极极性性基基团团为为了了避避开开水水相相而而群群集集在在一一起起的的作作用用力力。疏疏水水作用是维持蛋白质高级结构的作用是维持蛋白质高级结构的重要因素重要因素（5 5）二二硫硫键键：作作用用很很强强，对对稳稳定定蛋蛋白白质质构象起重要作用构象起重要作用氢氢键键、离离子子键键、疏疏水水作作用用和和范范德德华华力力等次级键是非共价键等次级键是非共价键肽肽键键、二二硫硫键键、酯酯键键等等被被称称之之为为共共价价键键蛋白质二级结构蛋白质二级结构二级结构是指多肽链借助于氢键

32、沿一维方向排列二级结构是指多肽链借助于氢键沿一维方向排列成具有周期性结构的构象，是多肽链局部的空间成具有周期性结构的构象，是多肽链局部的空间结构（构象）结构（构象）主要形式：主要形式：-螺旋螺旋、-折叠折叠、-转角转角、无规卷曲无规卷曲等等-转角转角蛋白质分子的二级结构蛋白质分子的二级结构 螺旋螺旋折折叠片叠片转角转角自由自由回转回转三级结构三级结构三级结构是指整条多肽链在二级结构的基础上三级结构是指整条多肽链在二级结构的基础上进一步盘进一步盘曲而成特定格式的三级结构。曲而成特定格式的三级结构。四级结构四级结构很多蛋白质分子是由两个或两个以上独立的、具有三级很多蛋白质分子是由两个或两个以上独立

33、的、具有三级结构的多肽链组成的。结构的多肽链组成的。这些多肽链之间只是通过疏水作用等次级键结合成为有这些多肽链之间只是通过疏水作用等次级键结合成为有序排列的特定的空间结构，形成了四级结构。序排列的特定的空间结构，形成了四级结构。在四级结构的蛋白质分子中，每个具有三级结构的多肽在四级结构的蛋白质分子中，每个具有三级结构的多肽链单位称为亚基，亚基多无生物学活性，具有完整四级链单位称为亚基，亚基多无生物学活性，具有完整四级结构的蛋白质分子才有生物活性。结构的蛋白质分子才有生物活性。血红蛋白中四亚基两两相同，血红蛋白中四亚基两两相同，分别称为分别称为1、2、1、2四、蛋白质工程的主要研究方法四、蛋白质

34、工程的主要研究方法 1.1.蛋白质的分离纯化鉴定方法、结构分蛋白质的分离纯化鉴定方法、结构分析方法、功能研究方法和进行结构改造的分析方法、功能研究方法和进行结构改造的分子生物学研究方法子生物学研究方法 在这四类根据蛋白质工程的操作步骤而在这四类根据蛋白质工程的操作步骤而划分的主要研究方法中，蛋白质分离纯化鉴划分的主要研究方法中，蛋白质分离纯化鉴定方法与生物化学中的常规方法没有本质的定方法与生物化学中的常规方法没有本质的区别，是对许多结构、性质相似的一系列突区别，是对许多结构、性质相似的一系列突变蛋白质的分离、纯化和鉴定，但其难度要变蛋白质的分离、纯化和鉴定，但其难度要大得多，通常需要运用多种高

35、精度的方法才大得多，通常需要运用多种高精度的方法才能实现，如亲和层析、等电聚焦、免疫沉淀能实现，如亲和层析、等电聚焦、免疫沉淀等。等。2.2.蛋白质功能研究方法必须根据不同种类的蛋白质功能研究方法必须根据不同种类的蛋白质所具有的不同功能，相应地采用不同的研蛋白质所具有的不同功能，相应地采用不同的研究方法究方法 如对具有催化活性的蛋白质酶，则用酶学如对具有催化活性的蛋白质酶，则用酶学的稳态动力学方法；对抗体则用免疫学方法；其的稳态动力学方法；对抗体则用免疫学方法；其他蛋白质如激素、生长因子、受体类以及核酸结他蛋白质如激素、生长因子、受体类以及核酸结合类蛋白质都有相应的研究方法。所有这些蛋白合类蛋

36、白质都有相应的研究方法。所有这些蛋白质功能的研究中，建立一套高效、简便的蛋白质质功能的研究中，建立一套高效、简便的蛋白质功能测定方法是成功的关键。对特定的蛋白质，功能测定方法是成功的关键。对特定的蛋白质，如果能够找到特异专一性的检测方法，可以极大如果能够找到特异专一性的检测方法，可以极大地提高研究的效率。在分子生物学和蛋白质工程地提高研究的效率。在分子生物学和蛋白质工程研究中，对不同功能蛋白质特异性检测方法的研研究中，对不同功能蛋白质特异性检测方法的研究，也是重要的研究方向之一。究，也是重要的研究方向之一。（一）蛋白质结构分析方法（一）蛋白质结构分析方法 蛋白质结构分析方法主要是指与研究蛋白质

37、的蛋白质结构分析方法主要是指与研究蛋白质的空间结构有关的理论与技术。主要包括：空间结构有关的理论与技术。主要包括：蛋白质一级结构（即氨基酸序列）的测定方蛋白质一级结构（即氨基酸序列）的测定方法、蛋白质晶体学、核磁共振法、蛋白质折叠过法、蛋白质晶体学、核磁共振法、蛋白质折叠过程研究、蛋白质生物物理研究法以及蛋白质工程程研究、蛋白质生物物理研究法以及蛋白质工程的计算机辅助设计与模拟研究等。的计算机辅助设计与模拟研究等。1.1.蛋白质一级结构分析方法蛋白质一级结构分析方法 蛋白质一级结构研究，即氨基酸序列的测定，蛋白质一级结构研究，即氨基酸序列的测定，其原理是片段重叠、逐级降解、其原理是片段重叠、逐

38、级降解、cDNAcDNA以及质谱法以及质谱法等几种，其中片段重叠和逐级降解是最常用的方等几种，其中片段重叠和逐级降解是最常用的方法。法。2.2.蛋白质构象研究方法蛋白质构象研究方法 在蛋白质高级结构研究方面，在蛋白质高级结构研究方面，X X光衍射光衍射和三维核磁共振是蛋白质空间构象研究最主和三维核磁共振是蛋白质空间构象研究最主要的分析手段，分别用于对结晶蛋白质和溶要的分析手段，分别用于对结晶蛋白质和溶液中蛋白质空间构象的研究。液中蛋白质空间构象的研究。X X光衍射主要光衍射主要对结晶蛋白质的各向基团的空间排布进行分对结晶蛋白质的各向基团的空间排布进行分析，对蛋白质分子的整体空间构架研究作用析，

39、对蛋白质分子的整体空间构架研究作用很大。而三维核磁共振可以直接对水溶液中很大。而三维核磁共振可以直接对水溶液中的蛋白质结构进行分析，溶液中的空间构象的蛋白质结构进行分析，溶液中的空间构象更接近于生物体中的自然状态，更能反映蛋更接近于生物体中的自然状态，更能反映蛋白质在执行功能时的实际构象状态。白质在执行功能时的实际构象状态。3.3.蛋白质折叠过程研究方法蛋白质折叠过程研究方法 蛋白质折叠过程研究方法，也就是蛋白蛋白质折叠过程研究方法，也就是蛋白质折叠机理研究，是蛋白质化学及分子生物质折叠机理研究，是蛋白质化学及分子生物学最前沿的课题之一。学最前沿的课题之一。目前对蛋白质折叠研究主要通过对蛋白目

40、前对蛋白质折叠研究主要通过对蛋白质变性、复性过程的热力学和动力学的研究，质变性、复性过程的热力学和动力学的研究，以及对折叠中间体的研究而进行。以及对折叠中间体的研究而进行。变性、复性过程反映了蛋白质中肽链的变性、复性过程反映了蛋白质中肽链的折叠、卷曲过程。定量地观察、描述和研究折叠、卷曲过程。定量地观察、描述和研究蛋白质变性、复性过程，可以研究肽链的折蛋白质变性、复性过程，可以研究肽链的折叠过程。热力学研究反映了过程中的能量状叠过程。热力学研究反映了过程中的能量状态，动力学研究反映了折叠、卷曲过程与时态，动力学研究反映了折叠、卷曲过程与时间之间的关系。通过研究折叠中间体来研究间之间的关系。通过

41、研究折叠中间体来研究折叠途径也是一种常见的方法。折叠途径也是一种常见的方法。蛋白质从天然状态到变性状态，或从伸蛋白质从天然状态到变性状态，或从伸展状态折叠到天然构象，是一个渐变过程，展状态折叠到天然构象，是一个渐变过程，其间必然要经过许多中间过渡态，那些较为其间必然要经过许多中间过渡态，那些较为稳定的过渡态是折叠过程的限速步骤，这种稳定的过渡态是折叠过程的限速步骤，这种较为稳定的肽链构象称为折叠中间体，它可较为稳定的肽链构象称为折叠中间体，它可以有效地反映蛋白质的折叠途径。尽管绝大以有效地反映蛋白质的折叠途径。尽管绝大多数折叠中间体很不稳定，由于三维核磁共多数折叠中间体很不稳定，由于三维核磁共

42、振技术的发展，加上氢交换技术及快速混合振技术的发展，加上氢交换技术及快速混合技术的成熟，已经可以有效地研究这些中间技术的成熟，已经可以有效地研究这些中间体。体。4.4.蛋蛋白白质质生生物物物物理理研研究究方方法法及及计计算算机机结结构构模模拟拟研究研究 蛋白质的结构研究方法，除了以上的实验方蛋白质的结构研究方法，除了以上的实验方法以外，理论分子生物物理学方法也是重要的途法以外，理论分子生物物理学方法也是重要的途径之一。随着生物物理、化学以及数学学科的发径之一。随着生物物理、化学以及数学学科的发展，特别是分子力学、分子动力学的发展及其与展，特别是分子力学、分子动力学的发展及其与计算机信息处理技术

43、的结合与发展，利用蛋白质计算机信息处理技术的结合与发展，利用蛋白质分子内部及其周围环境原子之间的作用，以计算分子内部及其周围环境原子之间的作用，以计算机信息处理系统为工具，研究蛋白质的能量、结机信息处理系统为工具，研究蛋白质的能量、结构、热力学、动力学性质，进行蛋白质空间结构构、热力学、动力学性质，进行蛋白质空间结构规律研究和预测，取得了突破性的进展。规律研究和预测，取得了突破性的进展。理论分子物理学方法的建立，使蛋白质结构理论分子物理学方法的建立，使蛋白质结构的研究摆脱了必须完全依赖实验过程的传统模式，的研究摆脱了必须完全依赖实验过程的传统模式，开辟了利用计算机模拟研究的新思路，推动了蛋开辟

44、了利用计算机模拟研究的新思路，推动了蛋白质结构研究的进程。白质结构研究的进程。（二）分子生物学研究方法（二）分子生物学研究方法 基因工程方法，也称分子遗传学方法，基因工程方法，也称分子遗传学方法，是一类涉及遗传物质基因（是一类涉及遗传物质基因（DNADNA）的生物学）的生物学理论与操作技术，包括寡聚核苷酸（又称理论与操作技术，包括寡聚核苷酸（又称为寡核苷酸）片段及基因的人工合成、目为寡核苷酸）片段及基因的人工合成、目的基因的克隆与分析、目的基因的定位诱的基因的克隆与分析、目的基因的定位诱变或随机诱变、目的基因在载体系统中的变或随机诱变、目的基因在载体系统中的高效表达等高效表达等。1.1.寡聚核

45、苷酸片段及基因的人工合成寡聚核苷酸片段及基因的人工合成 由于由于DNADNA自动合成仪的广泛应用，寡聚自动合成仪的广泛应用，寡聚核苷酸片段及基因的合成，即核苷酸片段及基因的合成，即DNADNA的化学合的化学合成，现已经成为分子生物学及遗传工程、成，现已经成为分子生物学及遗传工程、蛋白质工程研究中的常规技术手段之一。蛋白质工程研究中的常规技术手段之一。无论从合成寡聚核苷酸片段的长度，还是无论从合成寡聚核苷酸片段的长度，还是合成的总量来说，都已经达到相当的规模合成的总量来说，都已经达到相当的规模水平。合成的产物水平。合成的产物DNADNA片段也有着多方面的片段也有着多方面的用途，除合成全基因或改造

46、基因这一基本用途，除合成全基因或改造基因这一基本用途外，还可用作探针筛选目标基因，作用途外，还可用作探针筛选目标基因，作为引物用于基因的定位诱变或聚合酶链式为引物用于基因的定位诱变或聚合酶链式反应（反应（PCRPCR），也可合成连接接头），也可合成连接接头（1inker1inker）用于基因末端改造等，还可以）用于基因末端改造等，还可以用于研究基因的调控及基因与其他生物大用于研究基因的调控及基因与其他生物大分子的相互作用。分子的相互作用。2.2.目的基因的克隆与分析目的基因的克隆与分析 应用于蛋白质工程中目的基因的克隆与分析应用于蛋白质工程中目的基因的克隆与分析技术，与常规基因工程中的方法没有

47、本质的差别。技术，与常规基因工程中的方法没有本质的差别。一般也包含下面几个基本部分：源一般也包含下面几个基本部分：源DNADNA的获得；的获得；DNADNA片段与克隆载体的体外连接；重组后载体引片段与克隆载体的体外连接；重组后载体引入宿主复制放大建立克隆基因库；筛选基因库，入宿主复制放大建立克隆基因库；筛选基因库，获得目的基因克隆；目的基因的结构分析。获得目的基因克隆；目的基因的结构分析。3.3.目的基因的定位诱变目的基因的定位诱变 定点突变（定点突变（site-directed mutagenesissite-directed mutagenesis）技术是对已知技术是对已知DNADNA序列

48、的基因或基因片段中任意指序列的基因或基因片段中任意指定位置进行突变的技术。它可以按照人们的意愿定位置进行突变的技术。它可以按照人们的意愿在指定的位置实现核苷酸的取代、插入或缺失。在指定的位置实现核苷酸的取代、插入或缺失。优点：比使用化学因素、自然因素导致突变优点：比使用化学因素、自然因素导致突变的方法具有突变率高、简单易行、重复性好的优的方法具有突变率高、简单易行、重复性好的优点，在蛋白质工程中主要应用于需要改变的氨基点，在蛋白质工程中主要应用于需要改变的氨基酸残基位置可以预先确定的情况下。酸残基位置可以预先确定的情况下。目前常用的定点突变方法：寡核苷酸引物介目前常用的定点突变方法：寡核苷酸引

49、物介导的定点突变、导的定点突变、PCRPCR介导的定点突变和盒式突变。介导的定点突变和盒式突变。（1 1）寡核苷酸引物介导的定点突变）寡核苷酸引物介导的定点突变 原理：用含有突变碱基的寡核苷酸片段作引物，在聚原理：用含有突变碱基的寡核苷酸片段作引物，在聚合酶的作用下启动合酶的作用下启动DNADNA分子进行复制，将引物中的突变引入分子进行复制，将引物中的突变引入到基因中（图）。到基因中（图）。步骤：步骤：将待突变基因克隆到突变载体上。将待突变基因克隆到突变载体上。制备含制备含突变基因的单链模板。突变基因的单链模板。引物与模板退火引物与模板退火55端磷酸化的突端磷酸化的突变寡核苷酸引物，与待突变的

50、核苷酸形成一小段碱基错配变寡核苷酸引物，与待突变的核苷酸形成一小段碱基错配的异源双链的的异源双链的DNADNA。合成突变链，在合成突变链，在DNADNA聚合酶的催化下，聚合酶的催化下，引物以单链引物以单链DNADNA为模板合成全民的互补链，而后由连接酶封为模板合成全民的互补链，而后由连接酶封闭缺口，产生闭环的异源双链的闭缺口，产生闭环的异源双链的DNADNA分子。分子。转化和初步筛转化和初步筛选异源双链选异源双链DNADNA分子转化大肠杆菌后，产生野生型、突变型分子转化大肠杆菌后，产生野生型、突变型的同源双链的同源双链DNADNA分子。可以用限制性酶切法、斑点杂交法和分子。可以用限制性酶切法、