m第十四章基因工程nai.pptx

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1、目目 录录临床医学院生物化学教研室佘集凯 基因重组和基因工程基因重组和基因工程 第第 十十 四四 章章目目 录录目目 录录第第 一一 节节DNA的重组的重组 DNA Recombination目目 录录DNA重组重组细菌的基因转移与重组细菌的基因转移与重组接合作用、转化作用、转导作用接合作用、转化作用、转导作用转转 座重组座重组同源重组同源重组特异位点的重组特异位点的重组目目 录录发发生生在在同同源源序序列列间间的的重重组组称称为为同同源源重重组组，又又称称基基本本重重组组。是是最最基基本本的的DNA重重组组方方式式，通通过过链链的的断断裂裂和和再再连连接接，在在两两个个DNA分分子子同同源序

2、列间进行单链或双链片段的交换。源序列间进行单链或双链片段的交换。以以E.coli的的同同源源重重组组为为例例，了了解解同同源源重重组组机制的机制的Holliday模型。模型。一、同源重组一、同源重组目目 录录Holliday模型中，同源重组主要模型中，同源重组主要4个关键步骤个关键步骤 两个同源染色体两个同源染色体DNA排列整齐排列整齐一个一个DNA的一条链断裂、并与另一个的一条链断裂、并与另一个DNA对应的链连接，形成对应的链连接，形成Holliday中间体中间体通过分支移动产生异源双链通过分支移动产生异源双链DNAHolliday中间体切开并修复，形成两个双链中间体切开并修复，形成两个双链

3、重组体重组体DNA，分别为：，分别为：片段重组体片段重组体拼接重组体拼接重组体 内切酶内切酶(recBCD)DNA侵扰侵扰(recA)分支迁移分支迁移 (recA)内切酶内切酶(recBCD)DNA 连接酶连接酶535353535353535353535353535333535335535353Holiday中间体中间体53535353目目 录录目目 录录片段重组体片段重组体：切开的链与原来断裂的是同一条链，重组切开的链与原来断裂的是同一条链，重组体含有一段异源双链区，其两侧来自同一亲本体含有一段异源双链区，其两侧来自同一亲本DNA。拼接重组体拼接重组体：切开的链并非原来断裂的链，重组体异源切

4、开的链并非原来断裂的链，重组体异源双链区的两侧来自不同亲本双链区的两侧来自不同亲本DNA。Holiday中间体中间体535353535355533355553333555533335555333355553333内切酶内切酶(ruvC)内切酶内切酶(ruvC)DNA连接酶连接酶 DNA连接酶连接酶片段重组体片段重组体拼接重组体拼接重组体目目 录录目目 录录二、细菌的基因转移与重组二、细菌的基因转移与重组接合作用接合作用转化作用转化作用转导作用转导作用细胞融合细胞融合目目 录录（一）接合作用（一）接合作用当当细细胞胞或或细细菌菌通通过过菌菌毛毛相相互互接接触触时时，质质粒粒DNA从从一一个个细细

5、胞胞（细细菌菌）转转移移至至另另一一细细胞胞（细菌），这种（细菌），这种DNA转移称为转移称为接合作用接合作用。质粒质粒 细菌染色体外的小型环状双链细菌染色体外的小型环状双链DNA分子分子目目 录录可接合质粒如可接合质粒如 F 因子因子(F factor)目目 录录（二）转化作用（二）转化作用通通过过自自动动获获取取或或人人为为地地供供给给外外源源DNA，使使细细胞胞或或培培养养的的受受体体细细胞胞获获得得新新的的遗遗传传表表型型，称为称为转化作用转化作用。目目 录录例：例：溶菌时，裂解的溶菌时，裂解的DNA片段被另一细菌摄取。片段被另一细菌摄取。目目 录录目目 录录（三）转导作用（三）转导作

6、用当当病病毒毒从从被被感感染染的的细细胞胞（供供体体）释释放放出出来来、再再次次感感染染另另一一细细胞胞（受受体体）时时，发发生生在在供供体体细细胞胞与与受受体体细细胞胞之之间间的的DNA转转移移及及基基因因重组即为重组即为转导作用转导作用。噬菌体的生活史噬菌体的生活史溶菌生长途径溶菌生长途径溶源菌生长途径溶源菌生长途径例例目目 录录目目 录录目目 录录三、位点特异重组三、位点特异重组位位点点特特异异重重组组是是由由整整合合酶酶催催化化，在在两两个个DNA序列的特异位点间发生的整合。序列的特异位点间发生的整合。目目 录录例例（二）细菌的特异位点重组（二）细菌的特异位点重组鼠伤寒沙门杆菌鼠伤寒沙

7、门杆菌H片段倒位决定鞭毛相转变片段倒位决定鞭毛相转变 目目 录录hix为为反反向向重重复复序序列列，它它们们之之间间的的H片片段段可可在在Hin控控制制下下进进行行特特异异位位点点重重组组(倒倒位位)。H片片段段上上有有两两个个启启动动子子P，其其一一驱驱动动hin基基因因表表达达，另另一一正正向向时时驱驱动动H2和和rH1基基因因表表达达，反反向向(倒倒位位)时时H2和和rH1不不表表达达。rH1为为H1的的阻阻遏蛋白基因。遏蛋白基因。目目 录录 H2鞭毛素鞭毛素 阻遏蛋白阻遏蛋白Hin重组酶重组酶转位片段转位片段 H1鞭毛素鞭毛素沙门氏菌沙门氏菌H H片段倒位决定鞭毛相转变片段倒位决定鞭毛

8、相转变hinH2IDNA启动序列启动序列H1启动序列启动序列hinH2IH1目目 录录四、转座重组四、转座重组由由插插入入序序列列和和转转座座子子介介导导的的基基因因移移位位或或重排称为重排称为转座转座(transposition)。目目 录录典型的插入序列典型的插入序列(IS)组成：组成：二个分离的反向重复二个分离的反向重复(IR)序列序列一个转座酶（一个转座酶（transposase)编码基因编码基因特有的正向重复序列特有的正向重复序列 IRTransposase GeneIR发生形式：发生形式：保守性转座保守性转座复制性转座复制性转座（一）插入序列转座（一）插入序列转座插入序列的复制性转

9、座插入序列的复制性转座目目 录录目目 录录转座子转座子(transposons)可从一个染色体位点可从一个染色体位点转移到另一位点的分散重复序列。转移到另一位点的分散重复序列。转座子组成：转座子组成：反向重复序列反向重复序列转座酶编码基因转座酶编码基因抗生素抗性等有用的基因抗生素抗性等有用的基因IRIRTransposase Gene有用基因有用基因（二）转座子转座（二）转座子转座目目 录录由转座子介导的转座由转座子介导的转座目目 录录目目 录录第第 二二 节节 重组重组DNA技术技术DNA Recombination Technique 目目 录录重组重组DNA技术的发展史技术的发展史186

10、5年年 G.J.Mendel的豌豆杂交试验的豌豆杂交试验18661944年年 O.T.Avery的肺炎球菌转化实验的肺炎球菌转化实验1973年年 美国斯坦福大学的科学家构建美国斯坦福大学的科学家构建第一个第一个重组重组DNA分子分子1977年年 美国南旧金山由博耶和斯旺森建立世界上美国南旧金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家第一家遗传工遗传工程公司，专门应用重组程公司，专门应用重组DNA技术制造医学上重要的药物。技术制造医学上重要的药物。1980年年 开始建造开始建造第一家第一家应用重组应用重组DNA技术生产胰岛素的工厂技术生产胰岛素的工厂1997年年 英国罗林研究所成功的克隆了英国罗林研究所成

11、功的克隆了多莉多莉目目 录录一、重组一、重组DNA技术相关概念技术相关概念 克隆克隆(clone)来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。获取同一拷贝的过程称为获取同一拷贝的过程称为克隆化克隆化(cloning)，即即无性繁殖无性繁殖。（一）（一）DNA克隆克隆目目 录录技术水平：技术水平：分子克隆分子克隆 即即DNA 克隆克隆 细胞克隆细胞克隆个体克隆（动物或植物）个体克隆（动物或植物）目目 录录DNA克隆克隆应应用用酶酶学学的的方方法法，在在体体外外将将各各种种来来源源的的遗遗传传物物质质（同同源源的的或或异异源源的的、原原核核的的或或真真核核的的、天天然然

12、的的或或人人工工的的DNA）与与载载体体DNA接接合合成成一一具具有有自自我我复复制制能能力力的的DNA分分子子复复制制子子，继继而而通通过过转转化化或或转转染染宿宿主主细细胞胞，筛筛选选出出含含有有目目的的基基因因的的转转化化子子细细胞胞，再再进进行行扩扩增增提提取取获获得得大大量量同同一一DNA分分子子。也称也称基因克隆或重组基因克隆或重组DNA。目目 录录生物技术工程生物技术工程:基因工程、蛋白质工程、基因工程、蛋白质工程、酶工程、细胞工程等酶工程、细胞工程等目的目的 分离获得某一感兴趣的基因或分离获得某一感兴趣的基因或DNA 获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）获得感兴趣基因的表达产物（

13、蛋白质）基因工程基因工程(genetic engineering)实现基实现基因克隆所用的方法及相关的工作称基因工程，因克隆所用的方法及相关的工作称基因工程，又称又称重组重组DNA工艺学工艺学。目目 录录（二）工具酶（二）工具酶n 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶n DNA聚合酶聚合酶n 逆转录酶逆转录酶n T4DNA连接酶连接酶n 碱性磷酸酶碱性磷酸酶n 末端转移酶末端转移酶n Taq DNA聚合酶聚合酶目目 录录重组重组DNA技术中常用的工具酶技术中常用的工具酶工工 具具 酶酶功功 能能限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶识别特异序列，切割识别特异序列，切割DNADNA连接酶连接酶催化催化DN

14、A中相邻的中相邻的5磷酸基和磷酸基和3羟基末端之间形成磷酸二羟基末端之间形成磷酸二酯键，使酯键，使DNA切口封合或使两个切口封合或使两个DNA分子或片段连接分子或片段连接DNA聚合酶聚合酶合成双链合成双链cDNA分子或片段连接分子或片段连接缺口平移制作高比活探针缺口平移制作高比活探针DNA序列分析序列分析填补填补3末端末端Klenow片段片段又名又名DNA聚合酶聚合酶I大片段，具有完整大片段，具有完整DNA聚合酶聚合酶I的的53 聚合、聚合、35 外切活性，而无外切活性，而无53 外切活外切活性。常用于性。常用于cDNA第二链合成，双链第二链合成，双链DNA 3 末端标记等末端标记等反转录酶反

15、转录酶合成合成cDNA替代替代DNA聚合酶聚合酶I进行填补，标记或进行填补，标记或DNA序列分析序列分析多聚核苷酸激酶多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸催化多聚核苷酸5羟基末端磷酸化，或标记探针羟基末端磷酸化，或标记探针末端转移酶末端转移酶在在3羟基末端进行同质多聚物加尾羟基末端进行同质多聚物加尾碱性磷酸酶碱性磷酸酶切除末端磷酸基切除末端磷酸基目目 录录限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶定义定义限限制制性性核核酸酸内内切切酶酶(RE)是是识识别别DNA的的特特异异序序列列,并并在在识识别别位位点点或或其其周周围围切切割割双双链链DNA的的一一类类内内切酶。切酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGA

16、TCC G+Bam H目目 录录作用作用与与甲甲基基化化酶酶共共同同构构成成细细菌菌的的限限制制-修修饰饰系统，限制外源系统，限制外源DNA，保护自身保护自身DNA。分类分类、（基因工程技术中常用（基因工程技术中常用型）型）目目 录录第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株；第四个字母代表株；用罗马数字表示发现的先后次序。用罗马数字表示发现的先后次序。命名命名Hin d 属属 系系 株株 序序Haemophilus influenzae d株株流感嗜血杆菌

17、流感嗜血杆菌d株的第三种酶株的第三种酶目目 录录类酶识别序列特点类酶识别序列特点 回文结构回文结构(palindrome)切口切口 ：平端切口平端切口、粘端切口粘端切口GGGGA AT TCCCCCCCCT TA AGGGG目目 录录Bam HGTCCAGGCCTAGGATCC G+GGATCCCCTAGGHindGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口平端切口粘端切口粘端切口目目 录录同功异源酶同功异源酶来来源源不不同同的的限限制制酶酶，但但能能识识别别和和切切割割同一位点，这些酶称同一位点，这些酶称同功异源酶同功异源酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC G+Bam HG

18、GATCCCCTAGGGCCTAGGATCC G+Bst目目 录录同尾酶同尾酶有有些些限限制制性性内内切切酶酶虽虽然然识识别别序序列列不不完完全全相相同同，但但切切割割DNA后后，产产生生相相同同的的粘粘性性末末端端，称称为为同同尾尾酶酶。这这两两个个相相同同的的粘粘性性末末端端称称为为配配伍未端伍未端。Bam Bam HHBg Bg l l GGATCC CCTAGG AGATCT TCTAGAGCCTAG GATCC G+ATCTAG GATCT A目目 录录（三）目的基因（三）目的基因n cDNAn基因组基因组DNA目的基因目的基因 分离获得某一感兴趣的基因或分离获得某一感兴趣的基因或D

19、NA 获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）目目 录录（四）基因载体（四）基因载体定义定义为携带目的基因，实现其无性繁殖或为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分分子。子。常用载体常用载体质粒质粒DNA噬菌体噬菌体DNA病毒病毒DNA目目 录录克隆载体克隆载体(cloning vector)为为使使插插入入的的外外源源DNA序序列列被被扩扩增增而而特特意意设计的载体称为设计的载体称为克隆载体克隆载体。表达载体表达载体(expression vector)为为使使插插入入的的外外源源DNA序序列列可可转转录

20、录翻翻译译成成多肽链而特意设计的载体称为多肽链而特意设计的载体称为表达载体表达载体。目目 录录载体的选择标准载体的选择标准n能自主复制；能自主复制；n具有两个以上的遗传标记物，便于重组体具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定；的筛选和鉴定；n有克隆位点（外源有克隆位点（外源DNA插入点），常具有插入点），常具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点；多个单一酶切位点，称为多克隆位点；n分子量小，以容纳较大的外源分子量小，以容纳较大的外源DNA。目目 录录1.1.质粒质粒(plasmid)特点特点 能能在在宿宿主主细细胞胞内内独独立立自自主主复复制制；带带有有某某些遗传信息些遗传信息,会赋予

21、宿主细胞一些遗传性状。会赋予宿主细胞一些遗传性状。目目 录录目目 录录噬菌体噬菌体DNA改造系统改造系统 gt系列（插入型，适用系列（插入型，适用cDNA克隆）克隆）EMBL系列（置换型，适用基因组克隆）系列（置换型，适用基因组克隆）2.噬菌体噬菌体(phage)M13噬菌体噬菌体DNA改造系统（含改造系统（含lacZ基因）基因）M13mp系列系列pUC系列系列目目 录录M13噬菌体pUC系列的物理图谱目目 录录酵母人工染色体酵母人工染色体(yeast artificial chromosome,YAC)细菌人工染色体细菌人工染色体(bacterial artificial chromosom

22、e,BAC)动物病毒动物病毒DNA改造的载体改造的载体（如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒）（如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒）其他其他目目 录录二、重组二、重组DNA技术基本原理技术基本原理克隆基本过程克隆基本过程目的基因的获取目的基因的获取DNA导入受体菌导入受体菌外源基因与载体的连接外源基因与载体的连接克隆载体的选择和构建克隆载体的选择和构建重组体的筛选重组体的筛选克隆基因的表达克隆基因的表达 以以 质质 粒粒 为为 载载 体体 的的DNA 克克 隆隆 过过 程程目目 录录目目 录录（一）目的基因的获取（一）目的基因的获取1.化学合成法化学合成法要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产

23、物的要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列氨基酸序列。2.基因组基因组DNA文库文库(genomic DNA library)3.cDNA文库文库(cDNA library)4.聚合酶链反应聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)（见第（见第22章）章）目目 录录*1、化学合成法获取目的基因、化学合成法获取目的基因由已知氨基酸序列推测可能的由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列序列组织或细胞染色体组织或细胞染色体DNA基因片断基因片断克隆载体克隆载体重组重组DNA分子分子含重组分子的转化菌含重组分子的转化菌限制性内切酶限制性内切酶受体菌受体菌基因组基

24、因组DNA文库文库存在于转化细胞内存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所由克隆载体所携带的所有基因组有基因组DNA的集合的集合*2、从基因组、从基因组DNA文库获取目的基因文库获取目的基因目目 录录限制酶切位点限制酶切位点限制酶消化限制酶消化 除去中间片段除去中间片段cos LR coscos L左臂左臂R cos右臂右臂真核生物染真核生物染色体色体DNA限制酶部分消化限制酶部分消化 外源外源DNA与载体与载体DNA混合混合 连接反应连接反应 体外包装体外包装 用重组噬菌体用重组噬菌体感染大肠杆菌感染大肠杆菌 20 Kb DNA 片段片段 cos LR cos20 Kb 外源外源 DNA 片段片

25、段 基因文库基因文库目目 录录mRNA cDNA 双链双链cDNA 重组重组DNA分子分子 cDNA文库文库 反转录酶反转录酶 载体载体 受体菌受体菌 复制复制*3、从、从cDNA文库获取目的基因文库获取目的基因 逆转录酶逆转录酶A A A A T T T T AAAASISI核酸酶核酸酶 DNA聚合酶聚合酶碱水解碱水解 T T T T目目 录录目目 录录（二）克隆载体的选择和构建（二）克隆载体的选择和构建目目 录录（三）外源基因与载体的连接（三）外源基因与载体的连接1.1.粘性末端连接粘性末端连接方式：方式：(1)同一限制酶切位点连接同一限制酶切位点连接(2)不同限制酶切位点连接不同限制酶切

26、位点连接配伍末端连接配伍末端连接非配伍末端连接非配伍末端连接Bam H切割反应切割反应 GGATCC CCTAGGT4 DNA连接酶连接酶15CGATCC GGCCTAG+目的基因用目的基因用 Bam H切割切割载体载体DNA用用Bam H切割切割重组体重组体载体自连载体自连目的基因自连目的基因自连同一限制酶切位点连接同一限制酶切位点连接目目 录录目目 录录Bam Bam HHBg Bg l l GGATCC CCTAGG AGATCT TCTAGAGCCTAG GATCC G+ATCTAG GATCT A不同限制酶切位点（配伍末端）的连接不同限制酶切位点（配伍末端）的连接配伍末端的连接情况和

27、同一限制酶切位点配伍末端的连接情况和同一限制酶切位点连接相似。连接相似。目目 录录2.平端连接平端连接适用于：适用于：限制性内切酶切割产生的平端限制性内切酶切割产生的平端粘端补齐或切平形成的平端粘端补齐或切平形成的平端目的基因目的基因载体载体限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶T4 DNA连接酶连接酶15C重组体重组体载体自连载体自连目的基因目的基因 自连自连目目 录录目目 录录3.同聚物加尾连接同聚物加尾连接在末端转移酶在末端转移酶(terminal transferase)的的作用下，在作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再进行粘端连

28、接。制造出粘性末端，再进行粘端连接。5335载体载体DNA5335目的基因目的基因限制酶或机械剪切限制酶或机械剪切限制酶限制酶 53 35 5 3 T(T)nT T(T)nT 35 5 3 35 5 3 A(A)nA A(A)nA 35-核酸外切酶核酸外切酶-核酸外切酶核酸外切酶末端转移酶末端转移酶+dATP末端转移酶末端转移酶+dTTPT(T)nTA(A)nAA(A)nA T(T)nTT4 DNA连接酶连接酶15C重组体重组体目目 录录目目 录录4.4.人工接头人工接头(linker)连接连接由平端加上新的酶切位点，再用限制酶切由平端加上新的酶切位点，再用限制酶切除产生粘性末端，而进行粘端连

29、接除产生粘性末端，而进行粘端连接。人工接头及其应用人工接头及其应用CCGAATTCG GGCTTAAGC5-3-Eco REco REco REco R目目 录录目目 录录受体菌条件受体菌条件安全宿主菌安全宿主菌（从大肠杆菌（从大肠杆菌K-12改造）改造）限制酶和重组酶缺陷限制酶和重组酶缺陷处于感受态处于感受态导入方式导入方式转化转化 转染转染 感染感染（四）重组（四）重组DNA导入受体菌导入受体菌目目 录录（五）重组体的筛选（五）重组体的筛选 1.直接选择法直接选择法(1)抗药性标记选择抗药性标记选择(2)标志补救标志补救(marker rescue)(3)分子杂交法分子杂交法原位杂交原位杂

30、交Southern印迹印迹 2.免疫学方法免疫学方法如免疫化学方法及酶免检测分析等如免疫化学方法及酶免检测分析等(插入失活法插入失活法)抗药性标记选择抗药性标记选择目目 录录组氨酸缺陷组氨酸缺陷型大肠杆菌型大肠杆菌无组氨酸无组氨酸的培养基的培养基酵母咪唑甘油磷酵母咪唑甘油磷酸脱水酶基因酸脱水酶基因促进组氨酸合成促进组氨酸合成DNADNA重组体重组体标志补救标志补救目目 录录 互互补补的的检检测测目目 录录原原位位杂杂交交目目 录录Southern印迹印迹目目 录录目目 录录重组重组DNADNA技术操作过程可形象归纳为技术操作过程可形象归纳为 小小 结结分分分离目的基因分离目的基因 切切限制酶切

31、目的基因与载体限制酶切目的基因与载体接接拼接重组体拼接重组体 转转转入受体菌转入受体菌 筛筛筛选重组体筛选重组体 重组重组DNA技术操作的主要步骤技术操作的主要步骤载体载体质粒质粒噬菌体噬菌体病毒病毒目的基因（外源基因）目的基因（外源基因）基因组基因组DNA cDNA 人工合成人工合成PCR产物产物限制酶消化限制酶消化开环载体开环载体DNA目的基因目的基因连接酶连接酶重组体重组体转化转化体外包装，转染体外包装，转染带重组体的宿主带重组体的宿主筛选筛选表型筛选表型筛选酶切电泳鉴定酶切电泳鉴定菌落原位杂交菌落原位杂交目目 录录目目 录录表达体系的建立表达体系的建立表达载体的构建表达载体的构建受体细

32、胞的建立受体细胞的建立表达产物的分离纯化表达产物的分离纯化（六）克隆基因的表达（六）克隆基因的表达目目 录录1.原核表达体系原核表达体系（E.coli表达体系最为常用）表达体系最为常用）标准：标准：选择标志选择标志强启动子强启动子 翻译调控序列翻译调控序列多接头克隆位点多接头克隆位点E.coli表达体系的不足表达体系的不足 不宜表达真核基因组不宜表达真核基因组DNA不能加工表达的真核蛋白质不能加工表达的真核蛋白质表达的蛋白质常形成不溶性包涵体表达的蛋白质常形成不溶性包涵体(inclusion body)很难表达大量可溶性蛋白很难表达大量可溶性蛋白大鼠胰岛素原大鼠胰岛素原cDNA的表达和分泌的表

33、达和分泌目目 录录目目 录录目目 录录优点：优点：可表达克隆的可表达克隆的cDNA及真核基因组及真核基因组DNA可适当修饰表达的蛋白质可适当修饰表达的蛋白质表达产物分区域积累表达产物分区域积累缺点：缺点：操作技术难、费时、经济操作技术难、费时、经济转染转染 将表达载体导入真核细胞的过程将表达载体导入真核细胞的过程方法：方法：磷酸钙转染磷酸钙转染DEAE葡聚糖介导转染葡聚糖介导转染电穿孔电穿孔 脂质体转染脂质体转染 显微注射显微注射 2.真核表达体系真核表达体系 酵母、昆虫、乳类动物细胞酵母、昆虫、乳类动物细胞表达载体表达载体pFASTBACI 的物理图谱的物理图谱目目 录录目目 录录目目 录录

34、（一）疾病基因的发现与克隆（一）疾病基因的发现与克隆根据基因定位克隆之并研究其性质，而认根据基因定位克隆之并研究其性质，而认识疾病的分子机制。识疾病的分子机制。三、重组技术与医学的关系三、重组技术与医学的关系（二）生（二）生物制药物制药 重组重组DNA医药产品医药产品产产 品品功功 能能组织胞浆素原激活剂组织胞浆素原激活剂抗凝抗凝血液因子血液因子VIII促进凝血促进凝血颗粒细胞颗粒细胞-巨噬细胞集落剌激因子巨噬细胞集落剌激因子剌激白细胞生成剌激白细胞生成促红细胞生成素促红细胞生成素剌激白细胞生成剌激白细胞生成生长因子生长因子(bFGF,EGF)刺激细胞生长与分化刺激细胞生长与分化生长素生长素治

35、疗侏儒症治疗侏儒症胰岛素胰岛素治疗糖尿病治疗糖尿病干扰素干扰素(1b,2a,2b,)抗病毒感染及某些肿瘤抗病毒感染及某些肿瘤白细胞介素白细胞介素激活、剌激各类白细胞激活、剌激各类白细胞超氧化物歧化酶超氧化物歧化酶抗组织损伤抗组织损伤单克隆抗体单克隆抗体利用其结合特异性进行诊断试验、肿利用其结合特异性进行诊断试验、肿瘤导向治疗瘤导向治疗乙肝疫苗乙肝疫苗(CHO,酵母酵母)预防乙肝预防乙肝口服重组口服重组B亚单位菌体霍乱菌苗亚单位菌体霍乱菌苗预防霍乱预防霍乱目目 录录目目 录录基基因因诊诊断断(genetic diagnosis)是利利用用分分子子生生物物学学及及分分子子遗遗传传的的技技术术和和原

36、原理理，在在DNA水水平平分分析析、鉴鉴定定遗遗传传疾疾病病所所涉涉及及基基因因的的置置换换、缺缺失或插入等突变。失或插入等突变。（三）基因诊断（三）基因诊断基本过程基本过程区分或鉴定区分或鉴定DNA的异常的异常分离、扩增待测的分离、扩增待测的DNA片断片断目目 录录标准标准.能正确扩增靶基因；能正确扩增靶基因；.能准确区分单个碱基的差别；能准确区分单个碱基的差别；.本底或噪声低，不干扰本底或噪声低，不干扰DNA的鉴定的鉴定;.便于完全自动化操作，适合大面积、便于完全自动化操作，适合大面积、大人群普查。大人群普查。目目 录录（四）基因治疗（四）基因治疗定义定义基因治疗基因治疗(gene therapy)是向有功能缺陷是向有功能缺陷的细胞补充相应功能的基因，以纠正或补偿的细胞补充相应功能的基因，以纠正或补偿其基因的缺陷，从而达到治疗的目的。其基因的缺陷，从而达到治疗的目的。方式方式体细胞基因治疗体细胞基因治疗(somatic cell gene therapy)性细胞基因治疗性细胞基因治疗(germ line gene therapy)目目 录录1.产前诊断产前诊断2.携带者测试携带者测试3.症候前诊断症候前诊断4.遗传病易感性遗传病易感性（五）遗传疾病的预防（五）遗传疾病的预防目目 录录演讲完毕，谢谢观看！