蛋白质组学的研究.pptx

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1、蛋白组学研究蛋白组学研究制作：第五组全体组员制作：第五组全体组员网络药理学的研究方法网络药理学系统生物学基因组学代谢组学网络生物学分子对接蛋白组学一、蛋白质组学研究背景一、蛋白质组学研究背景“proteome”(蛋白质组)一词由澳大利亚Macquaie大学的MarcWilkins于1994年首次提出。指一个基因组、一种生物或一种细胞/组织所表达的全套蛋白质。含义含义2001年2月，Nature和Science杂志在公布人类基因组序列草图的同时，分别发表了“Andnowfortheproteome”和“Proteomicsingenomeland”的述评与展望，对蛋白质组学研究发出了时代性呼唤。

2、2001年，国际人类蛋白质组组织(HumanProteomeOrganization,HUPO)成立，提出了人类蛋白质组计划（HPP)，(http:/www.hupo.org/)。众多国家和地区成立蛋白质组学术组织并踊跃参与国际计划。二、研究目的 蛋白质组学是识别及鉴定蛋白质以及其表达模式，是发现大量新型生物标志物、药靶和药物的重要途径，已经成为世界各国奋力抢占的战略制高点。三、蛋白组学研究对象以蛋白质组为研究对象，分析细胞内动态变化的蛋白质组成成分、表达水平与修饰状态，了解蛋白质之间的相互作用与联系，在整体水平上研究蛋白质的组成与调控的活动规律。蛋白质组学运用“一网打尽”的“组学”研究模式，

3、与以往研究单个蛋白质的“钓鱼”模式有所不同。四、研究范围1、细胞、组织和体液中蛋白质数量和种类的确定和鉴别2、细胞在正常生理情况和异常情况下蛋白质表达水平的差异。4、蛋白质和蛋白质、蛋白质和糖、脂类、DNA、RNA的相互作用等。3、蛋白质翻译的后修饰以及蛋白质的转运和定位。五、蛋白质组研究技术体系总流程图样品制备的一般过程除去非蛋白质部分提取全部蛋白质断开蛋白质之间的连接键失活和还原溶解对细胞、组织等样品进行破碎样品制备直接影响到蛋白质组研究结果.对于一些特殊的蛋白质处理如下：溶解度差的蛋白质,如膜蛋白、与膜相连的蛋白质以及来自具有高抗性组织(头发、皮肤等等)的蛋白质,需要添加破膜剂、兼性离子

4、表面活性剂等以增加蛋白质的溶解度,提高蛋白质的提取率.有报道采用有机溶剂提取亲脂性蛋白;或采用不同溶出缓冲液多步提取各种膜蛋白.蛋白组学核心技术双向凝胶电泳技术质谱鉴定技术计算机图像数据处理与蛋白质组数据库双向凝胶电泳一是基于蛋白质的等电点不同在pH梯度胶内等电聚焦二是根据分子量的不同大小进行聚丙烯酰胺凝胶电泳SDSPAGE分离，把复杂蛋白质混合物中的蛋白质在二维平面上分开。基本原理双向凝胶电泳研究程序样品制备等电聚焦聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶染色挖取感兴趣的蛋白质点胶内酶切质谱分析确定肽指纹图谱质谱分析部分氨基酸序列利用数据库确定蛋白判断双向凝胶电泳的好坏通过分析其图谱而获得.一张好的图谱必须低

5、背景、少纹理、分辨率高、灵敏度高,而且图谱之间必须存在良好的重现性.双向凝胶电泳蛋白质点的矢量图(vectormapofthe2-Dgel)是专门用来研究蛋白质翻译后是否修饰的一种方法,通过此法能了解蛋白质翻译后修饰程度.质谱鉴定技术电喷雾电离(ESI)连续离子化方式使样品电离基质辅助激光解吸电离(MALDI)以脉冲离子化方式使样品电离“软电离”技术电喷雾电离(ESI)ESI技术已经 运 用 到 四 极 杆 质 谱、飞 行 时 间 质 谱(TOF)、离子阱质谱(ITMS)和傅里叶变换离子回旋加速器质谱(FTMS),但还不能用于磁质谱中.ESI作为液相进样,它可以与高效液相色谱(HPLC)、毛细

6、管电泳(CE)等技术相连.双向凝胶电泳分离直接导入带有 ESI的串联质谱(MS/MS)分析仪中:HPLC-MS/MS适合含10pmol以上的肽样品;毛细管 HPLC-MS/MS适合含几个皮摩尔到几十个飞摩尔肽样品;CE-MS/MS适合含飞摩尔或更低肽样品,此仪器灵敏度最高.LC-MS/MS已经实现了自动化;固相提取毛细管区带电泳与串联质谱联用初步实现自动化基质辅助激光解吸电离(MALDI)MALDI常与飞行时间质谱(TOF-MS)联用,称为基质辅助激光解吸电 离飞行时 间质谱(MALD-ITOF-MS).目前蛋白质的肽指纹谱(peptidefingerprinting,PMF)测 定 常 用M

7、ALDI-TOF-MS,也有用 ES-IMS.这两种方法精确度高,均可达 011个质量单位;灵敏度高,分解亚皮摩尔量的蛋白质,所产生的小肽段,也可以做质谱 分 析;分 析 时 间 短,测 定 仅 需 几 分 钟.例如：MALD-ITOF-MS测定蛋白质肽指纹谱已经实现了高度自动化集成系统在不到 10个工作日内鉴定了大肠杆菌双向凝胶上 95个蛋白质点.目前,有两种分离、鉴定蛋白质的方法类似于双向凝胶电泳:一种是采用双向高效液相与质谱联用来鉴定蛋白质质谱数据的数据库检索:三条有 46个肽段质量肽段便可用来鉴定蛋白质,根据所测数据,可采用不同的软件检索:PeptideSearch、TagIdent、

8、MassSearch、Ms-Fit、ProFound、M-sEdman、MOWSE、Ms-Tag、PepFrag、Sequest、MutiIdent.另一种是采用等电聚焦-固相 pH梯度(IEF-IPG)作为第一向，分离质谱测定分子质量作为第二向.综上所述：质谱鉴定蛋白质,其优点是灵敏度高、准确度高,而且容易实现自动化.因此,质谱技术是蛋白质组研究中最重要的鉴定技术.蛋白质组数据库蛋白质组数据库贮存了有机体、组织或细胞所表达的全部蛋白质信息,通过用鼠标点击双向凝胶图谱上的蛋白质点获得这些信息,如蛋白质鉴定结果;蛋白质的亚细胞定位;在不同条件下有机体、组织或细 胞蛋 白质 的表达 水平 等.目前

9、仅有酵母蛋白质组数据库(YPD,http:/)是完整的蛋白质组数据库,其他数据库需要不断完善.目前 可用 Make2ddb软件来构建蛋白质组的双向凝胶数据库.查找蛋白质组数据库网址是2Dhunt(http:/www.expasy.ch/ch2d/2DHunt),一个有机体、组织或细胞的蛋白质组数据库可能由不同研究小组构建,它们各有特点,检索时数据库之间互相连接,可用索引检索:WORLD-2DPAGE(http:/www.expasy.ch/ch2d/2d-index.html).同基因组静态过程相比较,蛋白质组是一种动态过程.蛋白组学研究其他方法与技术1.生物质谱技术2.生物传感芯片质谱3.同

10、位素标记和标签技术（ICAT）4.蛋白质芯片5.酵母双杂交系统6.噬菌体展示技术7.串联亲和纯化（TAP）8.生物信息学方法生物质谱技术 基本原理是在样品离子化后，根据不同离子质荷比(-nz)的不同进行分离并确定相对分子量，具有灵敏度高、准确度高且易于实现自动化等优。成为蛋白质鉴定分析的主要支撑技术。生物质谱还可应用于定量蛋白质组分析、蛋白质翻译后修饰(如糖基化、磷酰化)以及蛋白质相互作用等研究领域。生物传感芯片质谱 是定性和定量检测蛋白质相互作用并对其进行鉴定的简易方法。它是以表面等离子激原共振SPR为基础的生物分子相互作用分析技术与质谱技术有机结合而形成的新型技术。同位素标记和标签技术（I

11、CAT）是用具有不同质量的小分子试剂ICAT去标记处于不同状态下的细胞中的蛋白质，再利用串联质谱技术，就能非常准确地比较出两份样品中蛋白质表达水平的不同。目前ICAT已成为蛋白质组研究的核心技术之一。蛋白质芯片 原理是利用蛋白质与蛋白质、酶与底物、蛋白质与其他小分子之间的相互作用，检测分析蛋白质。在硅物质如玻璃等固相支持物表面高密度排列的探针蛋白点阵，通过如抗原一抗体专一性结合等各种相互作用，可特异地捕获样品中的靶蛋白，然后通过检测器对靶蛋白进行定性或定量分析 广泛应用于蛋白质表达谱的分析、蛋白质功能及蛋白质-蛋白质相互作用的研究、临床疾病的诊断和疗效评价、药物信爬电的筛选和新药研制的各个领域

12、。酵母双杂交系统 基本思路是只有靶蛋白和诱饵蛋白特异结合后，其中的诱饵蛋白结合于报道基因的启动子才能启动报道基因在酵母细胞内的表达，通过检测报道基因表达产物判别作为“诱饵”和“靶蛋白”的两个蛋白间是否存在相互作用。噬菌体展示技术 将编码噬菌体外壳蛋白的基因上连接个单克隆抗体的基因序列当噬菌体生长时，表面就会表达出相应的单抗将噬菌体过柱，检测单抗与柱上目的蛋白的特异性结合。串联亲和纯化（TAP）集成了经典的亲和纯化和免疫共沉淀这两种技术的优点，可像前者得到高纯度、低拷贝数的蛋白质复合体，也继承了后者运用特异性的标记蛋白与亲和柱之间的相互作用。可快速地得到生理条件下与目标蛋白存在真实相互作用的蛋白

13、质。生物信息学方法 生物信息学是在生命科学、计算机科学和数学的基础上逐步发展而形成的一门新兴交叉学科。生物信息学的研究内容已经从对基因组和蛋白质组数据的高效分析，转移到比较基因组学、代谢网络分析、基因表达谱网络分析、蛋白质结构与功能分析以及药物靶点筛选等领域。六、蛋白质组学的应用蛋白质组学主要应用：在微生物研究中，主要在模式微生物以及病原微生物这两大方面。在模式微生物中，主要是大肠杆菌和酵母的蛋白质组学研究。一些专门收录微生物蛋白质组的数据库日益完善。实例(一)在病原微生物方面，2006年Tahefi21将HIV主要衣壳蛋白p24-gag展示在T4噬菌体的hoc蛋白上，将带有p24的噬菌体免疫

14、小鼠除产生了高效价的抗体外，还触发机体体液免疫和细胞免疫的参与。实例(二)ZhangY等27用结肠癌细胞SW480和人正常的肠上皮细胞对噬菌体7肽库进行了多轮筛选,结果显示CP15(VHLGYAT)与结肠癌细胞SW480结合率高，而对正常的肠上皮细胞几乎不结合，为诊断结肠癌和开发治疗结肠癌药物奠定了基础。Bacarese-Hamilton等22将5种病毒的抗原点在玻片上制成抗原芯片，用于分析人血清IgG、IgM，结果表明，检测浓度最低小于0.5pg。与ELISA检测的符合率大于80%。蛋白质组学在其他领域也有广泛的应用，如在植物学以及药物开发和评价上等。实例(三)本研究针对激素性骨坏死模型组，

15、中药治疗组及空白对照组骨组织总蛋白质的双向电泳图谱进行比较，获得了3个差异蛋白。随后对这3个差异蛋白进行了质谱分析，得到其肽质量指纹谱，通过数据库MASCOT软件搜索对三个蛋白进行了初步鉴定。该研究操作步骤得出结果数据库查询质谱分析质谱样品的制备双向电泳动物骨组织蛋白样品提取和处动物处理材料和试剂1、不同对照组大鼠骨组织蛋白双向电泳图谱的比较2、不同对照组大鼠骨组织蛋白双向电泳图谱差异点3、不同对照组大鼠骨组织蛋白2-DE图谱中差异蛋白点的肽质量指纹图谱4、P1，P2，P3在数据库搜索的结果结果P1搜索到一种蛋白质与之相匹配，即阻凝蛋白重链B。P2在数据库中检索到一种与之相匹配的蛋白质，即磷脂

16、谷胱甘肽过氧化酶，P3在数据中搜索到一种与之相匹配的蛋白质，即泛素化酶E2(MW：17KD)。意义通过蛋白质组学研究的方法，研究了激素性坏死模型组、中药治疗组以及对照组的骨组织蛋白质组的表达变化情况，并利用质谱分析结合蛋白质数据查询，初步鉴定了其中的差异蛋白质点，经过分析，结合文献资料总结，这些蛋白质在不同疾病中都确实与糖皮质激素作用相关，这为揭示激素性骨坏死的发病机理和中药的治疗机理，提供了全新的实验证据，能够大大推进我们从分子水平认识激素性骨坏死的发病机理，并为中药的作用机理找到确实的依据，为推广其临床应用，提供了宝贵数据。七、蛋白组学存在的问题尽管蛋白质组学应用前景广阔、研究成果丰硕，但

17、仍然存在许多不足。如2DE的灵敏度虽然已达fmol水平，但仍难将细胞组织内多种痕量调控蛋白分离显示出来，而此类蛋白对于基础与应用研究都极为重要（甚至比高含量结构蛋白更为重要）。此外，现有质谱技术虽然在蛋白质组成分的鉴定中高效、灵敏、特异，但仪器价格十分昂贵，因此技术推广受到很大的限制。现今的蛋白质组研究仍局限于对已完成基因组计划的理论预测的蛋白质组进行实证分析。未来的蛋白质组学应该摆脱基因组学的束缚，在真正意义上实现蛋白质的体外合成、体外加工与修饰，以及简单方便的蛋白测序与鉴定等。七、对我国蛋白组学发展建议第一，系统完善蛋白质组学研究支撑技术平台，全面发展相关新技术新方法并广泛推广应用第二，针对我国有较好研究基础及具有重要生理功能或/和重大应用价值的生物体/组织/细胞，系统建立其蛋白质组或亚蛋白质组的“两谱”(表达谱和修饰谱)、“两图”(连锁图和定位图)第三，开展针对上述生物体/组织/细胞的蛋白质之间作用机制的功能蛋白质组研究第四，以关系我国国计民生的人畜重大疾病、重要生物资源为对象，建立疾病多层面、多阶段、多病种的比较蛋白质组学分析策略第五，发展完整、系统的蛋白质组学生物信息分析体系，开展系统生物学研究。在组织管理方面谢谢！