基因组测序与分析.ppt

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1、西北农林科技大学农学院遗传教研组西北农林科技大学农学院遗传教研组主讲人：胡银岗主讲人：胡银岗第一节 基因组计划1 1、人类基因组计划简介、人类基因组计划简介、人类基因组计划简介、人类基因组计划简介 人类基因组计划准备用人类基因组计划准备用人类基因组计划准备用人类基因组计划准备用1515年时间，年时间，年时间，年时间，投入投入投入投入3030亿美元，完成人类全部亿美元，完成人类全部亿美元，完成人类全部亿美元，完成人类全部2424条条条条染色体的染色体的染色体的染色体的3103109 9脱氧核苷酸对脱氧核苷酸对脱氧核苷酸对脱氧核苷酸对(bp)(bp)的序列测定，主要任务包括作图的序列测定，主要任务

2、包括作图的序列测定，主要任务包括作图的序列测定，主要任务包括作图(遗传图谱、物理图谱的建立及转遗传图谱、物理图谱的建立及转遗传图谱、物理图谱的建立及转遗传图谱、物理图谱的建立及转录图谱的绘制录图谱的绘制录图谱的绘制录图谱的绘制)、测序和基因识别。、测序和基因识别。、测序和基因识别。、测序和基因识别。其中还包括模式生物其中还包括模式生物其中还包括模式生物其中还包括模式生物(如大肠杆菌、如大肠杆菌、如大肠杆菌、如大肠杆菌、酵母、线虫、小鼠等酵母、线虫、小鼠等酵母、线虫、小鼠等酵母、线虫、小鼠等)基因组的作基因组的作基因组的作基因组的作图和测序，以及信息系统的建立。图和测序，以及信息系统的建立。图和

3、测序，以及信息系统的建立。图和测序，以及信息系统的建立。作图作图作图作图和和和和测序测序测序测序是基本的任务，在此基是基本的任务，在此基是基本的任务，在此基是基本的任务，在此基础上解读和破译生物体生老病死以础上解读和破译生物体生老病死以础上解读和破译生物体生老病死以础上解读和破译生物体生老病死以及和疾病相关的遗传信息及和疾病相关的遗传信息及和疾病相关的遗传信息及和疾病相关的遗传信息基因组基因组 一个物种中所有基因的整体组成一个物种中所有基因的整体组成2.人类基因组测序策略采集采集5个自愿者的个自愿者的DNA样品样品构建构建3种不同插入子大小的基种不同插入子大小的基因组文库因组文库2Kb,10K

4、b和和50Kb完成约完成约完成约完成约27002700万次万次万次万次插入子末端测序插入子末端测序插入子末端测序插入子末端测序,总长总长总长总长14800Mb14800MbGeneBankGeneBank下载下载下载下载104018104018个个个个BACBAC末端末端末端末端顺序顺序顺序顺序PFPPFP发表的公开发表的公开发表的公开发表的公开数据主要为数据主要为数据主要为数据主要为BACBAC克隆的顺序克隆的顺序克隆的顺序克隆的顺序,共共共共4443.3Mb4443.3Mb随机测序与序列组装方法随机测序与序列组装方法指导测序与序列组装方法指导测序与序列组装方法相结合进行序列组装相结合进行序

5、列组装A.Celera Genomics 人类基因组人类基因组的测序策略的测序策略B 国际人类基因组测序策略国际人类基因组测序策略构建构建构建构建BACBAC克隆克隆克隆克隆 限制性限制性限制性限制性酶处酶处理理理理获获得指得指得指得指纹纹 根据指根据指根据指根据指纹纹重叠方法重叠方法重叠方法重叠方法组组建建建建BACBAC克隆重叠群克隆重叠群克隆重叠群克隆重叠群 根据根据根据根据STSSTS标记标记,将将将将BACBAC克隆重叠群克隆重叠群克隆重叠群克隆重叠群标标定在物理定在物理定在物理定在物理图图上上上上 每个每个每个每个BACBAC克隆内部采用克隆内部采用克隆内部采用克隆内部采用鸟枪鸟枪

6、法法法法测测序序序序,组组装装装装 将将将将BACBAC插入插入插入插入顺顺序与序与序与序与BACBAC克隆指克隆指克隆指克隆指纹纹极重叠群极重叠群极重叠群极重叠群对对比比比比,将已将已将已将已阅读阅读的的的的顺顺序序序序锚锚定到物理定到物理定到物理定到物理图图上上上上两种策略的比较两种策略的比较鸟枪法策略鸟枪法策略鸟枪法策略鸟枪法策略 指导测序指导测序指导测序指导测序策略策略策略策略不需背景信息不需背景信息不需背景信息不需背景信息 构建克隆群构建克隆群构建克隆群构建克隆群 (遗传、物理图谱遗传、物理图谱遗传、物理图谱遗传、物理图谱)时间短时间短时间短时间短 需要几年的时间需要几年的时间需要几

7、年的时间需要几年的时间 需要大型计算机需要大型计算机需要大型计算机需要大型计算机得到的是草图得到的是草图得到的是草图得到的是草图(Draft)(Draft)得到精细图谱得到精细图谱得到精细图谱得到精细图谱3.人类基因组研究的惊人发现 19号染色体号染色体是是含基因最丰富含基因最丰富的染色的染色体，而体，而13号染色体号染色体含基因量最少含基因量最少目前已经发现和定位了目前已经发现和定位了26000多个多个功能基因，其中尚有功能基因，其中尚有42%的基因尚的基因尚不知道功能不知道功能人类基因组中存在人类基因组中存在“热点热点”和大片和大片“荒漠荒漠”。在染色体上有基因成簇密。在染色体上有基因成簇

8、密集分布的区域，也有大片的区域只有集分布的区域，也有大片的区域只有“无用无用DNA”不包含或含有极少不包含或含有极少基因的成分。基因的成分。基因组上大约有基因组上大约有14的的区域没有基因的片段区域没有基因的片段。353的基因包含重复的序列的基因包含重复的序列。这说明那些原来被认为是这说明那些原来被认为是“垃圾垃圾”的的DNA也起重要作用，应该被进一步研也起重要作用，应该被进一步研究。究。4.单核苷酸多态性 人类人类人类人类99999 9的基因密码是相的基因密码是相的基因密码是相的基因密码是相同的同的同的同的，而，而，而，而差异不到差异不到差异不到差异不到0 01 1，不同人群仅有不同人群仅有

9、不同人群仅有不同人群仅有140140万个万个万个万个核苷酸核苷酸核苷酸核苷酸差异。这些差异是由差异。这些差异是由差异。这些差异是由差异。这些差异是由“单一单一单一单一核苷酸多样性核苷酸多样性核苷酸多样性核苷酸多样性”（SNPSNP）产）产）产）产生的，它构成了不同个体的生的，它构成了不同个体的生的，它构成了不同个体的生的，它构成了不同个体的遗传基础，个体的多样性被遗传基础，个体的多样性被遗传基础，个体的多样性被遗传基础，个体的多样性被认为是产生遗传疾病的原因。认为是产生遗传疾病的原因。认为是产生遗传疾病的原因。认为是产生遗传疾病的原因。在整个基因组序列中，在整个基因组序列中，在整个基因组序列中

10、，在整个基因组序列中，人与人与人与人与人之间的变异仅为万分之一人之间的变异仅为万分之一人之间的变异仅为万分之一人之间的变异仅为万分之一，从而说明从而说明从而说明从而说明人类不同人类不同人类不同人类不同“种属种属种属种属”之间并没有本质上的区别之间并没有本质上的区别之间并没有本质上的区别之间并没有本质上的区别。5.Shotgun测序及分析n nDNADNA的提取和纯化的提取和纯化的提取和纯化的提取和纯化n n载体预备：和载体预备：和载体预备：和载体预备：和DNADNA片断结合，从而能够在细菌中片断结合，从而能够在细菌中片断结合，从而能够在细菌中片断结合，从而能够在细菌中扩增。扩增。扩增。扩增。n

11、 nDNADNA片段的制备：将片段的制备：将片段的制备：将片段的制备：将DNADNA用超声波切成能够测序用超声波切成能够测序用超声波切成能够测序用超声波切成能够测序的小片断的小片断的小片断的小片断n n转化培养：小片断和载体结合，植入细菌中进行转化培养：小片断和载体结合，植入细菌中进行转化培养：小片断和载体结合，植入细菌中进行转化培养：小片断和载体结合，植入细菌中进行扩增。扩增。扩增。扩增。n n提质粒：从细菌中提取出繁殖好的质粒提质粒：从细菌中提取出繁殖好的质粒提质粒：从细菌中提取出繁殖好的质粒提质粒：从细菌中提取出繁殖好的质粒n n电泳检测：检测质量的好坏电泳检测：检测质量的好坏电泳检测：

12、检测质量的好坏电泳检测：检测质量的好坏n n测序：上测序仪测序测序：上测序仪测序测序：上测序仪测序测序：上测序仪测序DNA整体整体切成切成小段小段小段和载体结合小段和载体结合结合后进行测序结合后进行测序还没有完！拼接！还没有完！拼接！n n因为整个基因组太长（上因为整个基因组太长（上M),而每次只能测而每次只能测得一个得一个500的小片断的小片断(read)n n问题：如何根据问题：如何根据read恢复原始顺序？恢复原始顺序？n n类比：类比：10本圣经，都从随机点起始剪成本圣经，都从随机点起始剪成500个字母左右的小纸条，问：给你这么一堆个字母左右的小纸条，问：给你这么一堆小纸条，你能读出圣

13、经来吗？小纸条，你能读出圣经来吗？n n但是都会拼错！但是都会拼错！Shotgun法序列拼接法序列拼接ConsensusConsensusSequenceSequenceGapGap Low Base Low Base QualityQualitySingleSingleStrandedStrandedRegionRegionMis-AssemblyMis-Assembly(Inverted)(Inverted)拼接错误：拼接错误：Repeat的存在的存在实例:流感嗜血杆菌基因组的测序及顺序组装超声波打断纯化的基因组超声波打断纯化的基因组超声波打断纯化的基因组超声波打断纯化的基因组DNADNA

14、 琼琼脂糖脂糖脂糖脂糖电电泳收集泳收集泳收集泳收集1.61.62.0Kb2.0Kb2.0Kb2.0Kb的的的的区区区区段、段、段、段、纯纯纯纯化化化化 构构构构建到建到建到建到质质质质粒粒粒粒载载载载体中体中体中体中 随随随随机挑机挑机挑机挑选选选选1968719687个个个个克隆克隆克隆克隆,进进进进行行行行2864328643次次次次测测测测序序序序,得到可得到可得到可得到可读读读读顺顺顺顺序序序序为为为为11 631 485 bp11 631 485 bp 组组组组装成装成装成装成140140个个个个覆盖全基因覆盖全基因覆盖全基因覆盖全基因组组组组范范范范围围围围的的的的独独独独立的立的

15、立的立的顺顺顺顺序重序重序重序重叠叠叠叠群群群群,各重各重各重各重叠叠叠叠群群群群间间间间仍有仍有仍有仍有间间间间隙隙隙隙 顺顺顺顺序序序序间间间间隙隙隙隙 物理物理物理物理间间间间隙隙隙隙 载体或宿主菌载体或宿主菌载体或宿主菌载体或宿主菌 选用不当而被丢失选用不当而被丢失选用不当而被丢失选用不当而被丢失的序列的序列的序列的序列测序时遗漏的测序测序时遗漏的测序测序时遗漏的测序测序时遗漏的测序解决办法解决办法:通过相邻已知通过相邻已知顺序作为探针筛选已有顺序作为探针筛选已有的基因组文库的基因组文库解决办法解决办法:利用其它宿主菌利用其它宿主菌与载体重新构建文库与载体重新构建文库运用计算机软件进行

16、序列拼接运用计算机软件进行序列拼接Francis Collins VS.J.Craig Venter6.基因识别基因识别 n n基因识别（基因识别（gene identification）是）是HGP的重要内容之一，其目的是识别全部人的重要内容之一，其目的是识别全部人类的基因。类的基因。n n基因识别包括：基因识别包括：识别基因组编码区识别基因组编码区识别基因结构识别基因结构n n基因识别目前常采用的有二种方法：基因识别目前常采用的有二种方法：从基因组序列中识别转录表达的从基因组序列中识别转录表达的DNA片段片段从从cDNA文库中挑取并克隆。文库中挑取并克隆。7.模式生物的基因组测序模式生物的

17、基因组测序酵母大肠杆菌果蝇线虫老鼠 水稻基因组测序水稻基因组测序水稻是全球半数以上人口的主食，水稻是全球半数以上人口的主食，水稻是全球半数以上人口的主食，水稻是全球半数以上人口的主食，对解决全球粮食问题具有重要意义。对解决全球粮食问题具有重要意义。对解决全球粮食问题具有重要意义。对解决全球粮食问题具有重要意义。20022002年我国科学家完成了水稻基因年我国科学家完成了水稻基因年我国科学家完成了水稻基因年我国科学家完成了水稻基因组定序和初步分析组定序和初步分析组定序和初步分析组定序和初步分析。出人意料的是，。出人意料的是，。出人意料的是，。出人意料的是，水稻的基因竟比人类基因还要多得水稻的基因

18、竟比人类基因还要多得水稻的基因竟比人类基因还要多得水稻的基因竟比人类基因还要多得多。多。多。多。人类基因大约有人类基因大约有人类基因大约有人类基因大约有3 3万多个万多个万多个万多个，水稻水稻水稻水稻有有有有4 4万多个基因万多个基因万多个基因万多个基因。水稻基因组可说是继人类基因组之水稻基因组可说是继人类基因组之水稻基因组可说是继人类基因组之水稻基因组可说是继人类基因组之后，完成定序的最大基因组，也是后，完成定序的最大基因组，也是后，完成定序的最大基因组，也是后，完成定序的最大基因组，也是至今已知最大的植物基因组。至今已知最大的植物基因组。至今已知最大的植物基因组。至今已知最大的植物基因组。

19、8.人类基因组计划对医学事业的影响人类基因组计划对医学事业的影响 促进对致病基因的克隆促进对致病基因的克隆疾病的预测与诊断疾病的预测与诊断如果掌握了与某种疾病相关的基因及突变，则如果掌握了与某种疾病相关的基因及突变，则如果掌握了与某种疾病相关的基因及突变，则如果掌握了与某种疾病相关的基因及突变，则可以对该疾病进行预测、诊断。可以对该疾病进行预测、诊断。可以对该疾病进行预测、诊断。可以对该疾病进行预测、诊断。基因疗法的发展与应用基因疗法的发展与应用通过生物学、医学等技术对疾病相关基因进行通过生物学、医学等技术对疾病相关基因进行通过生物学、医学等技术对疾病相关基因进行通过生物学、医学等技术对疾病相

20、关基因进行抑制或调控，即可达到治疗某一疾病的效果。抑制或调控，即可达到治疗某一疾病的效果。抑制或调控，即可达到治疗某一疾病的效果。抑制或调控，即可达到治疗某一疾病的效果。基因变异与疾病基因变异与疾病第二节第二节 DNA DNA片段组装片段组装大规模基因组测序大规模基因组测序得到待测序列的一系列序列片段得到待测序列的一系列序列片段这些序列片段覆盖待测序列这些序列片段覆盖待测序列序列片段之间也存在着相互覆盖或者重叠。序列片段之间也存在着相互覆盖或者重叠。目标序列目标序列序列碎片序列碎片（1）碱基标识错误）碱基标识错误1.片段组装的片段组装的4个主要问题个主要问题（2）不知道片段的方向）不知道片段的

21、方向（3）存在重复区域）存在重复区域（4）缺少覆盖（）缺少覆盖（gap）2、序列片段组装过程、序列片段组装过程序列片段组装过程三个步骤：序列片段组装过程三个步骤：序列片段组装过程三个步骤：序列片段组装过程三个步骤：首先进行序列片段的两两比较，确定可能的片段首先进行序列片段的两两比较，确定可能的片段首先进行序列片段的两两比较，确定可能的片段首先进行序列片段的两两比较，确定可能的片段之间的覆盖（或者重叠）；之间的覆盖（或者重叠）；之间的覆盖（或者重叠）；之间的覆盖（或者重叠）；确定所有片段统一的覆盖模式，即确定各个序列确定所有片段统一的覆盖模式，即确定各个序列确定所有片段统一的覆盖模式，即确定各个

22、序列确定所有片段统一的覆盖模式，即确定各个序列片段的相对位置；片段的相对位置；片段的相对位置；片段的相对位置；最后确定片段组装结果，即确定目标序列。最后确定片段组装结果，即确定目标序列。最后确定片段组装结果，即确定目标序列。最后确定片段组装结果，即确定目标序列。1、基因组、基因组DNA的奥秘的奥秘u 遗传信息存贮在遗传信息存贮在4种字符组成的核酸序列中种字符组成的核酸序列中 u“天书天书”用遗传语言书写的人类遗传蓝本用遗传语言书写的人类遗传蓝本包含的信息量巨大包含的信息量巨大更重要的是目前人类对它了解甚少更重要的是目前人类对它了解甚少天书中只有天书中只有4个字符（碱基个字符（碱基A、T、G、C

23、）既没有段落，也没有标点符号既没有段落，也没有标点符号是一个长度为是一个长度为3109的一维序列。的一维序列。第三节第三节 基因组基因组DNA序列分析序列分析 科学家对这本天书了解最多的部分就是遗传密码科学家对这本天书了解最多的部分就是遗传密码密码子的特点密码子的特点（1）密码子的使用是非随机的）密码子的使用是非随机的 如果密码子的第一、第二位碱基是如果密码子的第一、第二位碱基是A、U，那么第，那么第三位将尽可能使用三位将尽可能使用G、C；反之亦然。；反之亦然。如果三位都用如果三位都用G、C，则配对容易，分解难；三位，则配对容易，分解难；三位都用都用A、U，则相反。，则相反。一般地说，高表达的

24、基因，要求翻译速度快，要求一般地说，高表达的基因，要求翻译速度快，要求密码子和反密码子配对快、分手也快。密码子和反密码子配对快、分手也快。（2）密码子的使用有一定的统计规律）密码子的使用有一定的统计规律 对同义密码子的使用存在着偏爱对同义密码子的使用存在着偏爱不同种属偏爱的密码子不同不同种属偏爱的密码子不同 人类基因组：人类基因组：密码子第三位取密码子第三位取A、U的情况占的情况占90%而第三位取而第三位取G、C仅占仅占10%密码子的使用偏爱性与密码子的使用偏爱性与基因功能基因功能 蛋白质结构蛋白质结构相关相关（3）密码子中的密码）密码子中的密码 三个碱基的位置与所编码的氨基酸性质存在着联系三

25、个碱基的位置与所编码的氨基酸性质存在着联系例如：例如：芳香族氨基酸芳香族氨基酸u以以U作为第一位碱基作为第一位碱基u中间位置碱基的性质与氨基酸是亲疏水性相关中间位置碱基的性质与氨基酸是亲疏水性相关u疏水氨基酸的密码子，其第二位碱基是疏水氨基酸的密码子，其第二位碱基是Uu亲水氨基酸的密码子，其第二位碱基是亲水氨基酸的密码子，其第二位碱基是Au第二位碱基是第二位碱基是G、C的密码子所编码的氨基酸亲水的密码子所编码的氨基酸亲水性、疏水性居中。性、疏水性居中。基因组信息基因组信息人类基因组：人类基因组：编码区域只占编码区域只占1%-3%对于非编码序列，尚不清楚其含义或功能对于非编码序列，尚不清楚其含义

26、或功能 非编码区域对于生命活动具有重要的意义非编码区域对于生命活动具有重要的意义包括包括内含子内含子、简单重复序列、移动元件、伪基因、简单重复序列、移动元件、伪基因 重复序列重复序列:u 卫星（卫星（satellite）DNAu 小卫星（小卫星（mini-satellite）DNAu 微卫星（微卫星（micro-satellite）顺式调控元件顺式调控元件:启动子、增强子、沉默子启动子、增强子、沉默子2、探索遗传语言、探索遗传语言 用语言学的方法进行研究用语言学的方法进行研究自然语言自然语言计算机程序设计语言计算机程序设计语言遗传语言遗传语言n 二进制序列二进制序列0、1的长程关联性分析结果：

27、的长程关联性分析结果：编码区域编码区域 自然语言自然语言蛋白质编码区域所包含的信息相当于待加工的蛋白质编码区域所包含的信息相当于待加工的“数据数据”，数，数据经过加工处理以后产生对应的蛋白质；据经过加工处理以后产生对应的蛋白质；非编码区域非编码区域 程序设计语言程序设计语言而非编码区域则相当于而非编码区域则相当于“程序程序”或或“指令指令”，确定如何在时，确定如何在时间和空间方面控制基因的表达和蛋白质的合成间和空间方面控制基因的表达和蛋白质的合成 n 用密码学方法进行研究用密码学方法进行研究是否存在其它密码？是否存在其它密码？调控信息密码？调控信息密码？蛋白质结构的密码？蛋白质结构的密码？n

28、编码在编码在DNA上的一维程序如何在四维时空中上的一维程序如何在四维时空中控制生命体的生长发育？控制生命体的生长发育？3、关于生物复杂性、关于生物复杂性生物的复杂性不仅仅是基因的数目生物的复杂性不仅仅是基因的数目人类基因约为人类基因约为30000个个线虫有线虫有20000个基因个基因230000/220000=210000103000 4、基因组计划带来的希望、基因组计划带来的希望n 实验数据的积累速度在迅速地增加实验数据的积累速度在迅速地增加n 计算机科学和技术也在不断地发展计算机科学和技术也在不断地发展 单个基因组分析单个基因组分析基因序列基因序列基因功能基因功能基因的表达调控基因的表达调

29、控基因产物基因产物基因多态性基因多态性比较基因组分析比较基因组分析物种关系物种关系物种进化物种进化物种起源物种起源人、鼠基因组比较人、鼠基因组比较 人基因组人基因组 鼠基因组鼠基因组 注：鼠染色体上的颜色和数字代表在人染色体上对应的片段。注：鼠染色体上的颜色和数字代表在人染色体上对应的片段。老鼠约老鼠约75%的基因的基因与人类相同。与人类相同。第四节第四节 基因组序列诠释基因组序列诠释问问 题题n n基因组序列所包含的全部遗传信息是什么？基因组序列所包含的全部遗传信息是什么？基因组序列所包含的全部遗传信息是什么？基因组序列所包含的全部遗传信息是什么？n n基因组作为一个整体如何行使其功能？基因

30、组作为一个整体如何行使其功能？基因组作为一个整体如何行使其功能？基因组作为一个整体如何行使其功能？n n用什么方法寻找基因，研究基因地功能呢？用什么方法寻找基因，研究基因地功能呢？用什么方法寻找基因，研究基因地功能呢？用什么方法寻找基因，研究基因地功能呢？主要内容主要内容uu寻找基因寻找基因uu获取基因的全长获取基因的全长cDNA序列序列uu确定确定DNA顺序中基因的位置顺序中基因的位置uu研究基因的功能研究基因的功能uu基因表达基因表达uu蛋白质组学蛋白质组学1.寻找基因寻找基因1.1 1.1 根据开放读码框预测基因根据开放读码框预测基因uu 起始密码子起始密码子 ATGn n第一个第一个第

31、一个第一个ATGATG的确定则依据的确定则依据的确定则依据的确定则依据KozakKozak规则（基于已知规则（基于已知规则（基于已知规则（基于已知数据的统计结果，即第一个数据的统计结果，即第一个数据的统计结果，即第一个数据的统计结果，即第一个ATGATG侧翼序列的碱基侧翼序列的碱基侧翼序列的碱基侧翼序列的碱基分布所满足的统计规律。）分布所满足的统计规律。）分布所满足的统计规律。）分布所满足的统计规律。）n n若将第一个若将第一个若将第一个若将第一个ATGATG中的碱基中的碱基中的碱基中的碱基A A，T T，GG分别标为分别标为分别标为分别标为1 1，2 2，3 3位，则位，则位，则位，则Koz

32、akKozak规则规则规则规则可描述如下：可描述如下：可描述如下：可描述如下：第第第第4 4位的偏好碱基为位的偏好碱基为位的偏好碱基为位的偏好碱基为GG；ATGATG的的的的5 5端约端约端约端约15bp15bp范围的侧翼序列内不含碱基范围的侧翼序列内不含碱基范围的侧翼序列内不含碱基范围的侧翼序列内不含碱基T T；在在在在-3-3，-6-6和和和和-9-9位置，位置，位置，位置，GG是偏好碱基；是偏好碱基；是偏好碱基；是偏好碱基；除除除除-3-3，-6-6和和和和-9-9位，在整个侧翼序列区，位，在整个侧翼序列区，位，在整个侧翼序列区，位，在整个侧翼序列区，C C是偏好碱基。是偏好碱基。是偏好

33、碱基。是偏好碱基。uu信号肽分析 信号肽分析软件信号肽分析软件(SignalP http:/)把预测过程中证实含完整把预测过程中证实含完整把预测过程中证实含完整把预测过程中证实含完整mRNA 5mRNA 5端的端的端的端的ContigContig翻译为蛋白序列翻译为蛋白序列翻译为蛋白序列翻译为蛋白序列;然后用然后用然后用然后用SignalPSignalP软件对前软件对前软件对前软件对前5050个氨基酸序列个氨基酸序列个氨基酸序列个氨基酸序列(从第从第从第从第一个一个一个一个ATGATG对应的甲硫氨酸对应的甲硫氨酸对应的甲硫氨酸对应的甲硫氨酸MetMet开始开始开始开始)进行评估，进行评估，进行

34、评估，进行评估，如果如果如果如果SignalPSignalP分析给出正面结果，则测试序列有分析给出正面结果，则测试序列有分析给出正面结果，则测试序列有分析给出正面结果，则测试序列有可能为信号肽可能为信号肽可能为信号肽可能为信号肽;假如在该测试序列的第一个假如在该测试序列的第一个假如在该测试序列的第一个假如在该测试序列的第一个Met 5Met 5端存在端存在端存在端存在终止终止终止终止密码子密码子密码子密码子，该序列为信号肽的可能性更大。，该序列为信号肽的可能性更大。，该序列为信号肽的可能性更大。，该序列为信号肽的可能性更大。u终止密码子终止密码子终止密码子终止密码子 终止密码子终止密码子终止密

35、码子终止密码子:TAA,TAG,TGA:TAA,TAG,TGA GC%=50%GC%=50%终止密码子每终止密码子每终止密码子每终止密码子每 64 64 bpbp出现一次；出现一次；出现一次；出现一次；GC%50%GC%50%终止密码子每终止密码子每终止密码子每终止密码子每100100200 200 bpbp 出现一次；出现一次；出现一次；出现一次；由于多数基因由于多数基因由于多数基因由于多数基因 ORF ORF 均多于均多于均多于均多于5050个密码子，因此最可能的选择应该是个密码子，因此最可能的选择应该是个密码子，因此最可能的选择应该是个密码子，因此最可能的选择应该是 ORF ORF 不少

36、于不少于不少于不少于100 100 个密码子。个密码子。个密码子。个密码子。uu 3 3端的确认端的确认端的确认端的确认 3 3端的确认主要根据端的确认主要根据端的确认主要根据端的确认主要根据Poly(APoly(A)尾序列尾序列尾序列尾序列,若测试若测试若测试若测试ContigContig不含不含不含不含Poly(APoly(A)序列，序列，序列，序列，则根据加尾信号序列则根据加尾信号序列则根据加尾信号序列则根据加尾信号序列“AATAAAAATAAA”和和和和BLASTBLAST同源性比较结果共同判断。同源性比较结果共同判断。同源性比较结果共同判断。同源性比较结果共同判断。uu 非编码序列、

37、内含子非编码序列、内含子 高等真核生物多数外显子长度不少于高等真核生物多数外显子长度不少于高等真核生物多数外显子长度不少于高等真核生物多数外显子长度不少于100 100 个密码个密码个密码个密码子，有的不到子，有的不到子，有的不到子，有的不到5050个密码子甚至更少；个密码子甚至更少；个密码子甚至更少；个密码子甚至更少；uu 密码子偏爱性密码子偏爱性 编码同一氨基酸的不同密码子称为同义密码，编码同一氨基酸的不同密码子称为同义密码，编码同一氨基酸的不同密码子称为同义密码，编码同一氨基酸的不同密码子称为同义密码，其差别仅在密码子的第其差别仅在密码子的第其差别仅在密码子的第其差别仅在密码子的第3 3

38、位碱基不同。位碱基不同。位碱基不同。位碱基不同。不同种属间使用同义密码的频率有很大差异，不同种属间使用同义密码的频率有很大差异，不同种属间使用同义密码的频率有很大差异，不同种属间使用同义密码的频率有很大差异，如人类基因中，丙氨酸（如人类基因中，丙氨酸（如人类基因中，丙氨酸（如人类基因中，丙氨酸（AleAle）密码子多为）密码子多为）密码子多为）密码子多为GCAGCA，GCCGCC或或或或GCTGCT，而，而，而，而GCGGCG很少使用很少使用很少使用很少使用。uu外显子内含子边界 外显子和内含子的边界有一些明显的特征，如：外显子和内含子的边界有一些明显的特征，如：外显子和内含子的边界有一些明显

39、的特征，如：外显子和内含子的边界有一些明显的特征，如：内含子的内含子的内含子的内含子的5 5端或称供体位（端或称供体位（端或称供体位（端或称供体位（donor sitedonor site）常见的顺序为常见的顺序为常见的顺序为常见的顺序为 5 5AGAG GTTAAGT-3GTTAAGT-3；3 3端又称受体位（端又称受体位（端又称受体位（端又称受体位（acceptor site),acceptor site),多为多为多为多为5PyPyPyPyPyPyCAG-5PyPyPyPyPyPyCAG-3(“Py”3(“Py”嘧啶核苷酸，嘧啶核苷酸，嘧啶核苷酸，嘧啶核苷酸，T T或或或或C)C)；uu

40、上游控制顺序上游控制顺序几乎所有基因（或操纵子）上游都有调控序列，它们可与几乎所有基因（或操纵子）上游都有调控序列，它们可与几乎所有基因（或操纵子）上游都有调控序列，它们可与几乎所有基因（或操纵子）上游都有调控序列，它们可与DNADNA结合蛋白作用，控制基因表达。结合蛋白作用，控制基因表达。结合蛋白作用，控制基因表达。结合蛋白作用，控制基因表达。另外个别生物的基因组特有组成也可作为判别依据，如脊椎另外个别生物的基因组特有组成也可作为判别依据，如脊椎另外个别生物的基因组特有组成也可作为判别依据，如脊椎另外个别生物的基因组特有组成也可作为判别依据，如脊椎动物基因组许多基因的上游都有动物基因组许多基

41、因的上游都有动物基因组许多基因的上游都有动物基因组许多基因的上游都有CpGCpG岛。岛。岛。岛。1.2 mRNA的的5端即转录起始位点区端即转录起始位点区 通过同源性比较来预测通过同源性比较来预测通过同源性比较来预测通过同源性比较来预测mRNAmRNA的的的的5 5端，最常端，最常端，最常端，最常用的与转录起始位点相关的数据库是真核启动用的与转录起始位点相关的数据库是真核启动用的与转录起始位点相关的数据库是真核启动用的与转录起始位点相关的数据库是真核启动子数据库。子数据库。子数据库。子数据库。The TRADAT Project,Eukaryotic Promoter The TRADAT P

42、roject,Eukaryotic Promoter Database,EPD.(http:/)Database,EPD.(http:/)1.3 1.3 1.3 1.3 同源查询途径同源查询途径同源查询途径同源查询途径 通过已存入数据库中的基因顺序与待查的基因组序列通过已存入数据库中的基因顺序与待查的基因组序列通过已存入数据库中的基因顺序与待查的基因组序列通过已存入数据库中的基因顺序与待查的基因组序列进行比较，从中查找可与之匹配的碱基顺序及其比例，用进行比较，从中查找可与之匹配的碱基顺序及其比例，用进行比较，从中查找可与之匹配的碱基顺序及其比例，用进行比较，从中查找可与之匹配的碱基顺序及其比例

43、，用于界定基因的方法称为同源查询。于界定基因的方法称为同源查询。于界定基因的方法称为同源查询。于界定基因的方法称为同源查询。同源有如下几种情况：同源有如下几种情况：同源有如下几种情况：同源有如下几种情况：DNA DNA序列某些片段完全相同；序列某些片段完全相同；序列某些片段完全相同；序列某些片段完全相同；开放读码框（开放读码框（开放读码框（开放读码框（ORFORF）排列类似，如有长外显子；）排列类似，如有长外显子；）排列类似，如有长外显子；）排列类似，如有长外显子；开放读码框翻译成氨基酸序列的相似性；开放读码框翻译成氨基酸序列的相似性；开放读码框翻译成氨基酸序列的相似性；开放读码框翻译成氨基酸

44、序列的相似性；模拟多肽高级结构相似模拟多肽高级结构相似模拟多肽高级结构相似模拟多肽高级结构相似 1.4 试验分析试验分析uuNorthern Northern 杂交确定杂交确定杂交确定杂交确定DNADNA片段是表达序列：片段是表达序列：片段是表达序列：片段是表达序列：注意事项：注意事项：注意事项：注意事项：当某一基因的转录产物进行可变剪接时，由于连接的当某一基因的转录产物进行可变剪接时，由于连接的当某一基因的转录产物进行可变剪接时，由于连接的当某一基因的转录产物进行可变剪接时，由于连接的外显子不同，会产生好几条长度不一的杂交带，如果外显子不同，会产生好几条长度不一的杂交带，如果外显子不同，会产

45、生好几条长度不一的杂交带，如果外显子不同，会产生好几条长度不一的杂交带，如果该基因是某一基因家族的成员也会出现多个信息；该基因是某一基因家族的成员也会出现多个信息；该基因是某一基因家族的成员也会出现多个信息；该基因是某一基因家族的成员也会出现多个信息；考虑组织专一性和发育阶段的问题；考虑组织专一性和发育阶段的问题；考虑组织专一性和发育阶段的问题；考虑组织专一性和发育阶段的问题；基因表达产物丰度的问题基因表达产物丰度的问题基因表达产物丰度的问题基因表达产物丰度的问题l l如果丰度较低，用拟如果丰度较低，用拟如果丰度较低，用拟如果丰度较低，用拟Northern Northern 杂交和动物杂交（杂

46、交和动物杂交（杂交和动物杂交（杂交和动物杂交（Zoo-Zoo-blottingblotting）分析；）分析；）分析；）分析；l l拟拟拟拟Northern Northern 杂交杂交杂交杂交 根据已知的根据已知的根据已知的根据已知的DNADNA顺序设计引物，从顺序设计引物，从顺序设计引物，从顺序设计引物，从mRNAmRNA群体中扩增基因产物，再以群体中扩增基因产物，再以群体中扩增基因产物，再以群体中扩增基因产物，再以DNADNA为探针与之杂交。为探针与之杂交。为探针与之杂交。为探针与之杂交。2 获取基因全长获取基因全长cDNA序列序列构建构建cDNA文库，用目的基因文库，用目的基因DNA片段

47、筛片段筛选文库。选文库。根据已知片段设计引物，根据已知片段设计引物，RACE 技术得到技术得到基因的全长基因的全长cDNA序列。序列。3.确定确定DNA顺序中基因的位置顺序中基因的位置通过对全长通过对全长cDNA序列的测序、对比，序列的测序、对比，以及与基因组以及与基因组DNA的比较，确定基因所的比较，确定基因所在的区域；在的区域；通过物种已建立遗传图和物理图来确定通过物种已建立遗传图和物理图来确定基因的位置；基因的位置；4.研究基因的表达研究基因的表达uu功能基因组学研究功能基因组学研究功能基因组学研究功能基因组学研究uu基因的差异表达基因的差异表达基因的差异表达基因的差异表达uucDNAc

48、DNA/AFLP/AFLPuuDDRT-PCRDDRT-PCRuu基因表达的整体分析基因表达的整体分析基因表达的整体分析基因表达的整体分析uu基因芯片基因芯片基因芯片基因芯片uuSAGESAGE（基因表达的序列分析）（基因表达的序列分析）（基因表达的序列分析）（基因表达的序列分析）5.基因的功能基因的功能uu构建相应的表达载体构建相应的表达载体uu原核表达载体系统原核表达载体系统原核表达载体系统原核表达载体系统uu真核表达载体系统真核表达载体系统真核表达载体系统真核表达载体系统uu建立相应的突变体库建立相应的突变体库uu代谢途径代谢途径代谢途径代谢途径uu基因产物基因产物基因产物基因产物6.蛋白质组学蛋白质组学n n蛋白组学研究n n蛋白质的分离纯化n n基本技术2D电泳n n蛋白质测序与序列分析思思 考考 题题1.简述基因组测序的基本策略简述基因组测序的基本策略2.简述序列组装拼接的基本原理，及基简述序列组装拼接的基本原理，及基因组序列拼接中应注意的问题因组序列拼接中应注意的问题3.基因组序列注解的内容有哪些？基因组序列注解的内容有哪些？4.基因组序列分析都包括哪些方面？基因组序列分析都包括哪些方面？5.后基因组时代的主要任务是什么后基因组时代的主要任务是什么？