体外单倍体诱导和单倍体育种.ppt

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1、关于体外单倍体诱导与单倍体育种第一张，PPT共六十七页，创作于2022年6月植物单倍体诱导途径:花药培养、花粉培养花药培养、花粉培养胚珠或子房培养（未受精）胚珠或子房培养（未受精）第二张，PPT共六十七页，创作于2022年6月植物花药/花粉培养历史Guha和和Maheshwari（1964）曼陀罗花药培养曼陀罗花药培养Nitsch 和和 Norreel(1973)烟草花粉培养烟草花粉培养（游离小孢子培养）（游离小孢子培养）Chu（1973）小麦花粉培养小麦花粉培养 （早期花药培养主要依靠小孢子的自然胚胎发生产生单倍体，能自发形成胚胎发生（早期花药培养主要依靠小孢子的自然胚胎发生产生单倍体，能自

2、发形成胚胎发生的基因频率较低，效率极低）的基因频率较低，效率极低）80年代后期到年代后期到90年代期间，花培技术迅速发展。许多作物小孢子培养已经成功。年代期间，花培技术迅速发展。许多作物小孢子培养已经成功。十字花科、麦类、水稻、玉米等十字花科、麦类、水稻、玉米等。90年代，一些先前被认为是年代，一些先前被认为是不易进行小孢子培养的基因型也相继成功不易进行小孢子培养的基因型也相继成功Konzak(1999)。第三张，PPT共六十七页，创作于2022年6月 花药培养花药培养:将花粉发育至一定阶段的花药培养在人工培养基上，将花粉发育至一定阶段的花药培养在人工培养基上，诱导其花粉粒改变发育进程，形成花

3、粉胚或愈伤组织，进而分化成苗的过诱导其花粉粒改变发育进程，形成花粉胚或愈伤组织，进而分化成苗的过程。（器官培养）程。（器官培养）花粉培养花粉培养(小孢子培养小孢子培养)：将发育至一定阶段花粉从将发育至一定阶段花粉从花药中分离出来成为分散或游离状态，花粉脱分化后再生成苗。花药中分离出来成为分散或游离状态，花粉脱分化后再生成苗。（细胞培养）（细胞培养）1.花药和花粉培养的概念：第四张，PPT共六十七页，创作于2022年6月花药和花粉培养花药和花粉培养：指在合成培养基上，改变花粉的发：指在合成培养基上，改变花粉的发育途径，使其不形成配子，而像体细胞一样进行分裂、分化、育途径，使其不形成配子，而像体细

4、胞一样进行分裂、分化、最终发育成完整植株。该发育途径被称为最终发育成完整植株。该发育途径被称为“花粉孢子体发育途花粉孢子体发育途径径”或或“雄核发育雄核发育”。两者的异同点两者的异同点培养目的相同，均获得小孢子植株。培养目的相同，均获得小孢子植株。花药培养属于器官培养；而花粉培养属于细胞培养。花药培养属于器官培养；而花粉培养属于细胞培养。花粉培养没有药壁组织干扰；可计数小孢子产胚率；可观察雄花粉培养没有药壁组织干扰；可计数小孢子产胚率；可观察雄核发育的全过程；单倍体产量高。但技术更复杂。核发育的全过程；单倍体产量高。但技术更复杂。第五张，PPT共六十七页，创作于2022年6月2.花药或花粉培养

5、的意义：供体植株小孢子（n）花培花粉植株（n）雄核发育自然加倍人工加倍纯合植株DH（2n）一年内获得纯系2.1 2.1 作物育种作物育种（1）缩短育种周期：缩短育种周期：常规育种需常规育种需4-6年获得纯系，而小孢子培养年获得纯系，而小孢子培养仅需一年。仅需一年。第六张，PPT共六十七页，创作于2022年6月例子：例子：二倍体供体植株基因型为二倍体供体植株基因型为AaBb，若要从后代中选择基因为，若要从后代中选择基因为AAbb的纯合单株的纯合单株常规方法常规方法：AAbb出现的概率为出现的概率为1/16，并且不能将，并且不能将AAbb与与Aabb、aAbb区分开。区分开。（2 2 2 2）提高

6、了目标基因型的选择效率）提高了目标基因型的选择效率）提高了目标基因型的选择效率）提高了目标基因型的选择效率ABaBAbabABAABBAaBBAABbAaBbaBaABBaaBBaABbaaBbAbAabBAabBAAbbAabbabaAbBaabBaAbbaabb第七张，PPT共六十七页，创作于2022年6月例子：例子：二倍体供体植株基因型为二倍体供体植株基因型为AaBb，若要从后代中选择基因为，若要从后代中选择基因为AAbb的纯合单株的纯合单株单倍体方法单倍体方法：AAbb出现的概率为出现的概率为1/4。（2 2）提高了目标基因型的选择效率）提高了目标基因型的选择效率 单倍体单倍体 二倍体

7、二倍体AB-AABBaB-aaBBAb-AAbbab-aabb供体亲本AaBb花培第八张，PPT共六十七页，创作于2022年6月 植株不受显隐性的影响，在诱变育种中能在当代及时获得突植株不受显隐性的影响，在诱变育种中能在当代及时获得突变个体，加倍后成为稳定的纯系。变个体，加倍后成为稳定的纯系。（3 3）诱变育种中的作用）诱变育种中的作用第九张，PPT共六十七页，创作于2022年6月2.2 2.2 物种进化研究物种进化研究 可探索亲本染色体组的构成。分析单倍体植物减数分裂可探索亲本染色体组的构成。分析单倍体植物减数分裂时，形成二价体的数目和形状，能确定染色体组内是否存在同源染色体。时，形成二价体

8、的数目和形状，能确定染色体组内是否存在同源染色体。2.3 2.3 遗传分析遗传分析 单倍体植株中基因不受显隐性的影响，每一个基因的作单倍体植株中基因不受显隐性的影响，每一个基因的作用均能表现出来。能用来研究基因的性质及其作用。还可用于基因的剂量效用均能表现出来。能用来研究基因的性质及其作用。还可用于基因的剂量效应分析。应分析。2.4 2.4 构建连锁图谱构建连锁图谱 双单倍体（双单倍体（DHDH）群体是永久性群体，能有效地用）群体是永久性群体，能有效地用于遗传图谱的构建于遗传图谱的构建2.5 2.5 用于遗传转化用于遗传转化 能直接表达外源基因，不受显隐性影响。能直接表达外源基因，不受显隐性影

9、响。第十张，PPT共六十七页，创作于2022年6月单倍体：单倍体：具有配子体染色体数的孢子体。具有配子体染色体数的孢子体。单倍体植物单倍体植物3个明显特点：个明显特点：1、体细胞染色体数减半、体细胞染色体数减半 2、生长发育弱，体形小、生长发育弱，体形小 3、雌雄配子严重不育、雌雄配子严重不育第十一张，PPT共六十七页，创作于2022年6月3.花粉孢子体发育途径（雄核发育）第十二张，PPT共六十七页，创作于2022年6月3.1 花粉发育的阶段花粉离体培养时，花粉离体培养时，雄核发育最适宜的雄核发育最适宜的时期一般是第一次时期一般是第一次有丝分裂或之前。有丝分裂或之前。第十三张，PPT共六十七页

10、，创作于2022年6月3.2 雄核发育途径1 1、A A途径途径 小孢子第一次有丝分裂为均等分裂，形成营养细胞和生殖小孢子第一次有丝分裂为均等分裂，形成营养细胞和生殖细胞细胞 （1 1）A-VA-V途径途径 由营养细胞重复分裂形成单倍体由营养细胞重复分裂形成单倍体 （2 2）A-GA-G途径途径 由生殖细胞重复分裂形成单倍体由生殖细胞重复分裂形成单倍体 （3 3）A-VGA-VG途径（途径（E E途径）途径）由营养细胞和生殖细胞各自独立分裂，共同形成单由营养细胞和生殖细胞各自独立分裂，共同形成单倍体倍体 （4 4）C C途径途径 营养细胞和生殖细胞通过核融合，形成多倍体植株营养细胞和生殖细胞通

11、过核融合，形成多倍体植株2 2、B B途径途径 小孢子第一次有丝分裂为均等分裂，形成大小相近的两个细胞。然后小孢子第一次有丝分裂为均等分裂，形成大小相近的两个细胞。然后由这两细胞边续分裂形成单倍体植株，或者核融合形成多倍体植株由这两细胞边续分裂形成单倍体植株，或者核融合形成多倍体植株第十四张，PPT共六十七页，创作于2022年6月第十五张，PPT共六十七页，创作于2022年6月1、雄核发育与P花粉的形成P-花粉：具胚胎发生潜能的花粉。也称小花粉（S-花粉）或不染色花粉（NS-花粉）2、雄核发育与饥饿处理饥饿处理改变了小孢子的配子体发育方向，启动雄核发育。3.3 雄核发育启动机理第十六张，PPT

12、共六十七页，创作于2022年6月1、胚状体发育途径 小孢子经历胚发生的各个阶段，最后子叶展开，形成花粉植株。2、愈伤组织发育途径 小孢子分裂数次形成愈伤，再分化形成花粉植株。此途径产生的植株会出现变异且倍性复杂。3.4 花粉植株形态发生方式第十七张，PPT共六十七页，创作于2022年6月胚状体发育途径部分花药通过胚状体途径形成小植株烟草花药培养第十八张，PPT共六十七页，创作于2022年6月通过胚状体途径再生形成小植株烟草花药培养第十九张，PPT共六十七页，创作于2022年6月胚状体发育途径a)球形胚 d)鱼雷形胚芸苔属小孢子培养第二十张，PPT共六十七页，创作于2022年6月愈伤组织发育途径

13、部分花药产生愈伤组织接种在平板上的水稻花药水稻花药培养第二十一张，PPT共六十七页，创作于2022年6月愈伤组织转接种到再生培养基愈伤组织分化形成再生植株水稻花药培养第二十二张，PPT共六十七页，创作于2022年6月4 花药和花粉培养方法第二十三张，PPT共六十七页，创作于2022年6月4.1 花药培养 1 1、取材、取材 镜检，根据花粉的发育时期，选取大小适宜的花蕾。镜检，根据花粉的发育时期，选取大小适宜的花蕾。2 2、消毒、消毒 70酒精擦洗花蕾表面，或酒精擦洗花蕾表面，或70酒精浸泡酒精浸泡30-60s后在后在1次氯酸钠溶次氯酸钠溶液中浸泡液中浸泡10-20min或在或在0.1的氯化汞溶

14、液中消毒的氯化汞溶液中消毒3-10min，无菌水冲洗，无菌水冲洗3-5次。次。3 3、培养、培养 固体或液体培养基均可。先进行脱分化培养，至小孢子大量固体或液体培养基均可。先进行脱分化培养，至小孢子大量分裂形成胚或愈伤，并突破花药壁表面，形成突出物（分裂形成胚或愈伤，并突破花药壁表面，形成突出物（2-3周）；后转入分周）；后转入分化培养基培养，形成小植株。化培养基培养，形成小植株。第二十四张，PPT共六十七页，创作于2022年6月4.2 花粉培养(一一)花粉的分离与纯化花粉的分离与纯化 1 1、自然散落法、自然散落法(漂浮培养散落小孢子收集法漂浮培养散落小孢子收集法)将花药接种在预处理液或液体

15、培将花药接种在预处理液或液体培养基上，待花粉自动散落后，收集培养。养基上，待花粉自动散落后，收集培养。2 2、挤压法、挤压法 在烧杯或研钵中挤压花药，将花粉挤出后收集培养。在烧杯或研钵中挤压花药，将花粉挤出后收集培养。3 3、机械游离、机械游离 （1）磁搅拌法）磁搅拌法 用磁力搅拌器搅拌培养液中的花药，使花粉游离出来；用磁力搅拌器搅拌培养液中的花药，使花粉游离出来；（2）超速旋切法）超速旋切法 通过搅拌器中的高速旋转刀具破碎花蕾、穗子、花药，使小孢通过搅拌器中的高速旋转刀具破碎花蕾、穗子、花药，使小孢子游离出来（此法应用最广）。子游离出来（此法应用最广）。4 4、小孢子纯化、小孢子纯化 对上述

16、方法获得的小孢子混合物进行分级过筛、梯度离心处理纯化小孢子对上述方法获得的小孢子混合物进行分级过筛、梯度离心处理纯化小孢子第二十五张，PPT共六十七页，创作于2022年6月梯度离心前（小孢子形态、活力不一致）30%蔗糖梯度离心后（获得均一的小孢子群体）第二十六张，PPT共六十七页，创作于2022年6月(二二)花粉培养方式花粉培养方式 1 1、平板培养、平板培养 花粉置琼脂固化培养基上培养。花粉置琼脂固化培养基上培养。2 2、液体培养、液体培养 花粉悬浮在液体培养基中培养，需震荡，以利通气。花粉悬浮在液体培养基中培养，需震荡，以利通气。3 3、双层培养、双层培养 花粉置固体花粉置固体-液体双层培

17、养基上培养。培养基制作方法：先铺液体双层培养基上培养。培养基制作方法：先铺一层琼脂固体培养基，凝固后，在表面加入少量液体培养基。一层琼脂固体培养基，凝固后，在表面加入少量液体培养基。4 4、看护培养、看护培养 利用花药或花药愈伤组织释放出的活性物质促进花粉小孢利用花药或花药愈伤组织释放出的活性物质促进花粉小孢子发育。子发育。5 5、微室培养、微室培养 利用小的盖玻片和凹穴载玻片形成微室进行花粉培养利用小的盖玻片和凹穴载玻片形成微室进行花粉培养6 6、条件培养基培养、条件培养基培养 利用培养过花药的液体培养基或含失活花药提取物的培养基上利用培养过花药的液体培养基或含失活花药提取物的培养基上培养。

18、花药条件培养基、子房条件培养等。培养。花药条件培养基、子房条件培养等。第二十七张，PPT共六十七页，创作于2022年6月看护培养图解看护培养图解第二十八张，PPT共六十七页，创作于2022年6月4.3 白化苗现象第二十九张，PPT共六十七页，创作于2022年6月（一）白化苗产生的影响因素及机理（一）白化苗产生的影响因素及机理1 1、内因、内因 供体植株基因型（如籼稻比粳稻白苗率高）、花粉发育时期。供体植株基因型（如籼稻比粳稻白苗率高）、花粉发育时期。2 2、外因、外因 预处理、培养基成分、激素水平与种类、培养条件和方法、愈伤组织转预处理、培养基成分、激素水平与种类、培养条件和方法、愈伤组织转分

19、化时间等。分化时间等。3 3、机理、机理 核基因起关键作用，导致质体核基因起关键作用，导致质体DNA缺失，产生白苗。另外地、无性系变缺失，产生白苗。另外地、无性系变异也可能是原因之一。异也可能是原因之一。（二）白化苗的控制（二）白化苗的控制 通过对花粉发育时期、预处理、培养基成分等因素进行调控。通过对花粉发育时期、预处理、培养基成分等因素进行调控。第三十张，PPT共六十七页，创作于2022年6月 Case study:1、Canola(Brassica napus).Dihaploid plants were generated with high oleic and reduced lino

20、leic and-linolenic acids in the seed oil and field tested for stability of the fatty acids and yield.第三十一张，PPT共六十七页，创作于2022年6月第三十二张，PPT共六十七页，创作于2022年6月Uninucleate microspores in suspension(Brassica napus)第三十三张，PPT共六十七页，创作于2022年6月Early stage embryos(7-10 days)(B.napus)第三十四张，PPT共六十七页，创作于2022年6月Mid-sta

21、ge Embryos(10-14 days)(B.napus)第三十五张，PPT共六十七页，创作于2022年6月Late stage embryos(21 days)(B.napus)第三十六张，PPT共六十七页，创作于2022年6月Late stage cotyledonary embryos(B.napus)第三十七张，PPT共六十七页，创作于2022年6月“Germination”Cotyledonary embryos transferred to lightgrowth conditions with GA3(B.napus)第三十八张，PPT共六十七页，创作于2022年6月Grow

22、th of haploid seedlings on solid culture medium(B.napus)第三十九张，PPT共六十七页，创作于2022年6月Well-developed haploid plantlet ready for transfer to soil,or for chromosome doubling(B.napus)第四十张，PPT共六十七页，创作于2022年6月Mature dihaploid plants(B.napus)第四十一张，PPT共六十七页，创作于2022年6月Flow scheme for anther culture of banana2、ba

23、nana 第四十二张，PPT共六十七页，创作于2022年6月A Microspores isolated from banana anthers.Bar 14 m.B Development of callus from anthers after 5 months on induction medium.Bar 2 mm.C Androgenic embryos formed on calli.Bar 4 mm.D Haploid plantlets regenerated from anthers.Bar 3 cmAssani et al.Plant Cell Rep 2003,21,51

24、1516第四十三张，PPT共六十七页，创作于2022年6月5.影响雄核发育和花粉花药培养的因素（一）基因型 植物基因型是影响雄核发育的最重要的因素之一。同一物种植物基因型是影响雄核发育的最重要的因素之一。同一物种中的不同基因型对小孢子离体诱导反应差异较大。中的不同基因型对小孢子离体诱导反应差异较大。如在水稻中，籼稻花粉培养力远低于糯稻。如在水稻中，籼稻花粉培养力远低于糯稻。第四十四张，PPT共六十七页，创作于2022年6月芸苔属植物Brassica napusBrassica napus不同基因型的小孢子产胚率比较Topas 10,000-200,000 1-20Westar 1000-10,

25、000 0.1-1Delta 100-10,000 0.01-1Bounty 10-100 0.001-0.01基因型 胚状体数量/106小孢子 成苗率（%）第四十五张，PPT共六十七页，创作于2022年6月（二）供体植株生长条件和生理状态1、植株生长条件、植株生长条件 光温等因素均能影响花药培养力。一般光温等因素均能影响花药培养力。一般处于适宜生长条件（如温室中）较好。但物种间存在差异。处于适宜生长条件（如温室中）较好。但物种间存在差异。2、植株生长时期、植株生长时期 一般是开花始期优于开花末期。一般是开花始期优于开花末期。3、P花粉的频率花粉的频率 不同温度、日照时数、氮饥饿及生长物质处不

26、同温度、日照时数、氮饥饿及生长物质处理提高理提高P花粉的数量花粉的数量 第四十六张，PPT共六十七页，创作于2022年6月（三）花粉发育时期小孢子发育时期对诱导雄核发小孢子发育时期对诱导雄核发育非常重要。育非常重要。第四十七张，PPT共六十七页，创作于2022年6月四分体四分体:醋酸洋红染色醋酸洋红染色四分体四分体:Alexanders 染色染色单核期单核期双核期双核期成熟花粉粒成熟花粉粒处于不同发育时期的烟草小孢子第四十八张，PPT共六十七页，创作于2022年6月单核晚期单核晚期液泡液泡第一次有丝分裂后期第一次有丝分裂后期双核早期双核早期双核中期双核中期生殖核生殖核生殖核生殖核营养核营养核第

27、四十九张，PPT共六十七页，创作于2022年6月一般而言，单核期（第一次有丝分一般而言，单核期（第一次有丝分裂前）对诱导反应最敏感，为最佳裂前）对诱导反应最敏感，为最佳培养期。培养期。形成双核后，在合适的条件，主要由形成双核后，在合适的条件，主要由营养细胞分裂产生胚状体。营养细胞分裂产生胚状体。第五十张，PPT共六十七页，创作于2022年6月不同物种诱导胚胎发生的最佳小孢子发育时期发育时期物种减数分裂期减数分裂期草莓、番茄草莓、番茄四分孢子期四分孢子期葡萄葡萄单核早中期单核早中期石刁柏、油菜、大麦、天仙子、马铃薯石刁柏、油菜、大麦、天仙子、马铃薯单核晚期单核晚期荔枝、茄子、青椒、小麦荔枝、茄子

28、、青椒、小麦单核早期至晚期单核早期至晚期烟草烟草单核早期至双核期单核早期至双核期梨、水稻、甘蓝梨、水稻、甘蓝四分孢子期至双核四分孢子期至双核期期玉米玉米第五十一张，PPT共六十七页，创作于2022年6月对不同发育阶段的花药进行培养测对不同发育阶段的花药进行培养测试试确定最佳小孢子发育时期的形态特确定最佳小孢子发育时期的形态特征征注意形态特征会因品种、发育状注意形态特征会因品种、发育状态、环境条件的变化而发生变化态、环境条件的变化而发生变化处于不同发育阶段的烟草花芽处于不同发育阶段的烟草花芽 花粉发育时期的确定第五十二张，PPT共六十七页，创作于2022年6月（四）预处理（四）预处理 预处理是小

29、孢子培养成功的前提条件预处理是小孢子培养成功的前提条件 预处理目的：预处理目的：是改变小孢子的发育方向，使尽可能多的小孢子从配子体发育途是改变小孢子的发育方向，使尽可能多的小孢子从配子体发育途径转向孢子体发育途径（即成为具胚胎发生潜力的小孢子）。适当的预处理能使绿径转向孢子体发育途径（即成为具胚胎发生潜力的小孢子）。适当的预处理能使绿苗产量大量增加。苗产量大量增加。预处理方法：预处理方法：主要是对花药进行适度的逆境处理，包括低温、高温、化学物质、主要是对花药进行适度的逆境处理，包括低温、高温、化学物质、离心、射线等。离心、射线等。第五十三张，PPT共六十七页，创作于2022年6月1 1、高低温

30、处理、高低温处理低温低温预处预处理理：指在接种之前将材料用：指在接种之前将材料用0以上低温处理一段时间后再接以上低温处理一段时间后再接种。应用较多。处理温度一般在种。应用较多。处理温度一般在1-141-14，时间从几小时至几十天不等。不同作物所，时间从几小时至几十天不等。不同作物所用的预处理温度及时间差异较大。不同的处理温度需要不同的时间。用的预处理温度及时间差异较大。不同的处理温度需要不同的时间。例子例子:小麦穗子培养前小麦穗子培养前44预处理几天，花药培养效率显著提高。预处理几天，花药培养效率显著提高。十字花科未经低温预处理的花蕾，每花药产胚数为十字花科未经低温预处理的花蕾，每花药产胚数为

31、4.394.39个，个，6-96-9处理处理1 1天，产胚数提高到天，产胚数提高到61.461.4个，预处理个，预处理4 4天后，胚状体产量降为天后，胚状体产量降为10.4710.47个。个。预处理方法：预处理方法：第五十四张，PPT共六十七页，创作于2022年6月 高温处理（热击处理）：高温处理（热击处理）：指花药接种后，先在较高温度下指花药接种后，先在较高温度下（30-3530-35）培养数天，然后再移至正常温度下继续培养。）培养数天，然后再移至正常温度下继续培养。例子例子:如烟草，如烟草，3232高温；小麦，高温；小麦，3333高温预处理显著高温预处理显著地提高了小孢子胚胎发生能力（地提

32、高了小孢子胚胎发生能力（TouraevTouraev，19961996）第五十五张，PPT共六十七页，创作于2022年6月2 2、化学物质处理、化学物质处理包括高糖、甘露醇、秋水仙素、乙烯利等进行处理。甘露醇仅能包括高糖、甘露醇、秋水仙素、乙烯利等进行处理。甘露醇仅能维持渗透压，不能提供碳源，其主要原理是造成小孢子营养饥饿，维持渗透压，不能提供碳源，其主要原理是造成小孢子营养饥饿，从而使小孢子去分化。从而使小孢子去分化。3、其它包括包括射线、离心、磁场等。射线、离心、磁场等。第五十六张，PPT共六十七页，创作于2022年6月（五）培养基 1.1.基本培养基基本培养基 主要为主要为N6和和MS培

33、养基。在此基础上发展出一些其它的培养培养基。在此基础上发展出一些其它的培养基。如基。如H培养基（适于烟草）、培养基（适于烟草）、C17培养基（适于小麦）、马培养基（适于小麦）、马铃署铃署-培养基（适于马铃署）培养基（适于马铃署）第五十七张，PPT共六十七页，创作于2022年6月2.2.碳源碳源 包括蔗糖、麦芽糖、纤维二糖、葡萄糖、果糖、海藻包括蔗糖、麦芽糖、纤维二糖、葡萄糖、果糖、海藻糖等。不同作物所需最适的碳源种类及浓度的所差异。一糖等。不同作物所需最适的碳源种类及浓度的所差异。一般认为单子叶植物比双子叶植物需糖的浓度要高。玉米中般认为单子叶植物比双子叶植物需糖的浓度要高。玉米中蔗糖效果最好

34、；而麦类作物中，麦芽糖似乎为最好的碳源。蔗糖效果最好；而麦类作物中，麦芽糖似乎为最好的碳源。第五十八张，PPT共六十七页，创作于2022年6月3 3、激素、激素4 4、氨基酸、氨基酸5 5、活性碳、活性碳6 6、pHpH 第五十九张，PPT共六十七页，创作于2022年6月（六）培养条件 1 1、温度、温度 物种间有差异物种间有差异2 2、光照、光照 3 3、植板密度、植板密度 植板密度与花培效率有很大的相关性。植板密度与花培效率有很大的相关性。5103到到2104ml密度均能有效密度均能有效培养。一般来说，足够数量的、但相对低密度的小孢子浓度有利于小孢子竞争营培养。一般来说，足够数量的、但相对

35、低密度的小孢子浓度有利于小孢子竞争营养、氧气、细胞分裂的空间，从则有利于胚状体发生。养、氧气、细胞分裂的空间，从则有利于胚状体发生。第六十张，PPT共六十七页，创作于2022年6月（七）花药壁因素（七）花药壁因素 花药组织的存在对小孢子的胚性分裂具有明显的促进作用。但花药花药组织的存在对小孢子的胚性分裂具有明显的促进作用。但花药壁损伤会释放有毒物质影响小雄核的发育。壁损伤会释放有毒物质影响小雄核的发育。第六十一张，PPT共六十七页，创作于2022年6月6.单倍体植株鉴定和染色体加倍第六十二张，PPT共六十七页，创作于2022年6月一、倍性鉴定一、倍性鉴定 （为什么要进行倍性鉴定？为什么要进行倍

36、性鉴定？）1、染色体直接计数法 通常取根尖、茎尖等分生组织区进行制片，直接计数染色体数目。2、间接鉴定（1）扫描细胞光度仪鉴定（流式细胞仪）主要测定叶片单个细胞中DNA的含量确定细胞的倍性，材料的使用量可少到1cm2。（2）细胞形态学鉴定法 叶片保卫细胞大小、单位面积上的气孔数及保卫细胞中叶绿体的大小和数目与倍性具有高度的相关性。（3）植株形态学鉴定法 单倍体植株瘦弱，叶片窄小，花小柱头长，花粉粒小，不结实。第六十三张，PPT共六十七页，创作于2022年6月（4 4）杂交鉴定法）杂交鉴定法自交或测交鉴定，看后代分离情况确定二倍体植株是来自交或测交鉴定，看后代分离情况确定二倍体植株是来自小孢子还

37、是体细胞。自小孢子还是体细胞。（5 5）分子标记鉴定）分子标记鉴定包括生化标记（如同工酶标记）和分子标记包括生化标记（如同工酶标记）和分子标记（如（如RFLP、RAPD、AFLP等）等）第六十四张，PPT共六十七页，创作于2022年6月二、染色体加倍二、染色体加倍 （为什么要进行加倍？为什么要进行加倍？）（一）茎段培养（一）茎段培养将单倍体植株的茎段进行培养，诱导愈伤组织形成。将单倍体植株的茎段进行培养，诱导愈伤组织形成。由于单倍体愈伤组织在培养过程中会有一定频率的核内有丝分裂，由于单倍体愈伤组织在培养过程中会有一定频率的核内有丝分裂，从而形成二倍体细胞，分化出纯合的二倍体植株。从而形成二倍体

38、细胞，分化出纯合的二倍体植株。第六十五张，PPT共六十七页，创作于2022年6月二、染色体加倍 （为什么要进行加倍？）（二）化学试剂诱变（二）化学试剂诱变有秋水仙素、有秋水仙素、Oryzalin、trifluralin、APM等。等。1、秋水仙素诱导、秋水仙素诱导（1）浸泡法）浸泡法无菌条件下以一定浓度的秋水仙素浸泡再生小植株，再转无菌条件下以一定浓度的秋水仙素浸泡再生小植株，再转移至新鲜培养基中培养。移至新鲜培养基中培养。（2）生长锥处理）生长锥处理 秋水仙素水溶液直接涂抹生长点（顶芽或腋芽）。秋水仙素水溶液直接涂抹生长点（顶芽或腋芽）。（3）培养基处理）培养基处理 将单倍体植株和任何一部分作为外植体，种植在附加一定浓度和秋将单倍体植株和任何一部分作为外植体，种植在附加一定浓度和秋水仙素的培养基中培养一段时间后，转入无秋水仙素的相同培养基中继续培养诱导胚水仙素的培养基中培养一段时间后，转入无秋水仙素的相同培养基中继续培养诱导胚状体。状体。2、除草剂诱导、除草剂诱导（毒性小，引起植株的变异几率小）（毒性小，引起植株的变异几率小）第六十六张，PPT共六十七页，创作于2022年6月感谢大家观看第六十七张，PPT共六十七页，创作于2022年6月