1DNA重组技术的基本工具(王凯辉).pptx

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1、生物选修生物选修3现代生物科技专题现代生物科技专题目目 录录专题1 基因工程专题2 细胞工程专题3 胚胎工程专题4 生物技术的安全性和伦理问题专题5 生态工程专题专题1 基因工程基因工程 是指按照人们的愿望，进行严格的设计，是指按照人们的愿望，进行严格的设计，并通过并通过体外体外DNA重组和转基因重组和转基因等技术，赋等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。合人们需要的新的生物类型和生物产品。一、基因工程的概念一、基因工程的概念 由于基因工程是在由于基因工程是在DNA分子水平上进行设分子水平上进行设计和施工的，因此又

2、叫做计和施工的，因此又叫做DNA重组技术重组技术。基因工程的别名操作环境操作对象操作水平基本过程原理（实质）结 果基因拼接技术或基因拼接技术或DNADNA重组技术重组技术生物体外生物体外基基 因因DNADNA分子水平分子水平定向地改造生物的遗传性状，产生定向地改造生物的遗传性状，产生人类需要的基因产物人类需要的基因产物剪切剪切 拼接拼接 导入导入 表达表达基因重组基因重组二、基础理论和技术的发展催生了基因工程二、基础理论和技术的发展催生了基因工程 20世纪中叶，基础理论取得了重大突破1.DNA是遗传物质的证明2.DNA双螺旋结构和中心法则的确立3.遗传密码的破译二、基础理论和技术的发展催生了基

3、因工程二、基础理论和技术的发展催生了基因工程 20世纪中叶，基础理论取得了重大突破1.DNA是遗传物质的证明2.DNA双螺旋结构和中心法则的确立3.遗传密码的破译技术发明使基因工程的实施成为可能1.基因转移载体的发现2.工具酶的发现3.DNA合成和测序技术的发明4.DNA体外重组的实现5.重组DNA表达实验的成功6.第一例转基因动物问世7.PCR技术的发明问题探讨：问题探讨：苏云金芽孢杆菌含有一苏云金芽孢杆菌含有一种可以合成毒蛋白的基因。种可以合成毒蛋白的基因。让细菌的毒蛋白基因在让细菌的毒蛋白基因在棉花细胞中表达，可培育出棉花细胞中表达，可培育出抵抗棉铃虫害的抗虫棉。抵抗棉铃虫害的抗虫棉。苏

4、云金芽孢杆菌苏云金芽孢杆菌毒蛋白毒蛋白毒蛋白毒蛋白普通棉花抗虫棉普通棉花抗虫棉普通棉花抗虫棉普通棉花抗虫棉1.1 DNA重组技术的基本工具重组技术的基本工具想一想：需要做哪些关键工作？需要做哪些关键工作？基因工程培育抗虫棉的简要过程：基因工程培育抗虫棉的简要过程：普通棉花普通棉花(无抗虫特性无抗虫特性)苏云金杆菌苏云金杆菌提取提取提取提取抗虫基因抗虫基因与运载体与运载体与运载体与运载体DNADNA拼接拼接拼接拼接导入导入导入导入棉花细胞棉花细胞(含含抗虫基因抗虫基因)棉花植株棉花植株(有有抗虫特性抗虫特性)上述培育抗虫棉的关键步骤是什么？上述培育抗虫棉的关键步骤是什么？1.1 DNA重组技术的

5、基本工具重组技术的基本工具基因工程培育抗虫棉的关键步骤：基因工程培育抗虫棉的关键步骤：关键步骤一：关键步骤一：从苏云金杆菌细胞内从苏云金杆菌细胞内提取出提取出抗虫基因抗虫基因关键步骤二：关键步骤二：抗虫基因与抗虫基因与运载体运载体DNA拼接拼接关键步骤三：关键步骤三：抗虫基因抗虫基因导入受体导入受体(棉花棉花)细胞细胞1.1 DNA重组技术的基本工具重组技术的基本工具准确切割DNA的工具“分子手术刀”DNA片段的连接工具“分子缝合针”基因转移工具“分子运输车”基因的大小以纳米计算，要对它进行剪切、基因的大小以纳米计算，要对它进行剪切、拼接等操作，没有非常精细的工具是不行的。进拼接等操作，没有非

6、常精细的工具是不行的。进行基因操作最少需要以下三种工具：行基因操作最少需要以下三种工具：DNA重组技术的基本工具重组技术的基本工具思考：思考：1.在自然界中有一些生物的DNA可能进入另一种生物的细胞中。我们有没有学过相关的实例？2,现今存在的生物为什么没有在长期的进化过程中被外源DNA的入侵而灭绝，仍能保持一种稳定状态？原核生物细胞中的限制酶会将外源原核生物细胞中的限制酶会将外源DNA切割切割掉，使之失效，以保证自身的安全，但是不会掉，使之失效，以保证自身的安全，但是不会切割自身的切割自身的DNA，这是原核生物在长期进化过，这是原核生物在长期进化过程中形成的一套防御机制。程中形成的一套防御机制

7、。一、限制性核酸内切酶一、限制性核酸内切酶“分子手术刀分子手术刀”来源：来源：主要主要从从原核生物原核生物中分离纯化出来。中分离纯化出来。种类：种类：已从近已从近300种微生物中分离出约种微生物中分离出约4000种种限制酶。限制酶。作用：作用：1.能能识别识别双链双链DNA的某种的某种特定核苷酸序列特定核苷酸序列2.使每条链中使每条链中特定部位特定部位的两个核苷酸之间的的两个核苷酸之间的磷酸二酯键磷酸二酯键断开。断开。磷酸二酯键：磷酸二酯键：具有具有特异性特异性。一种一种限制酶限制酶只能识别一种只能识别一种特定的特定的核苷酸序列核苷酸序列，并且能在并且能在特定的切点特定的切点上切割上切割DNA

8、分子，分子，作用特点：作用特点：大多数大多数限制酶的识别序列由限制酶的识别序列由6 6个个核苷酸组成核苷酸组成少数的识别序列由少数的识别序列由4 4、5 5或或8 8个核苷酸组成个核苷酸组成限制酶的识别序列：限制酶的识别序列：一、限制性核酸内切酶一、限制性核酸内切酶“分子手术刀分子手术刀”形成两种末端形成两种末端粘性末端粘性末端平末端平末端EcoEcoRIRI限制酶的限制酶的切割切割切割切割：SmaSmaI I限制酶的限制酶的限制酶的限制酶的切割切割切割切割G A A T T C C T T A A G 中轴线中轴线C T T A A G A A T T C G C C C G G G G G

9、 G C C C C C C G G G G G G C C C 黏性末端黏性末端平末端平末端大肠杆菌的一种限制酶（大肠杆菌的一种限制酶（EcoR)能识别能识别GAATTC序列，序列，Sma识别识别CCCGGG序列序列:磷酸二酯键磷酸二酯键即脱氧核糖、磷酸即脱氧核糖、磷酸之间的连接之间的连接AAT TGGGGCCAAT TCCT TT TCCGGAAAA 限制酶切割限制酶切割DNA后形成的末后形成的末端端黏性末端、平末端是如黏性末端、平末端是如何形成的？何形成的？思考：思考：什么叫黏性末端？什么叫黏性末端？当限制酶当限制酶从识别序列的中心轴线两侧切从识别序列的中心轴线两侧切开时，开时，被限制酶

10、切开的被限制酶切开的DNA两条单链的切两条单链的切口，带有几个口，带有几个伸出的核苷酸伸出的核苷酸，他们之间正，他们之间正好好互补配对互补配对，这样的切口叫，这样的切口叫黏性末端黏性末端。什么叫平末端？什么叫平末端？当限制酶当限制酶从识别序列的中心轴线处切开从识别序列的中心轴线处切开时，时，切开的切开的DNA两条单链的切口，是平整两条单链的切口，是平整的，这样的切口叫的，这样的切口叫平末端平末端。coRI限制酶SmaI限制酶识别序列切割位点切割位点和之间和之间和之间和之间未端类型未端类型平末端平末端黏性末端黏性末端4、切割后的形式：2种末端注：1.限制酶是一大类酶，不是一种酶。2.限制酶大多可

11、以专一性识别双链DNA分子上的某种特定核苷酸序列，限制酶所识别的序列，无论是6个碱基还是4个碱基，都可以找到一条中心轴线，中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称，重复排列的。3.如果所识别的序列是奇数如5个碱基,则中轴线在中间的碱基对上,除了中轴线外,两侧的双链DNA上的碱基是反向对称黏性末端黏性末端平末端平末端1.1.要想获得某个特定性状的基因必须要用限制酶切几要想获得某个特定性状的基因必须要用限制酶切几要想获得某个特定性状的基因必须要用限制酶切几要想获得某个特定性状的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性个切口？可产生几个黏性个切口？可产生几个黏性个切口？可产生几个黏性(平平平平)

12、末端？末端？末端？末端？要切两个切口，产生四个黏性要切两个切口，产生四个黏性(平平)末端。末端。3.3.如果把两种来源不同的如果把两种来源不同的如果把两种来源不同的如果把两种来源不同的DNADNA用同一种限制酶来切用同一种限制酶来切用同一种限制酶来切用同一种限制酶来切割，会怎样呢？割，会怎样呢？割，会怎样呢？割，会怎样呢？会产生会产生相同的黏性相同的黏性(平平)末端末端，然后让两，然后让两者的黏性者的黏性(平平)末端末端黏合黏合起来，就似乎可以合起来，就似乎可以合成重组的成重组的DNA分子了。分子了。思考思考?2.切下的特定片段上有几个黏性(平)末端?如果直接用DNA连接酶连接会出现什么情形?

13、两个黏性(平)末端;会出现自身环化现象4.如何避免自身环化现象?分别用不同的限制酶切割两个部位,这样就不会出现相同的黏性(平)末端.思考与探究思考与探究为什么限制酶不剪切细菌本身的为什么限制酶不剪切细菌本身的DNADNA？通过长期的进化，细菌中含有某种限通过长期的进化，细菌中含有某种限制酶的细胞，其制酶的细胞，其DNA分子中或者分子中或者不具备不具备这这种限制酶的种限制酶的识别切割序列识别切割序列，或者通过甲基，或者通过甲基化酶化酶将甲基转移将甲基转移到所到所识别序列识别序列的碱基上，的碱基上，使使限制酶不能将其切开限制酶不能将其切开。这样，尽管细菌。这样，尽管细菌中含有某种限制酶也不会使自身

14、的中含有某种限制酶也不会使自身的DNA被被切断，并且可以防止外源切断，并且可以防止外源DNA的入侵。的入侵。DNADNA聚合酶聚合酶DNADNA连接酶连接酶区别区别1 1区别区别2 2相同点相同点DNA连接酶与连接酶与DNA聚合酶是一回事吗聚合酶是一回事吗?为什么为什么?1)1)只能将只能将单个核苷酸单个核苷酸连连接到已有的核酸片段上，接到已有的核酸片段上，形成磷酸二酯键形成磷酸二酯键形成形成磷酸二酯键磷酸二酯键1)1)在在两个两个DNADNA片段之片段之间间形成磷酸二酯键形成磷酸二酯键2)2)以以一条一条DNADNA链为模板链为模板，将将将将单个核苷酸单个核苷酸单个核苷酸单个核苷酸通过磷酸通

15、过磷酸通过磷酸通过磷酸二酯键二酯键二酯键二酯键连接成一条互补连接成一条互补的的DNADNA链链2)2)将将DNADNA双链上的双链上的两两个缺口同时连接个缺口同时连接起来，起来，不需要模板不需要模板二、二、DNA连接酶连接酶“分子缝合针分子缝合针”二、二、DNADNA连接酶连接酶“分子缝合针分子缝合针”1 1、作用：、作用：形成磷酸二酯键形成磷酸二酯键恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。的磷酸二酯键。2、类型：、类型：类型EcoliEcoliDNADNA连接酶连接酶连接酶连接酶T T4 4DNADNA连接酶连接酶连接酶连接酶来源来源来源来源功能功能功能

16、功能大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌T T4 4噬菌体噬菌体噬菌体噬菌体恢复恢复恢复恢复磷酸磷酸磷酸磷酸二酯键二酯键二酯键二酯键只能连接只能连接只能连接只能连接黏性末端黏性末端黏性末端黏性末端能连接能连接能连接能连接黏性末端黏性末端黏性末端黏性末端和和和和平末端平末端平末端平末端(效率较低效率较低效率较低效率较低)相同点相同点相同点相同点差别差别差别差别二、二、DNA连接酶连接酶“分子缝合针分子缝合针”DNA聚合酶将将外源基因外源基因送入送入受体细胞受体细胞。载体的作用：载体的作用：三、基因进入受体细胞的载体三、基因进入受体细胞的载体 “分子运输车分子运输车”作为载体的必要条件：作为载体的必要

17、条件：有切割位点有切割位点有切割位点有切割位点供外源供外源供外源供外源DNADNA片段片段片段片段(基因基因基因基因)插入。插入。插入。插入。能自我复制能自我复制能自我复制能自我复制并能带着插入的目的基因一起复制并能带着插入的目的基因一起复制并能带着插入的目的基因一起复制并能带着插入的目的基因一起复制有遗传标记基因有遗传标记基因有遗传标记基因有遗传标记基因供重组供重组供重组供重组DNADNA的鉴定和选择。的鉴定和选择。的鉴定和选择。的鉴定和选择。载体载体载体载体DNADNA必需是安全的必需是安全的必需是安全的必需是安全的不会对受体细胞有害，或不不会对受体细胞有害，或不不会对受体细胞有害，或不不

18、会对受体细胞有害，或不能进入到除受体细胞外的其他生物细胞中去。能进入到除受体细胞外的其他生物细胞中去。能进入到除受体细胞外的其他生物细胞中去。能进入到除受体细胞外的其他生物细胞中去。载体载体载体载体DNADNA分子大小应适合分子大小应适合分子大小应适合分子大小应适合以便提取和在体外进行操以便提取和在体外进行操作，太大就不便操作。作，太大就不便操作。实际上自然存在的质粒实际上自然存在的质粒DNA分子并不完全具备上述条分子并不完全具备上述条件，都要进行人工改造后才能用于基因工程操作。件，都要进行人工改造后才能用于基因工程操作。质粒：质粒：裸露的、结构简单的、裸露的、结构简单的、独立于细菌独立于细菌

19、拟拟核核DNA之外，并具有之外，并具有自我复制自我复制能力的很小能力的很小的双链的双链环状环状DNA分子。分子。三、基因进入受体细胞的载体三、基因进入受体细胞的载体 “分子运输车分子运输车”质粒质粒质粒：能复制并带着能复制并带着能复制并带着能复制并带着插入的目的基插入的目的基插入的目的基插入的目的基因一起复制因一起复制因一起复制因一起复制有切割位点有切割位点有切割位点有切割位点有标记基因的有标记基因的有标记基因的有标记基因的存在，可用含存在，可用含存在，可用含存在，可用含氨苄青霉素的氨苄青霉素的氨苄青霉素的氨苄青霉素的培养基鉴别。培养基鉴别。培养基鉴别。培养基鉴别。三、基因进入受体细胞的载体三

20、、基因进入受体细胞的载体 “分子运输车分子运输车”说明没有危害，说明没有危害，大肠杆菌是非致大肠杆菌是非致病菌，且分裂快，病菌，且分裂快，也便于从大量复也便于从大量复制个体中分离出制个体中分离出来来。质粒质粒 噬菌体的衍生物噬菌体的衍生物动植物病毒等动植物病毒等载体的种类：载体的种类：三、基因进入受体细胞的载体三、基因进入受体细胞的载体 “分子运输车分子运输车”小结小结基因工程基因工程的工具的工具限制酶限制酶主要存在于原核生物中主要存在于原核生物中具有专一性具有专一性(识别序列识别序列)切开切开DNA分子的磷酸二酯键分子的磷酸二酯键DNA连连接酶接酶连接磷酸二酯键连接磷酸二酯键种类种类E.co

21、liDNA连接酶连接酶T4 DNADNA连接酶连接酶运载运载工具工具条件条件结构小而稳定结构小而稳定能自我复制能自我复制具多个限制酶切位点具多个限制酶切位点具标记基因等具标记基因等质粒、质粒、噬菌体衍生物、噬菌体衍生物、动植物动植物病毒等病毒等随堂练习随堂练习1 1、关于限制酶的说法中，正确的是（、关于限制酶的说法中，正确的是（）A A、限制酶是一种酶，只识别、限制酶是一种酶，只识别GAATTCGAATTC碱基序列碱基序列B B、EcoRIEcoRI切割的是切割的是GAGA之间的氢键之间的氢键C C限制酶一般不切割自身的限制酶一般不切割自身的DNADNA分子，只切割外源分子，只切割外源DNAD

22、NAD D限制酶只存在于原核生物中限制酶只存在于原核生物中答案：答案：C2.（多选）（多选）有关基因工程的叙述中，错误的有关基因工程的叙述中，错误的是是 A、基因工程技术能定向地改造生物的遗、基因工程技术能定向地改造生物的遗传性状，培育生物新品种传性状，培育生物新品种 B、重组、重组DNA的形成在细胞内完成的形成在细胞内完成 C、目的基因须由运载体导入受体细胞、目的基因须由运载体导入受体细胞 D、质粒都可作为运载体、质粒都可作为运载体答案：答案：BD3、不属于质粒被选为基因运载体的理由是、不属于质粒被选为基因运载体的理由是 A、能复制、能复制 （）B、有多个限制酶切点、有多个限制酶切点 C、具有标记基因、具有标记基因 D、它是环状、它是环状DNA答答案案：D7、下列四条、下列四条DNA分子，彼此间具有黏性末分子，彼此间具有黏性末 端的一组是（端的一组是（）A B C DD4）有关基因工程的叙述正确的是）有关基因工程的叙述正确的是 （）A、限制酶只在获得目的基因时才用、限制酶只在获得目的基因时才用 B、重组质粒的形成在细胞内完成、重组质粒的形成在细胞内完成 C、质粒都可作为运载体、质粒都可作为运载体 D、蛋蛋白白质质的的结结构构可可为为合合成成目目的的基基因因提提供供资料资料D