[精选]干扰素的生产工艺11172.pptx

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1、干扰素的生产工艺干扰素的生产工艺中文名称：中文名称：干扰素 英文名称：英文名称：interferon;IFN药物类别：抗肿瘤药，抗病毒药所属类别：生物反应调节剂 干扰素简介干扰素简介 n70年代中期人们发现慢性乙型肝炎患者自身产生干扰素的能力低下，在应用外源性干扰素后，不仅产生了上述抗病毒作用，同时可以增加肝细胞膜上人白细胞组织相容性抗原的密度，促进T细胞溶解感染性肝细胞的效能.现状现状n目前可供临床选用的干扰素种类很多。例如国产重组 IFN1型和IFN2型，进口的干扰能（IFN2b）、罗扰素（IFN2a）、惠福仁（类淋巴母细胞干扰素）及组合干扰素等等。类别类别n各种亚型的干扰素-（含1或2或

2、2a或2b）疗效近似；干扰素-（IFN）也有相似效果，但它在肌肉组织中易被灭活。干扰素-制剂进入血液后，稳定性差，确切疗效尚在观察中，但可作为干扰素-的替代制剂。什么是干扰素（什么是干扰素（IFN）?n干扰素是由病毒和其他种类的干扰素诱导剂，通过刺激网状内皮系统（人体免疫系统的一种）、巨噬细胞、淋巴细胞以及体细胞所产生的一种糖蛋白。这种蛋白具有多种生物活性，包括抗增殖、免疫调节、抗病毒和诱导分化作用。n n干扰素的相对分子质量小，对热稳定，4可保存很长时间，-20可长期保存其活性，56则被破坏，pH（酸碱度）210范围内干扰素不被破坏。人体自然就能产生干扰素，经一定的制剂加工过程也能制造成药物

3、-干扰素制剂。药理作用：药理作用：n n1.抗病毒作用：其抗病毒活性不是杀灭而是抑制病毒，它一般为广谱病毒抑制剂，对RNA和DNA病毒都有抑制作用。n n2.抑制细胞增殖。干扰素抑制细胞分裂的活性有明显的选择性，对肿瘤细胞的活性比正常细胞大5001000倍。干扰素抗肿瘤效果可以是直接抑制肿瘤细胞增殖，或通过宿主机体的免疫防御机制限制肿瘤的生长。n n3诱导细胞凋亡：干扰素可以诱导肿瘤细胞凋亡，从而杀灭肿瘤细胞。n n4.干扰素对体液免疫、细胞免疫均有免疫调节作用，对巨噬细胞及NK细胞也有一定的免疫增强作用。作用机制作用机制:n n干扰素不能直接灭活病毒，而是通过诱导细胞合成抗病毒蛋白（AVP）

4、发挥效应。干扰素首先作用于细胞的干扰素受体，经信号转导等一系列生休过程，激活细胞基因表达多种抗病毒蛋白，实现对病毒的抑制作用。适应症：适应症：n n1.用于多种恶性肿瘤，包括毛细胞白血病、慢性白血病、非何淋巴瘤、骨髓瘤、膀胱癌、卵巢癌、晚期转移性肾癌及胰腺恶性内分泌肿瘤、黑色素瘤和Kaposi肉瘤等。n n2.与其他抗肿瘤药物并用。n n3.作为放疗、化疗及手术的辅助治疗剂。n n4.病毒性疾病的防治。不良反应：不良反应：n n1.全身反应主要表现为流感样症状，即寒战、发热和不适。n n2.骨髓抑制在用药中可出现白细胞、血小板和网状红细胞减少。n n3.局部反应部分患者在注射部位可出现红斑，并

5、有压痛，24小时后即可消退。n n4.其他脱发、皮疹、血沉加快、嗜睡、一过性肝损伤。偶见过敏性休克，用药前作过敏试验。临床上常用的干扰素有哪些制剂临床上常用的干扰素有哪些制剂 n n自然干扰素自然干扰素n n人体白细胞重组干扰素人体白细胞重组干扰素n n复合干扰素复合干扰素相关药物国内生产企业相关药物国内生产企业1.1b干扰素 中国预防医学科学院 卫生部长春生物制品研究所 卫生部上海生物制品研究所 深圳科兴生物制品有限公司（赛若金）2.人2a干扰素 卫生部长春生物制品研究所 广州医学院 沈阳三生制药股份有限公司（因特芬）海南新大洲药业有限公司（贝尔芬）浙江东阳市吴守联合生物技术研究所 深圳科兴

6、生物制品有限公司 武汉天奥制药有限公司（栓剂）3.3.人人2b 2b 干扰素干扰素 长春生物制品研究所长春生物制品研究所 安徽安科生物安徽安科生物高科技有限公司高科技有限公司(安达芬安达芬)丽珠集团苏州新宝药厂（隆化诺）丽珠集团苏州新宝药厂（隆化诺）哈尔滨金亚哈尔滨生物制品有限公司（利能）哈尔滨金亚哈尔滨生物制品有限公司（利能）上海华新生物高技术有限公司上海华新生物高技术有限公司 天津华立达生物工程公司天津华立达生物工程公司 苏州新良药厂苏州新良药厂 4.4.人人 干扰素干扰素 上海生物化学研究所上海生物化学研究所 中国预防医学科学院中国预防医学科学院 卫生部上海生物制品研究所卫生部上海生物制

7、品研究所 第二军医大学第二军医大学 上海克隆生物高技术有限公司上海克隆生物高技术有限公司 珠海丽珠制药有限公司珠海丽珠制药有限公司 干扰素生产工艺路线干扰素生产工艺路线:路线1：体外诱生干扰素制备工艺体外诱生干扰素制备工艺体外诱生干扰素制备工艺体外诱生干扰素制备工艺：n n Sendai Sendai病毒诱导人白细胞病毒诱导人白细胞n n19891989年：年：IFN-n3/AlferonIFN-n3/Alferon，批准上市，批准上市n n产量低：产量低：1g IFN1g IFN，需要，需要 3 3亿亿mlml人血白细胞人血白细胞n n来源困难，工艺复杂，收率低，价格昂贵来源困难，工艺复杂，

8、收率低，价格昂贵n n潜在的血源性病毒污染的可能性潜在的血源性病毒污染的可能性路线路线2：人源转化细胞系培养生产工艺：人源转化细胞系培养生产工艺：n n 1999年：IFN-n1/Wellferon,批准用于临床。n n 优点：首次实现大规模商业化生产。n n 缺点：活性低，退出临床应用。路线路线3：基因工程大肠杆菌发酵生产工艺基因工程大肠杆菌发酵生产工艺:上市产品：重组人干扰素上市产品：重组人干扰素rhuIFNrhuIFN 1986 1986，rhuIFN-2arhuIFN-2a，rhuIFN-2b rhuIFN-2b；1990 1990，rhuIFN-1brhuIFN-1b；1993199

9、3，rhuIFN-1brhuIFN-1b；2001 200120022002：PEG PEG化化IFNIFN，PEG-Intron,PegasysPEG-Intron,Pegasys 表达产物：无糖基化，表达产物：无糖基化，N-metN-met，无活性包涵体，无活性包涵体工艺特点：发酵过程，随后变性、复性过程。工艺特点：发酵过程，随后变性、复性过程。路线路线4：动物无限细胞系培养生产工艺：动物无限细胞系培养生产工艺：上市产品：上市产品：rhuIFN-1arhuIFN-1a19961996，Avonex(Biogen)Avonex(Biogen)；2002 2002，Rebif(Serono)R

10、ebif(Serono)表达产物：表达产物：166 aa 166 aa 糖基化蛋白，糖基化蛋白，22.5 ku22.5 ku工艺特点：分泌表达，产量低，成本高工艺特点：分泌表达，产量低，成本高,过程严格过程严格路线路线5：基因工程假单胞杆菌发酵生产工艺：基因工程假单胞杆菌发酵生产工艺：基因工程假单胞杆菌发酵生产工艺：基因工程假单胞杆菌发酵生产工艺：宿主：腐生型假单胞杆菌（宿主：腐生型假单胞杆菌（Pseudomonas putidaPseudomonas putida）上市产品：上市产品：IFN-2b/IFN-2b/安福隆安福隆表达产物：无糖基化可溶性蛋白质，具有天然分子表达产物：无糖基化可溶性

11、蛋白质，具有天然分子 结构和生物活性结构和生物活性工艺特点：工艺特点：发酵周期短：几个小时发酵周期短：几个小时无需变性、复性过程，获得有活性产品无需变性、复性过程，获得有活性产品纯化过程：淘汰抗体亲和层析纯化过程：淘汰抗体亲和层析基因工程假单胞杆菌的构建与保藏基因工程假单胞杆菌的构建与保藏n n基因工程假单胞杆菌菌种建立：n n第一步：干扰素-2b基因的克隆n n第二步：表达载体的构建n n第三步：工程菌的构建第一步：干扰素第一步：干扰素-2b基因的克隆基因的克隆制备白细胞，病毒诱导，分离mRNA,反录酶合成cDNA,PCR，基因连接质粒,转化E.coli,筛选鉴定克隆。测序：编码人IFN-2

12、b基因序列,501bp，165aa。第二步：表达载体的构建第二步：表达载体的构建IFN基因与表达载体连接转化大肠杆菌筛选阳性克隆获得序列正确表达载体第三步：工程菌的构建第三步：工程菌的构建n n转化假单胞杆n n筛选高表达、稳定遗传的工程菌n n获得原始菌种菌种库的建立与保藏菌种库的建立与保藏QC：菌种特性、生产能力、质粒稳定性菌种检查合格后，方可投产。干扰素-2b的发酵工艺过程摇瓶培养：摇瓶培养：n n取保存工作种子批菌种，室温融化n n摇瓶培养：30，pH7.0，250 r/min，182hn n检测：OD值和发酵液杂菌检查。种子罐培养：种子罐培养：接种：接入50L种子罐，接种量10%。培

13、养：30，pH7.0。控制：级联调节通气量和搅拌转速检测：显微镜和LB培养基划线检查，控制杂菌。发酵罐培养：发酵罐培养：uu接种：通入300L培养基的发酵罐，接种量10%。uu控制：级联调节通气量和搅拌转速。uu前4h：30，pH7.0，DO为30%。uu4h后：20，pH6.0，DO为60%，56.5h。uu终点控制：OD值达9.01.0，5冷却水快速降温至15以下。uu检测：发酵液杂菌检查菌体收集：菌体收集：连续流离心机：冷却的发酵液，16000 r/min离心收集。菌体保存：20冰柜，不超过12个月。检测：干扰素含量、菌体蛋白含量、菌体干燥失重、质粒结构一致性、质粒稳定性。干扰素干扰素-

14、2b分离工艺过程分离工艺过程n n菌体裂解n n预处理n n离心n n初级分离1.菌体裂解：菌体裂解：裂解缓冲液：纯化水配制，210（pH7.5）使用保护剂：EDTA，PMSF。破碎20菌体：2厘米以下的碎块搅拌：加裂解缓冲液，210，2hr冻融:细胞完全破裂，释放干扰素。2.预处理预处理-沉淀：沉淀：n n加絮凝剂聚乙烯亚胺:2 21010，搅拌，搅拌45min45min，对菌体碎片进行絮凝。，对菌体碎片进行絮凝。n n加凝聚剂醋酸钙溶液:2 21010,搅拌搅拌15min15min，对菌体碎片、，对菌体碎片、DNADNA等进行沉等进行沉淀。淀。3.离心：离心：连续流离心机：210，1600

15、0 r/min收集上清液：含有重组干扰素蛋白质杂质沉淀：121、30min 蒸汽灭菌,焚烧处理。4.初级分离：初级分离：盐析:4M硫酸铵，210，搅匀,静置过夜。离心：连续流离心机，16000 r/min保存：收集沉淀，粗干扰素，4保存。干扰素纯化工艺过程干扰素纯化工艺过程n n溶解粗干扰素n n沉淀与疏水层析n n阴离子交换层析与浓缩n n阳离子交换层析与浓缩n n凝胶过滤层析n n无菌过滤分装1.溶解粗干扰素溶解粗干扰素n n配制纯化缓冲液：超纯水，pH7.5磷酸缓冲液，0.45 m滤器和10 ku超滤系统，百级层流下收集。冷却至210。n n检查:缓冲液的pH值和电导值。n n溶解：21

16、0，匀浆，完全溶解。2.沉淀与疏水层析沉淀与疏水层析n n等电点沉淀（1）：磷酸调节至pH5.0，沉淀杂蛋白，离心收集上清液。n n疏水层析：n n洗脱与收集：0.01M磷酸缓冲液（pH8.0）。n n等电点沉淀（2）：磷酸调节pH4.5，调节电导值40 ms/cm，210，静置过夜n n超滤：1000 ku超滤膜过滤，除去大蛋白。n n透析除盐：调整溶液pH 8.0，电导值，10 ku超滤膜，0.005 M缓冲液。4.阳离子交换层析与浓缩阳离子交换层析与浓缩n n用0.1M醋酸缓冲液（pH 5.0）平衡树脂。n n上样，相同缓冲液冲洗。n n盐浓度线性梯度550 ms/cm进行洗脱n n配合

17、SDS-PAGE收集干扰素峰。n n浓缩：10 ku超滤膜进行。5.凝胶过滤层析凝胶过滤层析n n洗涤液：0.15 M NaCl的0.01M磷酸缓冲液（pH7.0）清洗系统和树脂n n上样，相同缓冲液进行洗脱。n n合并干扰素部分6.无菌过滤分装无菌过滤分装n n0.22 m滤膜过滤干扰素溶液n n分装n n20以下的冰箱中保存。7.检测项目检测项目n n干扰素鉴别试验n n干扰素效价测定n n蛋白质含量，纯度测定，分子量n n宿主残余蛋白、残余DNAn n干扰素结构鉴定：紫外光谱，肽谱，N端序列n n其他：热原，内毒素，残留抗生素n演示完毕！谢谢演示完毕！谢谢nn9 9、静夜四无邻，荒居旧业

18、贫。、静夜四无邻，荒居旧业贫。3 3月月-23-233 3月月-23-23Friday,March 17,2023Friday,March 17,2023nn1010、雨中黄叶树，灯下白头人。、雨中黄叶树，灯下白头人。14:39:0614:39:0614:39:0614:39:0614:3914:393/17/2023 2:39:06 PM3/17/2023 2:39:06 PMnn1111、以我独沈久，愧君相见频。、以我独沈久，愧君相见频。3 3月月-23-2314:39:0614:39:0614:3914:39Mar-23Mar-2317-Mar-2317-Mar-23nn1212、故人江

19、海别，几度隔山川。、故人江海别，几度隔山川。14:39:0614:39:0614:39:0614:39:0614:3914:39Friday,March 17,2023Friday,March 17,2023nn1313、乍见翻疑梦，相悲各问年。、乍见翻疑梦，相悲各问年。3 3月月-23-233 3月月-23-2314:39:0614:39:0614:39:0614:39:06March 17,2023March 17,2023nn1414、他乡生白发，旧国见青山。、他乡生白发，旧国见青山。17 17 三月三月 2023 20232:39:06 2:39:06 下午下午14:39:0614:3

20、9:063 3月月-23-23nn1515、比不了得就不比，得不到的就不要。、比不了得就不比，得不到的就不要。三月三月 23 232:39 2:39 下午下午3 3月月-23-2314:3914:39March 17,2023March 17,2023nn1616、行动出成果，工作出财富。、行动出成果，工作出财富。2023/3/17 14:39:062023/3/17 14:39:0614:39:0614:39:0617 March 202317 March 2023nn1717、做前，能够环视四周；做时，你只能或者最好沿着以脚为起点的射线向前。、做前，能够环视四周；做时，你只能或者最好沿着以

21、脚为起点的射线向前。2:39:06 2:39:06 下午下午2:39 2:39 下午下午14:39:0614:39:063 3月月-23-23nn9 9、没有失败，只有暂时停止成功！。、没有失败，只有暂时停止成功！。3 3月月-23-233 3月月-23-23Friday,March 17,2023Friday,March 17,2023nn1010、很多事情努力了未必有结果，但是不努力却什么改变也没有。、很多事情努力了未必有结果，但是不努力却什么改变也没有。14:39:0614:39:0614:39:0614:39:0614:3914:393/17/2023 2:39:06 PM3/17/2

22、023 2:39:06 PMnn1111、成功就是日复一日那一点点小小努力的积累。、成功就是日复一日那一点点小小努力的积累。3 3月月-23-2314:39:0614:39:0614:3914:39Mar-23Mar-2317-Mar-2317-Mar-23nn1212、世间成事，不求其绝对圆满，留一份不足，可得无限完美。、世间成事，不求其绝对圆满，留一份不足，可得无限完美。14:39:0614:39:0614:39:0614:39:0614:3914:39Friday,March 17,2023Friday,March 17,2023nn1313、不知香积寺，数里入云峰。、不知香积寺，数里入

23、云峰。3 3月月-23-233 3月月-23-2314:39:0614:39:0614:39:0614:39:06March 17,2023March 17,2023nn1414、意志坚强的人能把世界放在手中像泥块一样任意揉捏。、意志坚强的人能把世界放在手中像泥块一样任意揉捏。17 17 三月三月 2023 20232:39:06 2:39:06 下午下午14:39:0614:39:063 3月月-23-23nn1515、楚塞三湘接，荆门九派通。、楚塞三湘接，荆门九派通。三月三月 23 232:39 2:39 下午下午3 3月月-23-2314:3914:39March 17,2023Marc

24、h 17,2023nn1616、少年十五二十时，步行夺得胡马骑。、少年十五二十时，步行夺得胡马骑。2023/3/17 14:39:062023/3/17 14:39:0614:39:0614:39:0617 March 202317 March 2023nn1717、空山新雨后，天气晚来秋。、空山新雨后，天气晚来秋。2:39:06 2:39:06 下午下午2:39 2:39 下午下午14:39:0614:39:063 3月月-23-23nn9 9、杨柳散和风，青山澹吾虑。、杨柳散和风，青山澹吾虑。3 3月月-23-233 3月月-23-23Friday,March 17,2023Friday,

25、March 17,2023nn1010、阅读一切好书如同和过去最杰出的人谈话。、阅读一切好书如同和过去最杰出的人谈话。14:39:0614:39:0614:39:0614:39:0614:3914:393/17/2023 2:39:06 PM3/17/2023 2:39:06 PMnn1111、越是没有本领的就越加自命不凡。、越是没有本领的就越加自命不凡。3 3月月-23-2314:39:0614:39:0614:3914:39Mar-23Mar-2317-Mar-2317-Mar-23nn1212、越是无能的人，越喜欢挑剔别人的错儿。、越是无能的人，越喜欢挑剔别人的错儿。14:39:0614

26、:39:0614:39:0614:39:0614:3914:39Friday,March 17,2023Friday,March 17,2023nn1313、知人者智，自知者明。胜人者有力，自胜者强。、知人者智，自知者明。胜人者有力，自胜者强。3 3月月-23-233 3月月-23-2314:39:0614:39:0614:39:0614:39:06March 17,2023March 17,2023nn1414、意志坚强的人能把世界放在手中像泥块一样任意揉捏。、意志坚强的人能把世界放在手中像泥块一样任意揉捏。17 17 三月三月 2023 20232:39:06 2:39:06 下午下午14

27、:39:0614:39:063 3月月-23-23nn1515、最具挑战性的挑战莫过于提升自我。、最具挑战性的挑战莫过于提升自我。三月三月 23 232:39 2:39 下午下午3 3月月-23-2314:3914:39March 17,2023March 17,2023nn1616、业余生活要有意义，不要越轨。、业余生活要有意义，不要越轨。2023/3/17 14:39:062023/3/17 14:39:0614:39:0614:39:0617 March 202317 March 2023nn1717、一个人即使已登上顶峰，也仍要自强不息。、一个人即使已登上顶峰，也仍要自强不息。2:39:06 2:39:06 下午下午2:39 2:39 下午下午14:39:0614:39:063 3月月-23-23MOMODA POWERPOINTLorem ipsum dolor sit amet,consectetur adipiscing elit.Fusce id urna blandit,eleifend nulla ac,fringilla purus.Nulla iaculis tempor felis ut cursus.感感 谢谢 您您 的的 下下 载载 观观 看看专家告诉