氨基酸检测方法.ppt

《氨基酸检测方法.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《氨基酸检测方法.ppt（52页珍藏版）》请在淘文阁 - 分享文档赚钱的网站上搜索。

1、POWER038.PPT氨基酸分析氨基酸分析l1958 Spackman,Stein and Moore 第一次第一次实现实现氨基酸自氨基酸自动动分离和定量分离和定量 NH2 R C COOH HUV-210nmPOWER038.PPT氨基酸衍生化方法氨基酸衍生化方法l柱后衍生柱后衍生l柱前衍生柱前衍生氨基酸氨基酸衍生化后的氨基酸衍生化后的氨基酸试剂试剂色色谱谱柱柱检测检测器器色色谱谱柱柱检测检测器器POWER038.PPT 氨基酸氨基酸试剂试剂色色谱谱柱柱检测检测器器柱后衍生柱后衍生色色谱谱柱柱:阳离子交阳离子交换换柱柱试剂试剂:茚茚三三酮酮方法方法-UV/VIS 检测检测器器 OPA方法方

2、法-荧荧光光检测检测器器POWER038.PPT柱后衍生化分离柱柱后衍生化分离柱阳离子交阳离子交换换柱柱使用阳离子交使用阳离子交换换柱，峰分离度柱，峰分离度较较差。差。分析所有的氨基酸所需分析所有的氨基酸所需时间较长时间较长。蛋白蛋白质质水解氨基酸水解氨基酸(45 min)生物体氨基酸生物体氨基酸(120 min)POWER038.PPT 茚茚三三酮酮方法方法伯氨基酸和仲氨基酸（伯氨基酸和仲氨基酸（亚亚氨基酸）氨基酸）检检 测测:440nm(脯脯 氨氨 酸酸)or 570nm(primary)反反应应温度温度:130 反反应应速度速度:快快 速速 试剂稳试剂稳定性定性:不不稳稳定（定（必必须须

3、冷藏）冷藏）衍生化衍生化产产物物稳稳定性定性:稳稳定定POWER038.PPT 茚茚三三酮酮方法方法 阳离子交阳离子交换换柱柱UV/VIS检检 测测 器器 茚茚三三酮试剂酮试剂130 氨基酸氨基酸 柱温箱柱温箱 反反应应器加器加热热器器POWER038.PPTOPA 方方 法法(邻邻邻邻 苯苯苯苯 二二二二 甲甲甲甲 醛醛醛醛)伯氨基酸伯氨基酸 检检 测测：荧荧光光检测检测器器(Ex=350nm,Em=460nm)反反应应温度：温度：室室 温温 反反应应速度：速度：快快 速速 试剂稳试剂稳定性定性:较较 差差 衍生化衍生化产产物物稳稳定性：定性：较较 差差POWER038.PPT 脯氨酸和脯氨

4、酸和羟羟基脯氨酸分析基脯氨酸分析l 脯氨酸和脯氨酸和羟羟基脯氨酸不与基脯氨酸不与OPA试剂试剂 发发生反生反应应l 在与在与OPA反反应应前两种氨基酸前两种氨基酸应应先使先使 用下列用下列试剂进试剂进行氧化行氧化 次次氯氯酸酸盐盐 氯氯胺胺TPOWER038.PPTOPA 衍生反衍生反应辅应辅助助试剂试剂l 有硫醇存在有硫醇存在时时，OPA才会与伯氨基酸才会与伯氨基酸发发生反生反应应 乙硫醇乙硫醇2-硫基乙醇硫基乙醇3-硫基丙酸硫基丙酸 (非挥发性)POWER038.PPTOPA 方方 法法 阳离子交阳离子交换换柱柱 荧荧光光检测检测器器 氨基酸氨基酸 柱温箱柱温箱OPA 试剂试剂 次次氯氯酸

5、酸盐盐POWER038.PPT 茚茚三三酮酮方法和方法和OPA方法比方法比较较POWER038.PPT 衍生化后的氨基酸衍生化后的氨基酸 色色 谱谱 柱柱 检检 测测 器器 柱前衍生柱前衍生 色色 谱谱 柱柱:反相柱反相柱(ODS)试试 剂剂:OPA(荧荧光光检测检测)FMOC(荧荧光光检测检测)荧荧 光光 胺胺(荧荧光光检测检测)DANS-Cl(荧荧光光检测检测)PITC(UV)POWER038.PPT 柱前衍生分离柱柱前衍生分离柱 反相色反相色谱谱柱柱(ODS)使用反相柱，色使用反相柱，色谱谱峰分离良好。峰分离良好。分析某些分析某些类类型的氨基酸所需型的氨基酸所需时间时间很短很短 蛋白蛋白

6、质质水解氨基酸水解氨基酸(20 min)生物体氨基酸生物体氨基酸(60 min)POWER038.PPTOPA Method(o-phthaldialdehyde)(o-phthaldialdehyde)伯氨基酸伯氨基酸检测检测:荧荧光光检测检测器器(Ex=380nm,Em=420nm)反反应应温度：室温温度：室温反反应应速度：快速速度：快速POWER038.PPTOPA柱前衍生化色柱前衍生化色谱图谱图生物体氨基酸生物体氨基酸标标准品准品Shim-pack CLC-ODSPOWER038.PPTFMCO 方法方法(9-fluorenylmethyoxycarbonyl chloride)(9-

7、fluorenylmethyoxycarbonyl chloride)通用通用试剂试剂，用于，用于缩缩氨酸氨酸 N端保端保护护POWER038.PPT荧荧光胺方法光胺方法lpH7时时与伯氨基酸快与伯氨基酸快速反速反应应l易于水解易于水解POWER038.PPTDANS-Cl 方法方法(1-dimethylaminonaphthalene-5-sufonyl chloride)(1-dimethylaminonaphthalene-5-sufonyl chloride)l与伯氨基酸和仲氨与伯氨基酸和仲氨基酸反基酸反应应效率低效率低POWER038.PPTPITC 方法方法(phenylisoth

8、iocyanate)(phenylisothiocyanate)lFor peptide and protein sequencing as Edman抯抯 reagentl伯氨基酸和仲氨基酸伯氨基酸和仲氨基酸(碱碱性条件性条件)l反反应时间长应时间长l使用使用UV检测检测器，灵敏度器，灵敏度低低PITCPTCPOWER038.PPTPTC-氨基酸色氨基酸色谱图谱图STR ODS-II氨基酸氨基酸标标准品准品POWER038.PPT自自动动氨基酸分析氨基酸分析仪仪l对对于于“柱前柱前”和和“柱后柱后”自自动动氨基酸分析氨基酸分析仪仪来来说说，采用何种方法更好？，采用何种方法更好？l要控制反要控

9、制反应时间应时间，采用柱后衍生方法更方便。，采用柱后衍生方法更方便。这这就是就是为为什么采用柱后衍生法所得什么采用柱后衍生法所得结结果之果之重复性更好的原因。重复性更好的原因。v柱后衍生重复性柱后衍生重复性,RSD 约为约为 1%v柱前衍生重复性柱前衍生重复性,RSD 2%POWER038.PPTShimadzu 氨基酸分析系氨基酸分析系统统POWER038.PPT氨基酸分析流程氨基酸分析流程图图POWER038.PPT分离柱分离柱l强强酸性阳离子交酸性阳离子交换树换树脂脂 (带带有磺化基有磺化基团团的苯乙的苯乙烯烯二乙二乙烯烯基苯共聚物基苯共聚物)lNa型型 and Li型型vShim-pa

10、ck AMINO-Na，用于水解氨基酸分析用于水解氨基酸分析vShim-pack AMINO-Li，用于生物体氨基酸分析，用于生物体氨基酸分析POWER038.PPT水解氨基酸色水解氨基酸色谱图谱图POWER038.PPT生物体氨基酸色生物体氨基酸色谱图谱图POWER038.PPT流流动动相相 Na型型 A 溶液溶液:0.2N 柠柠檬酸檬酸钠钠 (用高用高氯氯酸酸调调 pH至至 3.2)B 溶液溶液:0.6N 柠柠檬酸檬酸钠钠/0.2M 硼酸硼酸 (用用4M NaOH调调 pH至至 10.0)C溶液溶液:0.2N NaOH(用于清洗色用于清洗色谱谱柱柱)Li 型型A 溶液溶液:0.15N 柠柠

11、檬酸檬酸锂锂/7%甲氧基乙醇甲氧基乙醇 (用硼酸用硼酸调调 pH至至 2.6)B溶液溶液:0.3N 柠柠檬酸檬酸锂锂/0.2M 硼酸硼酸 用用4M LiOH调调 pH至至 10.0)C 溶液溶液:0.2N LiOH(用于清洗色用于清洗色谱谱柱柱)POWER038.PPTPH梯度梯度 H H H R-C-COOH R-C-COOH R-C-COO-NH3+NH2 NH2分离是通分离是通过过 离子力离子力进进行的行的POWER038.PPTN-acetylcystine作作为辅为辅助助试剂试剂POWER038.PPT什么是氨捕集柱什么是氨捕集柱?流流动动相中的氨相中的氨 无捕集柱无捕集柱有捕集柱有

12、捕集柱POWER038.PPT重复性重复性(各各250 pmol)(n=10)POWER038.PPT线线性性POWER038.PPT高灵敏度分离色高灵敏度分离色谱图谱图 25 pmol 氨基酸氨基酸标标准品准品POWER038.PPT样样品品预处预处理理l脱脂脱脂 l去蛋白去蛋白l蛋白蛋白质质水解水解l样样品稀品稀释释l过滤过滤POWER038.PPT脱脂脱脂l脂脂类组类组分会影响分析柱分会影响分析柱l使用弱极性溶使用弱极性溶剂剂v乙酸乙乙酸乙酯酯v氯氯仿仿v正己正己烷烷等等l两相分离后两相分离后,水相必水相必须须使用使用0.45 um 滤滤膜膜过过滤滤POWER038.PPT除蛋白除蛋白l

13、蛋白蛋白组组分会干分会干扰扰氨基酸的分离氨基酸的分离l除蛋白除蛋白试剂试剂v酸性溶酸性溶剂剂方法方法v有机溶有机溶剂剂方法方法v超超滤滤方法方法l蛋白沉淀物必蛋白沉淀物必须须采用离心采用离心(3000 rpm,5 min)或或过滤过滤方法除去方法除去.POWER038.PPT酸性溶酸性溶剂剂方法方法l三三氯氯乙酸乙酸(5-10%水溶液水溶液)l高高氯氯酸酸(0.1-1%水溶液水溶液)l除去蛋白后除去蛋白后,通通过过加加 NaOH or LiOH 以中以中和溶液和溶液 (溶液呈酸性溶液呈酸性时时会影响色会影响色谱谱保留保留时间时间.)POWER038.PPT有机溶有机溶剂剂方法方法乙乙腈腈乙醇乙

14、醇聚苯乙聚苯乙烯烯柱不适合用有机溶柱不适合用有机溶剂剂。如果采用有机溶如果采用有机溶剂剂方法方法,进样进样量量应应尽可能小。尽可能小。POWER038.PPT超超滤滤方法方法l效率高效率高 l成本低成本低POWER038.PPT老鼠血清中游离氨基酸分析老鼠血清中游离氨基酸分析POWER038.PPT牛尿中游离氨基酸分析牛尿中游离氨基酸分析POWER038.PPT猪血粉中游离氨基酸分析猪血粉中游离氨基酸分析POWER038.PPT茶叶中游离氨基酸分析茶叶中游离氨基酸分析POWER038.PPT蛋白蛋白质质水解水解(1)高高氯氯酸水解方法酸水解方法v6N-HCl 110C(N2氛氛围围)22-72

15、 hoursl色氨酸色氨酸,半胱氨酸半胱氨酸,蛋氨酸蛋氨酸分析不能用此水分析不能用此水解方法解方法(可用其它方法可用其它方法).l天冬天冬酰酰胺酸和胺酸和 谷氨酸谷氨酸 转换转换成酸的形式。成酸的形式。POWER038.PPT蛋白蛋白质质水解水解(2)碱水解方法碱水解方法v4N NaOH 110C(N2 氛氛围围)16-24 hoursl这这一方法用于一方法用于色氨酸色氨酸POWER038.PPT蛋白蛋白质质水解水解(3)过过甲酸氧化方法甲酸氧化方法vA/B=5/95 110C(N2 氛氛围围)A:30%过过氧化氧化氢氢B:90%甲酸甲酸 22-72 hl这这一方法用于一方法用于 半胱氨酸、胱

16、氨酸和蛋氨酸半胱氨酸、胱氨酸和蛋氨酸分析分析POWER038.PPT盐盐酸水解方法酸水解方法实实例例 从胰腺得到的胰从胰腺得到的胰岛岛素中素中的水解氨基酸分析的水解氨基酸分析POWER038.PPT氨基酸残留基氨基酸残留基团测团测定定值值和理和理论值论值比比较较POWER038.PPT 碱水解方法碱水解方法实实例例意大利草中水解氨基酸分析意大利草中水解氨基酸分析POWER038.PPT过过甲酸氧化方法甲酸氧化方法实实例例人人发发中水解氨基酸分析中水解氨基酸分析POWER038.PPT样样品稀品稀释释0.2N 柠柠檬酸檬酸钠缓钠缓冲液冲液(pH 2.2)0.2N 柠柠檬酸檬酸锂缓锂缓冲液冲液(pH 2.2)用于稀用于稀释样释样品品稀稀释释后的最佳后的最佳浓浓度度约为约为 5 nmol/ml-10 m mmol/ml.POWER038.PPT过滤过滤进样进样前前应应使用使用 0.45 m mm孔径的孔径的滤滤膜膜过滤样过滤样品品