基因工程制药技术.ppt

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1、重重组组DNA技技术术是是在在分分子子水水平平对对基基因因进进行行体体外外 操操 作作，因因 而而 也也 称称 为为 分分 子子 克克 隆隆(molecularcloning)或基因克隆。或基因克隆。所所谓谓克克隆隆(clone)：是是指指通通过过无无性性繁繁殖殖过过程程所产生的与亲代完全相同的子代群体。所产生的与亲代完全相同的子代群体。分分子子克克隆隆：是是在在体体外外对对DNA分分子子按按照照既既定定的的目目的的和和方方案案进进行行人人工工重重组组，将将重重组组分分子子导导入入到到合合适适的的受受体体细细胞胞中中，使使其其在在细细胞胞中中扩扩增增和和繁繁殖殖，以以获获得得DNA分分子子大大

2、量量复复制制，并使受体细胞获得新得遗传特征的过程并使受体细胞获得新得遗传特征的过程基基因因工工程程：利利用用分分子子克克隆隆技技术术来来操操作作目目的的基基因因，并并改改变变生生物物的的遗遗传传性性状状的的过过程程就就称称为基因工程。为基因工程。基因工程最基本的必备的材料：基因工程最基本的必备的材料：工具酶工具酶载体载体目的基因目的基因原核或真核宿主细胞原核或真核宿主细胞分子克隆的基本过程分子克隆的基本过程:n分分：得到目的基因：得到目的基因n切切：将目的基因和载体用适当的限制性内切：将目的基因和载体用适当的限制性内切酶切割酶切割n接接：将目的基因和载体连接，形成重组子：将目的基因和载体连接，

3、形成重组子n转转：将重组子转到适当的宿主细胞中：将重组子转到适当的宿主细胞中n筛筛：筛选出含正确重组子的宿主细胞，扩增：筛选出含正确重组子的宿主细胞，扩增第一节第一节 基因工程中常用工具酶基因工程中常用工具酶工具酶分类工具酶分类1.使使核核酸酸降降解解的的核核酸酸酶酶类类：核核酸酸内内切切酶酶、核核酸酸外切酶外切酶2.催催化化核核酸酸合合成成的的酶酶类类：DNA聚聚合合酶酶，RNA聚合酶，连接酶，逆转录酶聚合酶，连接酶，逆转录酶3.核酸核酸修饰修饰酶类：甲基化酶，激酶，基团转移酶类：甲基化酶，激酶，基团转移酶，酶，磷酸酶等磷酸酶等一、限制性核酸内切酶概念的提出及背景：概念的提出及背景：30年年

4、代代初初，微微生生物物学学家家发发现现，微微生生物物的的噬噬菌菌体体不能交叉感染（不能交叉感染（“细菌免疫细菌免疫”）。）。限制现象（限制现象（限制性内切酶限制性内切酶）修饰现象（修饰现象（甲基化酶甲基化酶）1962年年W.Arber提提出出；菌菌体体中中含含有有2种种以以上上功功能能不同的酶：不同的酶：核酸内切酶（核酸内切酶（限制限制）DNA甲基化酶甲基化酶（修饰修饰）n限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶(restriction endonuclease，RE)是由细菌自己产生的一种能是由细菌自己产生的一种能识别识别双链双链DNA中的特定序列，并以中的特定序列，并以内切方式水解内切方式水解核酸

5、核酸中磷酸二酯键的核酸内切酶。中磷酸二酯键的核酸内切酶。1限制性核酸内切酶的分类：限制性核酸内切酶的分类：I型型RE：由由三三种种不不同同的的亚亚基基组组成成。需需Mg+，S-腺腺苷苷甲甲硫硫氨氨酸酸（SAM），ATP为为辅辅助助因因子子；识识别别位位点点复复杂杂，特特异异性性差差。通通常常在在识识别别位位点点的的4007000bp范范围围内内切切割割DNA。现现已已报报道道19种。种。型型RE；由两种亚基组成。需；由两种亚基组成。需Mg+，ATP为辅助因子；切割位点靠近识别序列但较难为辅助因子；切割位点靠近识别序列但较难预测。一般在预测。一般在2527bp范围内切割。现已报范围内切割。现已报

6、道道4种。种。I、型型RE酶同时具有限制酶同时具有限制(剪切剪切)与修饰与修饰(甲甲基化基化)两种功能并依赖于两种功能并依赖于ATP，切割，切割DNA链链的位置远离识别序列，因此的位置远离识别序列，因此I型和型和型酶在型酶在DNA重组技术中都不常用。重组技术中都不常用。型型RE实际应用价值最大，这是因为：实际应用价值最大，这是因为：型酶型酶只具有限制性活性，无甲基化修饰活性只具有限制性活性，无甲基化修饰活性；对对DNA的的切切割割要要求求严严格格的的序序列列作作为为靶靶位位点点，切切割割精确；精确；此类酶作用时只需此类酶作用时只需Mg2+参与，无需参与，无需ATP。因因此此型型限限制制性性核核

7、酸酸内内切切酶酶是是基基因因工工程程中中剪剪切切DNA分分子子的的常常用用工工具具酶酶，被被誉誉为为“分分子子生生物物学学家家的的手术刀手术刀”。2限制性内切酶的命名限制性内切酶的命名目目前前已已广广泛泛采采用用Smith和和Nathams于于1973年提出的命名系统：年提出的命名系统：限限制制性性内内切切酶酶第第1个个大大写写字字母母：来来自自细细菌菌的的属名属名(genus)，第第2、3个小写字母：来自个小写字母：来自种名种名(species)，第四个字母代表第四个字母代表菌株菌株(strain)3型限制性内切酶的作用特点：型限制性内切酶的作用特点：n被被分分子子生生物物学学家家广广泛泛研

8、研究究应应用用，现现已已发发现现有有200多种识别序列的多种识别序列的REnMW=60KD的单链多肽的单链多肽n最适最适pH：68nNaCl有有抑抑制制作作用用，Mg2+激激活活，巯巯基基有有保保护作用护作用n热不稳定。热不稳定。作用特点作用特点：n有有严严格格的的识识别别、切切割割的的DNA序序列列，并并以以内内切的方式水解双链切的方式水解双链DNA中的磷酸二酯键。中的磷酸二酯键。n识别序列一般为识别序列一般为46个碱基对。个碱基对。n切切割割靶靶序序列列的的大大小小决决定定了了切切割割DNA链链后后产产生的生的DNA片段的长短片段的长短n切割后产生平头或粘性末端。切割后产生平头或粘性末端。

9、n只需只需Mg2+，不需，不需ATP。4.型酶切割型酶切割dsDNA可产生两种不同的切口可产生两种不同的切口n1.平平头头末末端端(blunt end)即即在在识识别别序序列列的的对对称称轴轴上上进行切割；进行切割；n2.粘性末端粘性末端(cohesive end)即在识别序列的两个即在识别序列的两个对称点切开对称点切开DNA双链，产生末端带有单链尾巴的切双链，产生末端带有单链尾巴的切口。根据突出端不同分为：口。根据突出端不同分为：5粘性末端粘性末端和和3粘性末端粘性末端。型酶切割型酶切割dsDNA产生的两种不同的切口产生的两种不同的切口5.三类特殊性质的三类特殊性质的型限制性内切酶：型限制性

10、内切酶：同裂酶同裂酶(isoschizomer)：又称源同异工酶，即：又称源同异工酶，即识别位点相同，但切割位点可以相同，也可以识别位点相同，但切割位点可以相同，也可以不同，例如不同，例如Sam I(CCCGGG)和和Xma I(CCCGGG)Sau3A I BamH I GATCGGATCC CTAG CCTAGG SauI Xho I GTCGACCTCGAG CAGCTGGAGCTC同尾酶同尾酶(isocaudarmer)：不同来源的酶其识别：不同来源的酶其识别和切割序列有一定的相关性，作用后能产生和切割序列有一定的相关性，作用后能产生相同的粘性末端。相同的粘性末端。可变酶可变酶：此种酶

11、所识别此种酶所识别DNA序列中的一序列中的一个或几个碱基是可变的，并且识别序列个或几个碱基是可变的，并且识别序列往往超过往往超过6个碱基对，例如个碱基对，例如Bstp I识别识别序列为：序列为：GGTNACC，其中，其中N为一可变为一可变碱基。碱基。6.RE识别序列呈反向对称，分为四种类型识别序列呈反向对称，分为四种类型回文结构回文结构回文结构回文结构：（：（Palindrome）如：如：EcoRI：5，GAATTC3，3，CTTAAG5，间断回文结构间断回文结构间断回文结构间断回文结构（interrupted Palindrome）如：如：BgI：5，GCCNNNNNGGC3，3，CGGNN

12、NNNCCG5 简简并并序序列列（degenerate sequence）又又称称“松松弛弛”特特异异识识别别，即即识识别别位位点点中中某某些些核核苷苷酸酸可可以以被其他核苷酸替换。被其他核苷酸替换。如：如：5335 非回文结构非回文结构：如：如：5 33 5 7限制性内切酶的应用限制性内切酶的应用 限限制制性性内内切切酶酶除除作作为为基基因因工工程程中中剪剪切切DNA的的工工具具外外，还还广广泛泛应应用用于于分分子子生生物物学学研研究的各个领域内。究的各个领域内。n绘制物理图谱及基因同源性比较绘制物理图谱及基因同源性比较nDNA测序及基因组分析测序及基因组分析n基因突变与遗传性疾病的诊断等基

13、因突变与遗传性疾病的诊断等n改造及重组质粒改造及重组质粒nDNA克隆及亚克隆的建立克隆及亚克隆的建立8.RE使用时的注意事项使用时的注意事项n要求较纯的底物要求较纯的底物DNAnMg2+和和Tris-HCl缓冲体系，缓冲体系，n反反应应体体系系中中不不能能含含有有酚酚、氯氯仿仿、乙乙醚醚、SDS以及大于以及大于10mmolL的的EDTAn适合的离子强度适合的离子强度n二硫苏糖醇或二硫苏糖醇或-巯基乙醇巯基乙醇n低温或冰浴低温或冰浴二、二、DNA聚合酶聚合酶 DNA polymerase分子克隆常用的分子克隆常用的DNA聚合酶：聚合酶：n依赖依赖DNA的大肠杆菌的大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶InK

14、lenow大片段大片段nT4噬菌体噬菌体DNA聚合酶聚合酶nTeq DNA聚合酶聚合酶nT7噬菌体噬菌体DNA聚合酶聚合酶n经修饰的经修饰的T7噬菌体噬菌体DNA聚合酶（测序酶）聚合酶（测序酶）n耐热耐热DNA聚合酶聚合酶n依赖依赖RNA 的的DNA聚合酶（逆转录酶）聚合酶（逆转录酶）1DNA聚合酶聚合酶I：DNA聚聚合合酶酶I是是Kornberg从从大大肠肠杆杆菌菌中中发发现现的的第第一一个个DNA聚聚合合酶酶。此此酶酶是是一一个个多多功功能能酶酶，包包括括3种酶活性：种酶活性：l 5-3聚聚合合酶酶活活性性：催催化化单单核核苷苷酸酸聚聚合合到到DNA的的3-OH末端，使末端，使DNA链从链

15、从5-3延伸；延伸；l 5-3外外切切酶酶活活性性：即即从从游游离离的的5末末端端降降解解双双链链DNA或单链或单链DNA成为单核苷酸成为单核苷酸l 3-5外切酶活性外切酶活性。l另外该酶还具有另外该酶还具有RNA酶酶H活性活性（降解（降解DNA-RNA杂杂合体中的合体中的RNA）。）。DNA聚合酶聚合酶I作用条件：作用条件：n 全全部部4种种dNTP(dATP、dTTP、dCTP、dGTP)、Mg2+n DNA作作为为模模板板，单单链链DNA或或有有缺缺口口的的双双链链DNA均可；均可；n 需需要要具具有有游游离离3-OH的的引引物物或或缺缺口口的的3末端末端DNA聚合酶聚合酶I的应用：的应

16、用：n 催催化化DNA切切刻刻平平移移(nick translation)反反应，制备高比活性应，制备高比活性DNA探针探针n 第二条第二条cDNA链的合成；链的合成；n 对对DNA 3凸出末端进行末端标记；凸出末端进行末端标记；n DNA序列分析序列分析2Klenow片段片段 C末端大片段末端大片段Klenow片段（片段（70KD）含含5-3聚合酶活性和聚合酶活性和3-5外切酶活性外切酶活性 （保证了（保证了DNA复制的精确性）复制的精确性）枯草杆菌枯草杆菌 蛋白水解酶蛋白水解酶 DNA聚合酶聚合酶I N末端小片段末端小片段 含含5-3外切酶活性外切酶活性Klenow片段功能：片段功能：双脱

17、氧法序列分析双脱氧法序列分析随机引物随机引物标记标记核酸探核酸探针针cDNA第二第二链链合成合成对对5凸出粘端凸出粘端补补平或平或对对双双链链DNA3端端标记标记PCR技技术术：PCR技技术术是是根根据据Klenow酶酶的的5-3聚合活性而聚合活性而设计诞设计诞生的生的3T4噬菌体噬菌体DNA聚合酶聚合酶n从从T4噬菌体感染噬菌体感染E.coli中获得。中获得。nMW=114KD 单链多肽。单链多肽。n活活性性与与Klenow片片段段相相似似：5-3聚聚合合活活性性；3-5外切活性。外切活性。特点：特点：n1.外切活性外切活性=Klenow片段外切片段外切200倍倍n2.外切活性的强度：单链底

18、物大于双链底物外切活性的强度：单链底物大于双链底物应用：应用：补平或标记补平或标记5凸出粘端。凸出粘端。对对DNA 3凸凸出出粘粘端端进进行行末末端端标标记记。用用3-5外外切切活活性性切切除除3凸凸出出粘粘端端，甚甚至至形形成成5凸凸出出粘粘端端，再再用用高高浓浓度度dNTP标标记记掺掺入入，利利用用5-3聚合活性获得标记物。聚合活性获得标记物。通过取代反应，标记核酸探针。通过取代反应，标记核酸探针。n5 3n3 5n T4 DNA poln 35外切活性外切活性n n 5 3 n 3 5n T4 DNA poln 32PdNTPnn 5 3n 3 5n E CoRI，BamHIn RE消化

19、消化n 5 35 3n 3 53 5nnn 凝胶电泳提取纯化特异探针凝胶电泳提取纯化特异探针T4DNA聚合酶的聚合酶的应用（标记探针）应用（标记探针）4.Taq DNA聚合酶聚合酶 Taq DNA聚聚合合酶酶是是一一种种依依赖赖DNA的的单单亚亚基基耐耐热热DNA聚聚合合酶酶，分分子子量量约约为为65kD。该该酶酶最最初初由由极极端端嗜嗜热热水水生生菌菌Thermus aquaticus中中提提取取并并纯纯化化，目目前前已已能能通通过过基因工程方式大量生产。基因工程方式大量生产。Taq DNA聚合酶的应用聚合酶的应用 Taq DNA聚聚合合酶酶主主要要用用于于PCR中中。最最适适温温度度在在7

20、075，随随着着温温度度的的降降低低，酶酶活活性性明明显显下下降降。同同时时此此酶酶缺缺乏乏3-5外外切切酶酶活活性性，因而无校正功能。因而无校正功能。Taq DNA聚合酶的应用条件聚合酶的应用条件n需需Mg2+（1mmol/L）。）。n低浓度低浓度Mn2+（2mmol/L）有低活性。）有低活性。nCa2+使其完全失活。使其完全失活。n一价阳离子高至一价阳离子高至0.1mol/L对其活性无影响。对其活性无影响。n最适浓度：最适浓度：NaCl=40mmoL/L KCl=60mmol/Ln最适最适pH：7.8 Tris-HCl buff三、DNA连接酶：催化双链催化双链DNA中相邻碱基的中相邻碱基

21、的5磷酸和磷酸和3羟基羟基间磷酸二酯键形成的酶，称为间磷酸二酯键形成的酶，称为DNA连接酶连接酶(DNA ligase)。DNA连接酶主要有两种：连接酶主要有两种：nT4噬菌体噬菌体DNA连接酶连接酶n大肠杆菌大肠杆菌DNA连接酶连接酶 1T4噬菌体噬菌体DNA连接酶连接酶nT4 DNA连连接接酶酶最最早早是是从从T4噬噬菌菌体体感感染染的的大大肠肠杆杆菌菌中中发发现现并并分分离离的的，分分子量子量68kDa。主要功能及用途：主要功能及用途：连接双链连接双链DNA中一条链上的切口中一条链上的切口连接互补粘性末端的连接互补粘性末端的DNA片段（连接反应通片段（连接反应通常在常在1215下进行）下

22、进行）DNA分子间的平头末端分子间的平头末端（平端的连接通常在（平端的连接通常在室温室温下进行）下进行）2大肠杆菌大肠杆菌DNA连接酶连接酶特点特点：连接双链连接双链DNA中一条链上的切口中一条链上的切口 间存在的互补粘性末端的间存在的互补粘性末端的DNA片段需片段需NAD+连接平头末端连接平头末端DNA分子需聚乙二醇或分子需聚乙二醇或Ficoll、情情况况下下可可代代替替T4DNA连连接接酶酶，它它产产生生的的背景低，准确性高。背景低，准确性高。大肠杆菌大肠杆菌DNA连接酶功能连接酶功能n可修复可修复dsDNA中的单链切口，并可催化互补中的单链切口，并可催化互补黏性末端的连接，主要用于黏性末

23、端的连接，主要用于cDNA第二链的第二链的合成。合成。n能促进平端连接，但效率仍很低；能促进平端连接，但效率仍很低；n在非平端连接时可代替在非平端连接时可代替T4DNA连接酶，它产连接酶，它产生的背景低，准确性高。生的背景低，准确性高。四、反转录酶：四、反转录酶：能以能以RNA为模板合成为模板合成DNA的的DNA聚合酶称为反聚合酶称为反转录酶转录酶(reverse transcriptase，RT)，合成的，合成的DNA产物称为互补产物称为互补DNA(complementary DNA，cDNA)。常常用用的的逆逆转转录录酶酶有有禽禽类类成成骨骨细细胞胞性性白白血血病病病病毒毒(AMV)逆逆转

24、转录录酶酶和和Moloney小小鼠鼠白白血血病病病病毒毒(Mo-MLV)逆转录酶逆转录酶 反转录酶的作用特点：反转录酶的作用特点：n以以单单链链RNA或或单单链链DNA为为模模板板合合成成DNA，可用于可用于cDNA第一链和第二链的合成第一链和第二链的合成n有有5-3和和3-5RNA外外切切酶酶活活性性，3-5RNA外外切切酶酶活活性性可可用用于于降降解解RNA-DNA杂杂交交分分子子中中RNAn缺乏缺乏3-5DNA核酸外切酶活性核酸外切酶活性反转录酶的反转录酶的应用：应用：ncDNA的合成的合成n补平和标记补平和标记DNA的的3 末端末端n代替代替Klenow片段片段n杂交探针的制备杂交探针

25、的制备五、五、末端转移酶末端转移酶 末末端端脱脱氧氧核核苷苷酸酸转转移移酶酶(terminal deosynucleotidyl transferase，TdT)多多从从小小牛牛胸胸腺腺中中分分离离出出，能能催催化化多多个个脱脱氧氧核苷酸依次加到核苷酸依次加到DNA 3末端。末端。末端脱氧核苷酸转移酶的作用特点：末端脱氧核苷酸转移酶的作用特点：n此酶活性尤以带此酶活性尤以带3突出的突出的DNA作为受体为佳作为受体为佳n在在含含有有Mg2+、Co2+和和Mn2+的的低低离离子子强强度度缓缓冲冲液液中中此此酶酶也也能能作作用用于于3平平端端或或5凹凹端端的的DNA分分子子，若若加加入入嘧嘧啶啶核核

26、苷苷酸酸，则则以以Co2+为为首首选选阳阳离离子子；若若加加入入嘌嘌呤呤核核苷苷酸酸，则则以以Mg2+离离子子为为首首选阳离子。选阳离子。末端脱氧核苷酸转移酶的作用：末端脱氧核苷酸转移酶的作用：末端转移酶常用于给载体或末端转移酶常用于给载体或cDNA加加上互补的多聚尾巴，构建人工粘性末端；上互补的多聚尾巴，构建人工粘性末端；也用于也用于DNA分子分子3端标记。端标记。六、碱性磷酸酶：六、碱性磷酸酶：碱碱性性磷磷酸酸酶酶(alkalinephosphatase)来来源源于于大大肠肠杆杆菌菌和和牛牛小小肠肠，能能水水解解DNA、RNA以及脱氧核糖三磷酸以及脱氧核糖三磷酸(dNTP)上的上的5磷酸根

27、。磷酸根。碱性磷酸酶应用：碱性磷酸酶应用：在分子克隆的连接反应中预先处理载体在分子克隆的连接反应中预先处理载体DNA片段，以去除片段，以去除5-P，防止载体重新自防止载体重新自体连接，以提高重组效率体连接，以提高重组效率；用用32P标记标记5末端时，用此酶末端时，用此酶去除去除5-P，再，再用激酶对用激酶对5末端进行同位素标记；末端进行同位素标记；作为化学发光物测定或其他检测系统的指作为化学发光物测定或其他检测系统的指示酶。示酶。七、依赖于七、依赖于DNA的的RNA聚合酶聚合酶 常常用用的的有有噬噬菌菌体体SP6、T7、T3 RNA聚聚合合酶酶，其其中中SP6 RNA聚聚合合酶酶来来源源于于S

28、P6噬噬菌菌体体感感染染的的鼠鼠伤伤寒寒沙沙门门菌菌(Salmonella typhimurium)，T7、T3 RNA聚聚合合酶酶源源自自大大肠肠杆杆菌菌，目目前前这这些些RNA聚聚合合酶酶已已能能用用基因工程的方法大量制备。基因工程的方法大量制备。依赖于依赖于DNA的的RNA聚合酶聚合酶功能功能可可以以识识别别双双链链DNA模模板板上上相相应应的的噬噬菌菌体体特特异异性性启启动子，起始动子，起始RNA的合成的合成可可用用于于合合成成单单链链RNA以以作作为为杂杂交交用用探探针针、体体外外翻翻译译系系统统中中的的功功能能性性mRNA，体体外外剪剪接接反反应应的的底底物物；也也可可以以直直接接

29、用用于于原原核核或或真真核核细细胞胞中中克克隆隆基基因因的的表表达。达。第二节第二节 基因克隆常用载体基因克隆常用载体n所谓载体所谓载体(vecter)是指能在连接酶作用下和是指能在连接酶作用下和外源外源DNA片段或基因连接，并运送片段或基因连接，并运送DNA分子分子进入受体细胞的进入受体细胞的DNA分子。分子。n目前用于基因克隆的载体种类繁多，包括在目前用于基因克隆的载体种类繁多，包括在大肠杆菌中使用的大肠杆菌中使用的质粒、噬菌体载体、酵母质粒、噬菌体载体、酵母菌质粒载体以及动、植物病毒载体菌质粒载体以及动、植物病毒载体等等 载体的发展概况载体的发展概况第第一一阶阶段段（1977年年前前）：

30、天天然然质质粒粒和和重重组组质质粒粒的的利利用用，如如pSC101,colE1,pCR,pBR313和和pBR322第第二二阶阶段段：增增大大载载体体容容量量(降降低低载载体体长长度度)，建建立立多多克克隆隆位点区和新的遗传标记基因。如位点区和新的遗传标记基因。如pUC系列载体系列载体第第三三阶阶段段：进进一一步步完完善善载载体体功功能能以以满满足足基基因因工工程程克克隆隆中中的的不不同同要要求求，如如M13系系列列载载体体，含含T3，T7，sp6启动子载体，表达载体及各种探针载体启动子载体，表达载体及各种探针载体载体必须具备以下基本条件：载体必须具备以下基本条件：n能能自我复制自我复制n具具

31、备备多多种种限限制制性性内内切切酶酶的的识识别别位位点点：多多克克隆隆位位点点(multiple clone site,MCS)n具有多个利于选择和筛选具有多个利于选择和筛选标记标记n有有足足够够的的容容量量，具具有有拷拷贝贝数数高高、易易与与宿宿主主细细胞胞的的DNA分子分离并易提取、抗剪切力强。分子分离并易提取、抗剪切力强。n表达型载体还应具备与宿主细胞相适应表达型载体还应具备与宿主细胞相适应调控元件调控元件标记基因的种类标记基因的种类1）抗性标记基因抗性标记基因（可直接用于选择转化子）（可直接用于选择转化子）a.抗生素抗性基因抗生素抗性基因:Apr，Tcr，Cmr，Kanr，G418r，

32、Hygr，Neorb.重金属抗性基因重金属抗性基因:Cur，Znr，Cdrc.代谢抗性基因代谢抗性基因:TK，抗除草剂基因，抗除草剂基因2）营养标记基因营养标记基因（可直接用于选择转化子）（可直接用于选择转化子）主要是参与氨基酸、核苷酸及其他必需营养物合成主要是参与氨基酸、核苷酸及其他必需营养物合成酶类的基因，酶类的基因，这类基因在酵母转化中使用最频繁，这类基因在酵母转化中使用最频繁，如如TRP1，URA3，LEU2，HIS4等。等。3）生化标记基因生化标记基因其表达产物可催化某些易检测的生化反应，如其表达产物可催化某些易检测的生化反应，如lacZ,GUS,CAT常用的遗传标记基因常用的遗传标

33、记基因1)氨苄青霉素抗性基因氨苄青霉素抗性基因（Apr）Ampicillin可抑制细菌细胞膜上参与细胞壁合可抑制细菌细胞膜上参与细胞壁合 成酶类的活性。成酶类的活性。Apr抗性基因编码一种分泌到细抗性基因编码一种分泌到细 菌细胞周间质的酶，催化菌细胞周间质的酶，催化内酰胺环的水解，内酰胺环的水解，使氨苄青霉素失活。使氨苄青霉素失活。2)四环素抗性基因四环素抗性基因（Tcr）Tetracycline 可可结结合合在在核核糖糖体体30s亚亚基基中中的的一一种种蛋蛋白白质质分分子子上上，抑抑制制核核糖糖体体的的转转位位过过程程。四四环环素素抗抗性性基基因因编编码码一一种种399 AAs蛋蛋白白质质，

34、与与细细菌菌细胞膜结合，阻止四环素分子进入细菌细胞。细胞膜结合，阻止四环素分子进入细菌细胞。遗传选择标记：遗传选择标记：氨苄青霉素抗性氨苄青霉素抗性(ampicillin resistance，ampr)基因基因：Ampicillin可可抑制抑制细细菌菌细细胞壁的合成胞壁的合成。Ampr基因基因编码编码内内酰酰胺胺酶酶，催化，催化-内内酰酰胺胺环环的水解，使氨的水解，使氨苄苄青霉素失活而使青霉素失活而使细细菌菌产产生耐生耐药药。四环素抗性四环素抗性(tetracycline resistance，tetr)基因基因：Tetracycline可可结结合合在在核核糖糖体体30s亚亚基基中中的的一一

35、种种蛋蛋白白质质分分子子上上，抑抑制制核核糖糖体体的的转转位位过过程程。Tetr基基因因编编码码一一种种膜膜相相关关蛋蛋白白，与与细细菌菌细细胞胞膜膜结结合合以以阻阻止止四四环环素素进进入入细细胞。胞。氯霉素抗性基因（氯霉素抗性基因（Cmr）Chlorophenicol可结合在核糖体可结合在核糖体50S亚基上，亚基上，阻阻止蛋白质合成止蛋白质合成。Cmr基因编码氯霉素乙酰转移酶，基因编码氯霉素乙酰转移酶，使氯霉素使氯霉素乙酰化乙酰化，导致乙酰化的氯霉素不能结合在，导致乙酰化的氯霉素不能结合在核糖体上。核糖体上。卡那霉素卡那霉素(Kanr),新霉素新霉素(Neor)和和G418抗性抗性(G418

36、r)基因基因Kanamycin，Neomycin和和G418均属脱氧链霉均属脱氧链霉胺氨基葡萄糖苷类抗生素，可结合在核糖体上胺氨基葡萄糖苷类抗生素，可结合在核糖体上阻止阻止蛋白质的合成蛋白质的合成。来自转座子。来自转座子Tn5和和Tn903的的Kanr抗性抗性基因均可使这类抗生素基因均可使这类抗生素磷酸化磷酸化，使之不能进入细胞，使之不能进入细胞内。内。不不同同的的质质粒粒具具有有不不同同的的抗抗药药基基因因，质质粒粒的的Ampr、Tetr基基因因若若被被外外源源基基因因插插入入而而失失活活，就就失失去去了了耐耐药药性性，因因此此抗抗药药基基因因常常作作为为基基因因工工程程的的筛筛选选标标志。

37、志。Ampicillin resistant?yes yesTetracycline resistant?No yesB X BBBXAmproriAmprTcroripBR322AmprTcroriScreening by insertional inactivation of a resistance genebackReplica plating:transfer of the colonies from one plate to another using absorbent pad or Velvet(绒布).transferofcolonies+ampicillin+ampicil

38、lin+tetracyclinethese colonies have bacteria with recombinant plasmid大肠杆菌大肠杆菌Lac Z基因基因：Lac Z基基因因编编码码半半乳乳糖糖苷苷酶酶。用用含含有有X-gal的的培培养养基基培培养养细细菌菌时时，在在细细菌菌的的乳乳糖糖操操纵纵子子(Lac operon)诱诱导导物物异异丙丙基基硫硫代代半半乳乳糖糖苷苷(IPTG)的的作作用用下下，细细菌菌合合成成半半乳乳糖糖苷苷酶酶，分分解解X-gal，菌菌落落变变为为蓝蓝色色；如如果果Lac Z基基因因被被外外源源DNA分分子子插插入入而而遭遭到到破破坏坏，则则不不能能生

39、生成成相相应应的的半半乳乳糖糖苷苷酶酶，菌菌落落为为白白色色。通通过过观观察察菌菌落的颜色，能方便地进行基因克隆的筛选工作。落的颜色，能方便地进行基因克隆的筛选工作。-半半乳乳糖糖苷苷酶酶基基因因有有1021 AAs，基基因因产产物物不不具具酶酶活活性性，装装配配为为四四聚聚体体后后才才有有酶酶活活。该该蛋蛋白白质质可可分分为为两两部部分分：链链和和链链。前前者者负负责责四四聚聚体体装装配配，后后者者具具-半半乳乳糖糖苷苷酶酶活活性性；只只有有当当两两者者都都存存在在时时，才才会会表表现现出出酶酶活活性性，该该作作用用称称之之为为-互互补补作作用用。链链编编码码的的基基因因称称之之为为lac

40、Z(编码编码145 AAs)-半乳糖苷酶基因的优点半乳糖苷酶基因的优点:a.酶催化酶催化X-Gal水解为蓝色产物，检测直观水解为蓝色产物，检测直观 b.lac Z 编码编码5-端可容许很大的变化而不影响酶活性端可容许很大的变化而不影响酶活性 c.lac Z 和和链基因的分别表达可使载体小而容量大链基因的分别表达可使载体小而容量大LacZ基因的结构与产物基因的结构与产物重组重组DNADNA分子分子 转化转化E.coliE.coli 外源外源DNA DNA BamBamHIHI片段片段 pUC18BamHI片段片段涂布在含涂布在含X-Gal和和Ap的平板上的平板上,白色菌落为重组白色菌落为重组子，

41、子，兰色菌落兰色菌落为为原载体原载体利用利用LacZ基因筛选重组子基因筛选重组子 1质粒质粒载体：载体：质质粒粒(plasmid)是是细细菌菌染染色色体体外外的的遗遗传传单单位位，自自身身含含有有复复制制起起始始点点，与与相相应应的的顺顺式式调调控控元元件件组组成成一一个个复复制制子子(replicon)，能能利利用用细细菌菌的的酶酶系系统统进进行行独独立立的的复复制制及及转录。转录。用于基因克隆的质粒载体具有以下特点：用于基因克隆的质粒载体具有以下特点：n分子较分子较小小，比较，比较稳定稳定，拷贝数，拷贝数高高。n含含有有高高效效的的复复制制子子，能能在在细细菌菌的的蛋蛋白白质质合合成成受受

42、阻阻，染染色色质质DNA合合成成停停止止时时，利利用用细细菌菌的的酶酶系系统统进进行行质质粒粒自自身身的的复复制制。因因此此在在实实验验中中常常利利用用氯氯霉霉素素以以阻阻止止细细菌菌蛋蛋白白质质的的合合成成，而而使使质质粒粒的的拷拷贝贝数数增增加加至数千。至数千。n具有具有多多种遗传选择标记，包括各种抗药基因或营种遗传选择标记，包括各种抗药基因或营养代谢基因等。养代谢基因等。pBR322：pBR322是是研研究究得得最最清清楚楚应应用用也也最最广广泛泛的的质质粒粒，全全长长4363bp，由由3种种野野生生质质粒粒成成分分构构建建而而成成，含含有有Ampr和和Tetr两两个个抗抗药药基基因因标

43、标记记，一一个个复复制制起起始始点点(ori)，复复制制子子为为Col EI。其其中中ori来来自自pM9，Ampr来来自自pRSF2124，Tetr来来自自pSC101。在在Ampr和和Tetr基基因因中中共共含含有有8个个限限制制性性酶酶切切位位点点，以以供供外外源源DNA片片段段的的插插入入。其其中中在在Ampr 基基因因中中的的单单一一酶酶切切位位点点有有Pst、Pvu等等；在在Tetr 基基因因中中的的位位点点有有BamH、Hind、Sal等。等。pUC18pUC19 pUC系系列列质质粒粒是是由由大大肠肠杆杆菌菌pBR质质粒粒和和M13噬噬菌菌体体改改建建而而成成的的质质粒粒载载体

44、体。全全长长2674bp，具具有有氨氨苄苄青青霉霉素素抗抗性性基基因因，一一个个复复制制起起始始点点，复复制制子子为为ColEI。pUC系系列列质质粒粒带带有有一一段段大大肠肠杆杆菌菌Lac操操纵纵子子DNA片片段段，能能编编码码-半半乳乳糖糖苷苷酶酶氨氨基基端端的的一一部部分分，同同时时与与大大肠肠杆菌的杆菌的gal-基因基因互补互补。当当pUC质质粒粒转转化化到到gal-的的宿宿主主菌菌后后，在在含含有有诱诱导导物物IPTG和和生生色色底底物物X-gal的的培培养养基基上上形形成成蓝蓝色色菌菌落落；如如果果外外源源DNA片片段段克克隆隆到到pUC的的LacZ基基因因区区域域时时，造造成成L

45、acZ基基因因失失活活，在在含含有有IPTG、X-gal的的培培养养基基上上将将生生成成白色菌落白色菌落。Recreated vector:blue transformantsRecombinant plasmid containing inserted DNA:white transformantsRecreated vector(no insert)Recombinant plasmid(contain insert)2噬菌体噬菌体 n噬噬菌菌体体的的基基因因组组DNA长长度度约约为为50kb，基基因因组组比比较较复复杂杂，共共含含有有66个个基基因因。从从噬噬菌菌体体颗颗粒粒中中分分离离

46、出出的的DNA分分子子为为双双链链线线状状，当当感感染染细细胞胞后后，噬噬菌菌体体连连接接形形成成双双链链环环状状结结构构，并并按按造造方方式式和滚环方式复制。和滚环方式复制。n噬噬菌菌体体感感染染细细菌菌后后可可进进行行裂裂解解性性生生长长和和溶溶源源性性生长生长。噬菌体作为载体具有两个特点：噬菌体作为载体具有两个特点：n噬噬菌菌体体生生长长繁繁殖殖所所必必需需的的序序列列位位于于其其左左右右二二臂臂上上，噬噬菌菌体体基基因因组组中中央央含含有有约约3030的的DNADNA是是噬菌体生长所噬菌体生长所非必需非必需的的。n噬噬菌菌体体的的成成熟熟需需要要经经过过包包装装，当当与与外外源源DNA

47、片片段段重重组组后后的的大大小小介介于于原原来来的的78一一105之之间间时时，重重组组的的DNA分分子子才才可可包包装装为为成成熟熟的噬菌体颗粒。的噬菌体颗粒。噬菌体载体噬菌体载体类型：类型：n置置换换型型载载体体(replacement vectors)：允允许许外外源源DNA片片段段代代替替自自身身的的生生长长非非必必需需区区，这这种克隆方式容纳的外源种克隆方式容纳的外源DNA片段可达片段可达30kb。n插插入入型型载载体体(insertion vectors)：允允许许克克隆隆的外源的外源DNA片段较小，一般为片段较小，一般为7kb以下以下。目目前前已已构构建建了了大大量量的的噬噬菌菌

48、体体载载体体，例例如如Charon系系列列、gt系系列列、EMBL系列等各种类型的载体。系列等各种类型的载体。ngt：长长43700bp，改改造造后后含含有有Lac Z片片段段，克克隆隆位位点点是是EcoR，位位于于Lac Z的的羧羧基基端端，插入的外源片段可达插入的外源片段可达7kb。n重重组组的的gt因因Lac Z基基因因的的失失活活，在在X-gal培培养养基基中中形形成成白白斑斑，而而未未重重组组的的gt形形成成蓝蓝斑斑。3.病毒载体：病毒载体：在在目目前前广广泛泛使使用用的的各各种种真真核核病病毒毒载载体体中中均均含含有有各各种种相相似似的的调调控控序序列列，包包括括DNA在在真真核核

49、细细胞胞中中的的复复制制起起始始点点、启启动动子子、剪剪切位点、多聚腺苷化信号、增强子等。切位点、多聚腺苷化信号、增强子等。反转录病毒载体反转录病毒载体(retrovial vector)反反转转录录病病毒毒(retrovirus)是是一一种种RNA病病毒毒，基基因因组组全全长长810kb，该该RNA有有mRNA的的功功能能，其其5端端是是甲甲基基化化帽帽子子结结构构，3端是端是polyA尾巴。尾巴。n反反转转录录病病毒毒一一般般含含有有3 3个个基基因因：结结构构蛋蛋白白基基因因(gag)、反转录酶基因、反转录酶基因(pol)、糖蛋白基因、糖蛋白基因(env)。n许许多多反反转转录录病病毒毒

50、还还含含有有一一个个癌癌基基因因(onc)能能使使感感染染细胞细胞发生转化发生转化。n在在反反转转录录病病毒毒基基因因组组的的两两端端分分别别有有一一个个长长末末端端重重复复序序列列(long terminal repeat，LTR)，其其中中含含有有启启动动子子、增增强强子子、整整合合信信号号及及多多聚聚腺腺苷苷化化信信号号等等调控序列调控序列。反转录病毒改造为载体：反转录病毒改造为载体：n用标记基因和外源基因替代病毒的编码基因用标记基因和外源基因替代病毒的编码基因n制备辅助细胞为载体制备辅助细胞为载体DNA提供其丧失的功能提供其丧失的功能n将载体将载体DNA导入辅助细胞以产生有感染力的病毒