第五章 酶工程.pptx

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1、第五章第五章 酶工程酶工程酶工程定工程定义n定义:将酶所具有的生物催化功能,借助工程手段应用于社会生活的一门科学技术；利用酶催化的作用,在一定的生物反应器中,将相应的原料转化为所需要的产品；利用酶、细胞器或细胞的特异催化功能，通过适当的反应器工业化生产人类所需产品或达到某种特殊目的的一门技术科学。(大唐搜索)n领域:酶学理论与工程技术相结合而形成的新技术“酶工程”的定义运用运用酶学知学知识结合数学和合数学和/或其他系或其他系统性知性知识设计有有实用价用价值的新的新酶(生物催化生物催化剂，固定化生物催化，固定化生物催化剂，生物催化反，生物催化反应体体系系,生物催化反生物催化反应器。器。)一门研究

2、如何发挥酶的催化功能的技术科学http:/ Mechanism of Enzyme Catalysis酶与过渡态中间物的紧密结合，稳定了底物的过渡态结构，从而降低了底物形成其过渡态所需克服的能垒，提高了反应的速度酶的命名的命名氧、氧、转、水、裂、异、合、水、裂、异、合(连)1.Oxidoreductases 氧化还原酶2.Transferases 转移酶3.Hydrolases 水解酶4.Lyases 裂合酶5.Isomerases 异构酶6.Ligases 连接酶 ATP水解偶联国际酶学委员会国际酶学委员会 Enzyme Commission(EC)酶知知识复复习小小结n酶是有催化活力的蛋白

3、质n酶与过渡态中间物的紧密结合，稳定了底物的过渡态结构，从而降低了底物形成其过渡态所需克服的能垒，提高了反应的速度n酶分为6大类，酶的命名可以在http:/us.expasy.org/enzyme上查询酶的生产方法酶的生产方法重组表达系统酶的分离提取酶的固定化技术酶反应器酶工程的工程的历史史酶的历史在麦芽中发现淀粉酶18 33在胃中发现消化酶-胃蛋白酶18 36 18 7318 73 从小牛胃提取凝乳酶用于制酪从小牛胃提取凝乳酶用于制酪Enzyme定名-意为在酵母中 18 78 钥匙-锁理论提出18 9418 94 以以米曲霉米曲霉生产淀粉酶作为消化酶生产淀粉酶作为消化酶中间产物学说米氏方程1

4、9 13 获得脲酶结晶酶是蛋白质19 26 19 49 液体深层发酵生产细菌-淀粉酶固定化酶19 53 操纵子学说酶生物合成机制19 60 19 6919 69 固定化固定化氨基酰化酶生产L-氨基酸19 73 基因工程技术19 78 定点突变技术19 8419 84 TyrRS TyrRS的的蛋白质工程19 86 重组酶生产19 93 定向进化19 9419 94 DNA shuffling DNA shuffling 酶的生的生产植物来源植物来源来源酶应用刀豆脲酶诊断木瓜木瓜蛋白酶烘焙，制酪，制革，嫩肉粉，啤酒澄清无花果无花果蛋白酶嫩肉粉菠萝菠萝蛋白酶烘焙辣根辣根过氧化物酶诊断柠檬糖苷酶科研

5、小麦酯酶酯水解与合成大麦淀粉酶烘焙，麦芽糖浆大豆淀粉酶烘焙，麦芽糖浆动物来源的工物来源的工业用用酶来源酶工业用途肝过氧化氢酶食品胰腺胰凝乳蛋白酶制革胰腺脂肪酶食品皱胃凝乳酶制酪胰腺胰蛋白酶皮革微生物来源的工微生物来源的工业用用酶EnzymeEC numberSourceIntra/extracellularScale of production Industrial useBacterial enzymesaAmylase3.2.1.1BacillusE+StarchbAmylase3.2.1.2BacillusE+StarchAsparaginase3.5.1.1Escherichia co

6、liIHealthGlucose isomerase 5.3.1.5BacillusI+Fructose syrupPenicillin amidase3.5.1.11BacillusIPharmaceuticalProtease3.4.21.14BacillusE+DetergentPullulanase3.2.1.41KlebsiellaEStarchFungal enzymesaAmylase3.2.1.1AspergillusE+BakingAminoacylase3.5.1.14AspergillusIPharmaceuticalGlucoamylase3.2.1.3Aspergil

7、lusE+StarchCatalase1.11.1.6AspergillusIFoodCellulase3.2.1.4TrichodermaEWasteDextranase3.2.1.11PenicilliumEFoodGlucose oxidase1.1.3.4AspergillusIFoodLactase3.2.1.23AspergillusEDairyLipase3.1.1.3RhizopusEFoodRennet3.4.23.6Mucor mieheiE+CheesePectinase3.2.1.15AspergillusE+DrinksPectin lyase4.2.2.10Aspe

8、rgillusEDrinksProtease3.4.23.6AspergillusE+BakingRaffinase3.2.1.22MortierellaIFoodYeast enzymesInvertase3.2.1.26SaccharomycesI/EConfectioneryLactase3.2.1.23KluyveromycesI/EDairyLipase3.1.1.3CandidaEFoodRaffinase3.2.1.22SaccharomycesIFood微生物微生物酶生生产率提高的手段率提高的手段n菌种选育 诱变育种n发酵工艺优化发酵工程n重组表达 基因工程酶制制剂n使用添加剂

9、 n共价修饰n固定化小小结n酶的来源很多，但主要来源于微生物发酵n酶的工业化应用取决于他们的效果，成本和安全性n离心一般用于收集含酶固体过滤更多用于液体酶回收双水相体系将会在酶回收操作中得到更多应用n制备工业用酶需尽量压缩分离提取步骤n酶制剂必须稳定，使用安全固定化固定化酶优点点n便于从反应体系中分离从而易于控制反应时间，减少酶失活n可反复使用降低用酶成本n提高酶稳定性缺点传质限制动力学性质发生变化固定化增加额外成本a.吸附吸附b.共价共价连接接c.包埋包埋d.膜限制膜限制酶的固定化方法酶的固定化方法多点作用使多点作用使酶稳定化定化固定化固定化载体体Eupergit C Sepabeads s

10、eries新型固定化方法新型固定化方法无无载体固定化体固定化Thedifferentapproachestotheproductionofcarrier-freeimmobilisedenzymes:(a)crystallization;(b)aggregation;(c)spray-drying;(d)directcross-linking.AGG,aggregates;CRY,crystals;SDE,spray-driedenzyme.固定化固定化酶小小结n酶的固定化使得他们能高效和连续使用n酶的固定化形式有4种n酶的固定化影响动力学性质n酶的固定化一般可提高其使用的经济性n酶的固定化新

11、技术无载体固定化酶反反应器器图解解小小结n重组微生物是酶的最重要来源n工业用酶的分离提取对成本敏感n固定化酶是工业用酶制剂的重要形式n酶反应器对于发挥酶的催化作用也很重要酶的改造酶的改造获得新得新酶的途径的途径n自然界中自然界中获取取n有理有理设计新新酶n随机方法随机方法筛选新新酶生物多样性与新酶的发现生物多样性与新酶的发现n嗜热菌（Thermophiles)n嗜冷菌（Phyphophiles)n嗜酸菌（Acidophiles)n嗜碱菌（Alkaliphiles)n嗜盐菌（Halophiles)n嗜压菌（Barophiles)极端微生物的特殊生长环境及代谢产物，使酶在“恶劣”环境下能够发挥高效

12、催化作用。目前已经有158种微生物的基因组被全测序S I Distribution for penicillin G acylasePGA precursor structure天然天然酶化学-转化天然底物物理-耐受差生物-代谢调控和高转换数环境不同要求不同n自然进化中 天然酶的结构功能对应于其活细胞的生理功能而进化的n天然酶往往不适用于生物技术应用改造目的改造目的高专一性高专一性只催化所需反应 减少甚至没有副产物高活性高活性高生产率 不易受抑制高稳定性高稳定性存放时间长 操作稳定性高生物催化剂应用依赖于天然酶改造或重新设计方法酶的改造的改造n蛋白质工程理性设计通过蛋白质化学、蛋白质晶体学和动

13、力学的研究获取关于蛋白质物理、化学等方面的信息，在此基础上对编码该蛋白的基因进行有目的的设计改造，并通过基因工程等手段将其进行表达和分离纯化，最终将其投入实际应用。基因工程，结构生物学和生物信息学n化学修饰n固定化n定向进化非理性设计有理有理设计根据详尽的结构功能关系知识结构一级结构氨基酸顺序二级结构a-螺旋,b-折叠,转角,无规卷曲三级结构3D 折叠(结晶，NMR)功能活性位点氨基酸残基和辅因子催化机理,特异性和动力学调节竞争性抑制和变构控制 怎么获得这些信息？怎么获得这些信息？经典途径典途径n纯化目标酶，分析氨基酸序列n分离基因并重组表达n结晶目标酶，X射线分析序列与序列与结构分析构分析n

14、多重联配序列保守性信息n结晶/同源模建获得立体结构n三维结构分析分子图像分析有理有理设计目目标n催化效率n稳定性热稳定性有机溶剂稳定性npH曲线提高提高热稳定性的重要全局性因素定性的重要全局性因素环区长度减少以及随之而来的二级结构增加表面电荷相互作用敏感氨基酸残基减少(如半胱氨酸，天冬酰胺和谷氨酰胺)芳香环堆积增加疏水作用增加金属离子结合能力提高寡聚增加常用提高稳定性方法引入二硫键和/或盐桥CCOOCCOOCCOOCCOOCCOOIndex 1Index 2Index 3Index 40OSP0.150.15OSP0.300.30OSP0.450.45OSP0.600.60OSP0.75Ful

15、ly exposed stateExposed stateBoundary stateBuried stateWell-buried stateIndex 5氨基酸残基分布差异氨基酸残基分布差异高PRO低MET低极显著低低SER（低）低（低）ASN高TYR高TRP低LYS高极显著高GLU高高ARG高ILE低VAL高极显著低极显著ALA完全包埋包埋部分包埋/部分暴露暴露完全暴露对于于热稳定性改造的具体指定性改造的具体指导n完全暴露完全暴露 SER,LYS ILEn暴露暴露 ALA,VAL,ASN,SER ARG,GLUn部分包埋部分包埋/部分暴露部分暴露 SER?n包埋：MET ARG,GLUn

16、完全包埋：?ALA,TRP,TYR,PROpH曲曲线的改的改变n将蛋白质表面变得更带负电荷将提高酸性基团的pKa值，因为它们在离子化时丢失质子。反之，将表面变得更带正电荷则降低所有酸性基团的pKa值。n低离子强度时变化将最大n如果避免多电荷抗衡离子，当离子强度高至0.1 M时会出现明显的变化。n突变设计应避免在活性中心空穴附近聚集抗衡离子。融合蛋白融合蛋白质广广义的有理的有理设计组氨酸标签组氨酸标签(Histidine-tag,his-tag)谷胱甘肽合成酶谷胱甘肽合成酶 (glutathione synthetase,GST)麦芽糖结合蛋白质麦芽糖结合蛋白质(maltose binding

17、protein,MBP)内含肽内含肽(Intein)各种信号肽各种信号肽改善重组蛋白可溶性，便于亲和层析纯化。改善重组蛋白可溶性，便于亲和层析纯化。生物催化生物催化剂的定向的定向进化化 进化进化 逐步过程自然进化自然进化自发突变重组自然选择达尔文进化理论 生命的复杂性是突变，重组和自然选择算法的结果人类的作物，花卉和家禽家畜育种实践有几千年历史加速进化 快速改变农业进化农业进化自发突变育种筛选革命 极快改变实验室进化实验室进化加快突变速度分子育种筛选实验室进化不同于自然进化在于其明确的进化目标.在此意义上它是“定向”并且更像育种。此外，它非常快。加速进化 快速改变农业进化农业进化自发突变育种筛

18、选革命 极快改变实验室进化实验室进化加快突变速度分子育种筛选进化进化 逐步过程自然进化自然进化自发突变重组自然选择定向定向进化的基本化的基本过程程Single geneDNA shufflingMultiple genesDNA family shufflingExpression and screenRepeated as neededComparison of single sequence shuffling versus sequence family shuffling高通量筛选无理设计的有理部分selection选择选择screening筛选筛选定向进化的应用定向进化的应用Bioc

19、atalystsBiocatalystsProtein DrugProtein DrugEvolved VectorEvolved VectorVaccineVaccineGene Gene TherapyTherapySmall Molecule Small Molecule PharmaceuticalsPharmaceuticalsAntibodyAntibodyStrain EvolutionStrain EvolutionMilestones in Directed Evolution Kauffman patent 85 DNA shuffling 94 Family shuffl

20、ing 98Genome shuffling 02 Genetic circuit 021st industrial biotechnololgy&bioprocessing 04 89.Applied Molecular Evolution94.Diversa97.Maxygen 99.00.IPOs;Maxygen,Diversa,AME,Genencor 02.Codexis&Verdia spinoff03.AME merger to Lilly04.Dupont,aq.Verdia(MaxyAg)04.Codexis&Pfizer collaboration20001990找到减少所需库容量的方法选择亲本基因发展高效快速的筛选方法发展智能测定定向进化的局限性 含100氨基酸的酶:有20100 种可能组合筛选包含所有可能突变体的库不现实：定向定向进化小化小结n定向进化是更有效的蛋白质改造方法n突变/重组方法成熟n筛选能力是成败关键有理有理设计设计与定与定向进向进化的化的有机有机结合结合将是将是解决解决复杂复杂酶设酶设计问计问题的题的有效有效途径途径选择起始基因重组表达，建立测活体系和/或筛选方法如果知道结构功能关系，第一步先采用有理设计方法此后，以随机突变技术微调得到的突变体,并辅以高效的体内或体外筛选小结小结 蛋白质工程实验策略蛋白质工程实验策略