[精选]发酵设备及消毒灭菌10529.pptx

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1、L/O/G/O第三节第三节第三节第三节 发酵设备及消毒灭菌发酵设备及消毒灭菌发酵设备及消毒灭菌发酵设备及消毒灭菌发酵的一般流程发酵的一般流程种子扩大培养种子扩大培养培养基配制培养基配制空气除菌空气除菌培养基灭菌培养基灭菌发酵生产发酵生产下游处理下游处理发酵设备发酵设备发酵设备发酵设备发酵设备发酵设备发酵罐发酵罐发酵罐发酵罐u发酵罐的特点轴封严密，泄漏少能承受一定压力、温度搅拌通风装置保证气液充分混合具有足够的冷却面积死角少，灭菌彻底适宜的径高比（高与直径的比值为2.54）u发酵罐的类型搅拌釜反应器鼓泡式反应器气升式反应器发酵辅助设备发酵辅助设备发酵辅助设备发酵辅助设备u无菌空气系统无菌空气的要

2、求u灭菌系统、管道、阀门培养基及其灭菌培养基及其灭菌培养基及其灭菌培养基及其灭菌u培养基（medium）u培养基的成分碳源、氮源、无机盐、前体物、促进剂、抑制剂u培养基的类型按组成按状态按用途u培养基灭菌空罐灭菌实罐灭菌连续灭菌：高温短时L/O/G/O第四节第四节第四节第四节 发酵工程制药的发酵工程制药的发酵工程制药的发酵工程制药的过程与控制过程与控制过程与控制过程与控制种子的扩大培养种子的扩大培养种子的扩大培养种子的扩大培养微生物发酵方式微生物发酵方式微生物发酵方式微生物发酵方式分批发酵补料分批发酵半连续发酵连续发酵发酵过程中的中间分析项目发酵过程中的中间分析项目发酵过程中的中间分析项目发酵

3、过程中的中间分析项目产物产量pH糖氨基氮菌丝形态发酵过程的影响因素及控制发酵过程的影响因素及控制发酵过程的影响因素及控制发酵过程的影响因素及控制菌体浓度营养物质温度pH溶氧泡沫染菌发酵终点的判断u菌体浓度在适合的生长速率下，发酵产物的产率与菌体浓度成正比关系。特别是初级代谢产物。菌体浓度过低，产物产率下降。菌体浓度过高，产生其他影响。措施：调节培养基中的营养物质的浓度。u营养物质碳源氮源磷酸盐：生长亚适量浓度补料：半饥饿状态u温度考虑菌种及生长阶段综合考虑其他培养条件考虑菌种生长情况发酵热upH补加酸或碱和补料的方式u溶氧和CO2溶氧异常下降溶氧异常上升措施u泡沫负面影响措施u染菌发酵前期染菌

4、发酵后期染菌u发酵终点的判断提高产物的产量和经济效益降低生产成本主要指标与中间分析项目雷同L/O/G/O第五节第五节第五节第五节 发酵工业中的发酵工业中的发酵工业中的发酵工业中的 代谢调控代谢调控代谢调控代谢调控代谢调控代谢调控运用人为的方法对微生物的代谢调节系统进行遗传改造和条件的控制，在保证微生物适当生长的条件下，建立新的代谢方式，以期按照人们的意志有目的地过量积累所需的代谢产物，提高生产效率。初级代谢初级代谢能使营养物质转变成机体的结构物质和对机体具有生理活性作用的物质，或是为机体生长提供能量的一类代谢。次级代谢次级代谢存在于某些生物中（如某些植物和微生物），并在一定的生长期内出现的一类

5、代谢。在抵御恶劣环境、伪装躲避、清除自身毒素和排泄物时很重要。微生物初级代谢与次级代谢的关系微生物初级代谢与次级代谢的关系多糖、蛋白质、脂肪、无机盐初级代谢中间产物（单糖、氨基酸、核苷酸、脂肪酸）蛋白质、核酸、粘多糖、脂多糖等生物大分子分解 合成分解代谢生物合成生长抗生素、生物碱、色素、毒素等次级代谢产物代谢产物合成的调控代谢产物合成的调控初级代谢对次级代谢的调节碳代谢物的调节氮代谢物的调节磷酸盐的调节ATP的调节诱导物调节末端产物的反馈调节细胞膜通透性调节其他：金属离子、溶解氧等的调节初级代谢对次级代谢的调节初级代谢对次级代谢的调节次级代谢产物以初级代谢产物为母体衍生而来。次级代谢产物合成反

6、应的酶由初级代谢途径的酶演化而来。因此，初级代谢终产物的过量往往会抑制次级代谢产物的合成。碳代谢物的调节碳代谢物的调节u葡萄糖效应u解除方法变更速效碳源和迟效碳源的配比；流加葡萄糖。氮代谢物的调节氮代谢物的调节u分解代谢物阻遏效应u解除方法变更速效氮源和迟效氮源的配比；流加无机氮。磷酸盐的调节磷酸盐的调节u磷酸盐效应：类似于葡萄糖效应u机制：促进初级代谢、抑制次级代谢抑制次级代谢产物前体的形成阻遏某些关键酶的合成抑制某些关键酶的活性增加菌体能荷状态ATP的调节的调节直接影响次级代谢产物合成和糖代谢中某些酶的活性。如四环素的合成。诱导物调节诱导物调节某些参与次级代谢产物合成的酶为诱导酶。需有诱导

7、物存在，诱导酶才能形成。如甲硫氨酸诱导头孢菌素C。末端产物的反馈调节末端产物的反馈调节末端产物抑制合成途径中的第一个酶的活性，从而降低产物合成代谢的能力。原位产物分离偶联技术（in situ product removal，ISPR）细胞膜通透性调节细胞膜通透性调节利于代谢产物分泌到胞外，减少胞内浓度，从而避免末端产物的反馈调节。如：谷氨酸的生产，采取控制生物素浓度、添加青霉素、添加吐温80等表面活性剂、选育油酸缺陷型菌株等方法。L/O/G/O抗生素的发酵生产抗生素的发酵生产抗生素的定义抗生素的定义生物在其生产活动过程中所产生，并能在低微浓度下有选择性地抑制或杀灭其他微生物或肿瘤细胞的有机物。

8、发展历史发展历史1929年，英国弗莱明发现青霉素。二战期间，大规模发酵生产，世界上最早用于临床的抗生素。20世纪60-70年代，利用生物合成和半合成方法研制抗生素衍生物。20世纪80年代至今，根据作用机理理性筛选阶段，包括耐药筛选模型等。抗生素的分类抗生素的分类根据抗生素的生物来源分根据抗生素的作用对象分根据抗生素的作用机制分根据抗生素的化学结构分根据抗生素的生物来源分根据抗生素的生物来源分放线菌产生的抗生素：链霉素、四环素、红霉素真菌产生的抗生素：青霉素、头孢菌素细菌菌产生的抗生素：多粘菌素、杆菌肽根据抗生素的作用对象分根据抗生素的作用对象分抗G+的抗生素：青霉素、红霉素抗G-的抗生素：链霉

9、素、多粘菌素广谱抗生素：氨苄青霉素 抗真菌抗生素：两性霉素抗病毒和噬菌体抗生素：氯霉素、艾霉素抗原虫抗生素：灭滴虫素抗癌抗生素：阿霉素、博莱霉素根据抗生素的作用机制分根据抗生素的作用机制分抑制细胞壁合成：青霉素、头孢菌素抑制细胞膜功能：多粘菌素干扰蛋白质合成：四环素抑制核酸合成：博莱霉素、利福霉素抑制生物能作用：抗霉素根据抗生素的化学结构分根据抗生素的化学结构分-内酰胺类：青霉素类、头孢菌素类氨基糖苷类：链霉素、庆大霉素大环内酯类：红霉素、麦迪加霉素四环类：四环素、土霉素多肽类：多粘菌素 HNONSCH3CH3HCOO-H-lactam ring-内酰胺环内酰胺环Rnatural penici

10、llin R=CH2-CO-内酰胺类抗生素的结构特征内酰胺类抗生素的结构特征氨苄青霉素氨苄青霉素甲氧苯青霉素甲氧苯青霉素羧苄青霉素羧苄青霉素苯唑西林苯唑西林大环内酯类和四环类抗生素的结构特征大环内酯类和四环类抗生素的结构特征-内酰胺类抗生素的生物合成内酰胺类抗生素的生物合成L-氨基己二酸氨基己二酸+L-半胱氨酸半胱氨酸+L-缬缬氨酸氨酸ACV三肽三肽ACV合成酶异青霉素异青霉素N(IPN)异青霉素合成酶6-APA青霉素青霉素N，青霉素青霉素G头孢菌素头孢菌素C-内酰胺类抗生素的代谢调控内酰胺类抗生素的代谢调控碳源分解代谢物阻遏赖氨酸的反馈调节：共同中间体L-甲硫氨酸对头孢菌素C的诱导作用头孢菌

11、素C的扩环/羟化双功能酶需Fe2+，分子氧等辅助因子缬氨酸是青霉素生物合成的前体青霉素的发酵生产青霉素的发酵生产工艺流程工艺控制要点工艺控制要点u生产种子的制备丝状菌的生产种子是由保藏在低温的冷冻安瓿管经甘油、葡萄糖、蛋白胨斜面移植到小（大）米固体培养基上，25培养7天，真空干燥并以这种形式保存备用。生产时按10%接种量移种到含有葡萄糖、玉米浆、尿素为主的种子罐内，26培养至 菌丝浓度达6-8%，菌丝形态正常，按 10-15%的接种量移入含有花生饼粉、葡萄糖为主的二级种子罐内，27培养 至菌丝浓度10-12%，形态正常，即可作为发酵种子。培养基成分的控制培养基成分的控制u碳源产黄青霉菌可利用的

12、碳源有乳糖、蔗糖、葡萄糖等。目前生产上普遍采用的是淀粉水解液、糖化液为碳源，进行连续流加的方式。u氮源 氮源常选用玉米浆、精制棉籽饼粉、麸皮，并补加无机氮源（硫酸氨、氨水或尿素）。u前体 生物合成含有苄基基团的青霉素G，需在发酵液中加入前体。前体可用苯乙酸、苯乙酰胺，一次加入量不大于0.1%，并采用多次加入，以防止前体对青霉素的毒害。u无机盐加入的无机盐包括硫、磷、钙、镁、钾等,且用量要适度。另外，由于铁离子对青霉菌有毒害作用,必须严格控制铁离子的浓度，一般控制在30 g/ml。发酵培养的控制发酵培养的控制u加糖控制加糖量的控制是根据残糖量及发酵过程中的 pH 值确定。最好是根据排气中CO2量

13、及 O2 量来控制，一般在残糖降至 0.6%左右，pH 值上升时开始加糖。加糖率：0.07-0.15%，每2h一次或连续流加。补氮及加前体补氮及加前体补氮是指加硫酸铵、氨水或尿素。发酵60-70开始补加，使发酵液氨基氮控制在0.01%-0.05%。发酵8-12h后补前体，以使发酵液中残存苯乙酰胺浓度为0.05%-0.08%。pH 值控制值控制一般为 pH6.5-6.9，尽量避免超过pH7.0。pH上升可以补加葡萄糖或天然油脂来控制；pH下降则提高通气量，或补加氨水和碳酸钙来控制。目前生产上趋于采用直接加酸或加碱自动控制pH。温度控制温度控制前期 25-26，后期 23，以减少后期发酵液中青霉素

14、的降解破坏。溶解氧和搅拌速率的控制溶解氧和搅拌速率的控制一般要求发酵中溶解氧量不低于饱和溶解氧的30%。通风比一般为1:0.8vvm。搅拌转速在发酵各阶段应根据需要而调整。泡沫的控制泡沫的控制在发酵过程中产生大量泡沫，可以用天然油脂，如豆油、玉米油等或用化学合成消泡剂“泡敌”来消泡，应当控制其用量并要少量多次加入，尤其在发酵前期不宜多用，否则会影响菌体的呼吸代谢。发酵液质量控制发酵液质量控制生产上按规定时间从发酵罐中取样，用显微镜观察菌丝形态变化来控制发酵。生产上惯称“镜检”，根据“镜检”中菌丝形变化和代谢变化的其他指标调节发酵温度，通过追加糖或补加前体等各种措施来延长发酵时间，以获得最多青霉

15、素。青霉素的提取纯化工艺青霉素的提取纯化工艺发酵液的过滤和预处理发酵液的过滤和预处理低温过滤：鼓式过滤或板框过滤杂蛋白去除：硫酸调pH4.5-5.0，0.07%絮凝剂PPB和0.07%硅藻土二次过滤。萃取萃取乙酸丁酯（BA）二次萃取法一次萃取：pH1.8-2.2，浓缩倍数1.5-2.0。反萃取：pH6.8-7.2，浓缩倍数3-4。二次萃取：pH1.8-2.2，浓缩倍数2-2.5。萃取方式：多级逆流萃取结晶结晶结晶方法：碱金属盐法和普罗卡因盐法碱金属盐法：二次BA萃取液中加入乙酸钾或乙酸钠的乙醇溶液，青霉素钾盐或钠盐结晶析出。重结晶方法：真空共沸蒸馏结晶法普罗卡因盐法：在青霉素钾盐的水溶液中（p

16、H中性）加入盐酸普罗卡因溶液，普罗卡因青霉素结晶析出。其他微生物药物的发酵生产其他微生物药物的发酵生产头孢菌素C氨基酸：谷氨酸、赖氨酸维生素：B1、B2、B12思考题思考题1.代谢产物合成的主要受哪些方面的调控？2.青霉素发酵生产要点有哪些？9、静夜四无邻，荒居旧业贫。3月-233月-23Friday,March 17,202310、雨中黄叶树，灯下白头人。06:29:5506:29:5506:293/17/2023 6:29:55 AM11、以我独沈久，愧君相见频。3月-2306:29:5506:29Mar-2317-Mar-2312、故人江海别，几度隔山川。06:29:5506:29:55

17、06:29Friday,March 17,202313、乍见翻疑梦，相悲各问年。3月-233月-2306:29:5506:29:55March 17,202314、他乡生白发，旧国见青山。17 三月 20236:29:55 上午06:29:553月-2315、比不了得就不比，得不到的就不要。三月 236:29 上午3月-2306:29March 17,202316、行动出成果，工作出财富。2023/3/17 6:29:5506:29:5517 March 202317、做前，能够环视四周；做时，你只能或者最好沿着以脚为起点的射线向前。6:29:55 上午6:29 上午06:29:553月-23

18、9、没有失败，只有暂时停止成功！。3月-233月-23Friday,March 17,202310、很多事情努力了未必有结果，但是不努力却什么改变也没有。06:29:5506:29:5506:293/17/2023 6:29:55 AM11、成功就是日复一日那一点点小小努力的积累。3月-2306:29:5506:29Mar-2317-Mar-2312、世间成事，不求其绝对圆满，留一份不足，可得无限完美。06:29:5506:29:5506:29Friday,March 17,202313、不知香积寺，数里入云峰。3月-233月-2306:29:5506:29:55March 17,202314

19、、意志坚强的人能把世界放在手中像泥块一样任意揉捏。17 三月 20236:29:55 上午06:29:553月-2315、楚塞三湘接，荆门九派通。三月 236:29 上午3月-2306:29March 17,202316、少年十五二十时，步行夺得胡马骑。2023/3/17 6:29:5506:29:5517 March 202317、空山新雨后，天气晚来秋。6:29:55 上午6:29 上午06:29:553月-239、杨柳散和风，青山澹吾虑。3月-233月-23Friday,March 17,202310、阅读一切好书如同和过去最杰出的人谈话。06:29:5506:29:5506:293/1

20、7/2023 6:29:55 AM11、越是没有本领的就越加自命不凡。3月-2306:29:5506:29Mar-2317-Mar-2312、越是无能的人，越喜欢挑剔别人的错儿。06:29:5506:29:5506:29Friday,March 17,202313、知人者智，自知者明。胜人者有力，自胜者强。3月-233月-2306:29:5506:29:55March 17,202314、意志坚强的人能把世界放在手中像泥块一样任意揉捏。17 三月 20236:29:55 上午06:29:553月-2315、最具挑战性的挑战莫过于提升自我。三月 236:29 上午3月-2306:29March

21、17,202316、业余生活要有意义，不要越轨。2023/3/17 6:29:5506:29:5517 March 202317、一个人即使已登上顶峰，也仍要自强不息。6:29:55 上午6:29 上午06:29:553月-23MOMODA POWERPOINTLorem ipsum dolor sit amet,consectetur adipiscing elit.Fusce id urna blandit,eleifend nulla ac,fringilla purus.Nulla iaculis tempor felis ut cursus.感感 谢谢 您您 的的 下下 载载 观观 看看专家告诉