核酸提取分离.ppt
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1、关于核酸的提取分离关于核酸的提取分离第一张,PPT共二十六页,创作于2022年6月第五章第五章 核酸的提取分离核酸的提取分离l l5.1概述概述概述概述l l5.25.2核酸的理化性质核酸的理化性质l l5.35.3核酸的作用与用途核酸的作用与用途核酸的作用与用途核酸的作用与用途l l5.45.4动物脏器核酸的提取分离方法动物脏器核酸的提取分离方法动物脏器核酸的提取分离方法动物脏器核酸的提取分离方法l l5.5转移因子的制备转移因子的制备转移因子的制备转移因子的制备l l5.65.6辅酶辅酶A A的提取的提取的提取的提取l l5.75.7复合辅酶的提取复合辅酶的提取复合辅酶的提取复合辅酶的提取
2、l l5.85.8从啤酒酵母中提取从啤酒酵母中提取RNA第二张,PPT共二十六页,创作于2022年6月5.1概述概述核核酸(酸(nucleicacid)核苷酸核苷酸(nucleotide)磷酸磷酸(phosphoricacid)核苷核苷(nucleoside)戊糖戊糖(pentose)碱碱 基基(base)第三张,PPT共二十六页,创作于2022年6月组成核苷酸的碱基组成核苷酸的碱基第四张,PPT共二十六页,创作于2022年6月Fig.2-4 The primary structure of DNA.第五张,PPT共二十六页,创作于2022年6月l l脱氧核糖核酸(脱氧核糖核酸(脱氧核糖核酸(
3、脱氧核糖核酸(DNADNA)主要存在于细胞核的染色体中,核糖核)主要存在于细胞核的染色体中,核糖核)主要存在于细胞核的染色体中,核糖核)主要存在于细胞核的染色体中,核糖核酸(酸(酸(酸(RNARNA)主要存在于细胞的微粒体中,各种生物体含有)主要存在于细胞的微粒体中,各种生物体含有)主要存在于细胞的微粒体中,各种生物体含有)主要存在于细胞的微粒体中,各种生物体含有核酸的多少不同核酸的多少不同核酸的多少不同核酸的多少不同l l应用于临床的核酸及其衍生物类生化产品越来越多应用于临床的核酸及其衍生物类生化产品越来越多应用于临床的核酸及其衍生物类生化产品越来越多应用于临床的核酸及其衍生物类生化产品越来
4、越多l l我国人工合成丙氨酸转移核糖核酸,我国人工合成丙氨酸转移核糖核酸,我国人工合成丙氨酸转移核糖核酸,我国人工合成丙氨酸转移核糖核酸,7676个核苷酸,与天然酵个核苷酸,与天然酵个核苷酸,与天然酵个核苷酸,与天然酵母丙氨酸核糖核酸具有相同的化学结构,有接受丙氨酸、将母丙氨酸核糖核酸具有相同的化学结构,有接受丙氨酸、将母丙氨酸核糖核酸具有相同的化学结构,有接受丙氨酸、将母丙氨酸核糖核酸具有相同的化学结构,有接受丙氨酸、将携带的丙氨酸掺入到蛋白质中的生物活力携带的丙氨酸掺入到蛋白质中的生物活力携带的丙氨酸掺入到蛋白质中的生物活力携带的丙氨酸掺入到蛋白质中的生物活力第六张,PPT共二十六页,创作
5、于2022年6月l l呈味呈味呈味呈味核苷酸核苷酸核苷酸核苷酸是目前国际上流行的新型鲜味剂,其学名为是目前国际上流行的新型鲜味剂,其学名为是目前国际上流行的新型鲜味剂,其学名为是目前国际上流行的新型鲜味剂,其学名为5 5IMPIMP(肌(肌(肌(肌苷酸钠)、苷酸钠)、苷酸钠)、苷酸钠)、5 5GMPGMP(鸟苷酸钠)、(鸟苷酸钠)、(鸟苷酸钠)、(鸟苷酸钠)、I IGG(5050IMPIMP5050GMPGMP),),),),我国第三代鲜味剂鸡精的特点为:由鸡肉、鸡我国第三代鲜味剂鸡精的特点为:由鸡肉、鸡我国第三代鲜味剂鸡精的特点为:由鸡肉、鸡我国第三代鲜味剂鸡精的特点为:由鸡肉、鸡蛋、呈味蛋
6、、呈味蛋、呈味蛋、呈味核苷酸核苷酸核苷酸核苷酸、水解蛋白粉、味精及多种、水解蛋白粉、味精及多种、水解蛋白粉、味精及多种、水解蛋白粉、味精及多种调味调味调味调味料复合而成。料复合而成。料复合而成。料复合而成。l l核酸类的药物主要是核苷酸、嘌呤及嘧啶类相关的衍生物核酸类的药物主要是核苷酸、嘌呤及嘧啶类相关的衍生物核酸类的药物主要是核苷酸、嘌呤及嘧啶类相关的衍生物核酸类的药物主要是核苷酸、嘌呤及嘧啶类相关的衍生物l l保健品:某核酸公司宣称其产品具有增强基因自主修复能力,保健品:某核酸公司宣称其产品具有增强基因自主修复能力,保健品:某核酸公司宣称其产品具有增强基因自主修复能力,保健品:某核酸公司宣
7、称其产品具有增强基因自主修复能力,还能改善微循环、改善脑机能;促进新陈代谢、抗疲劳;提还能改善微循环、改善脑机能;促进新陈代谢、抗疲劳;提还能改善微循环、改善脑机能;促进新陈代谢、抗疲劳;提还能改善微循环、改善脑机能;促进新陈代谢、抗疲劳;提高免疫力;活化皮肤细胞、润肤美容。高免疫力;活化皮肤细胞、润肤美容。高免疫力;活化皮肤细胞、润肤美容。高免疫力;活化皮肤细胞、润肤美容。核酸在食品和药品领域中的应用核酸在食品和药品领域中的应用核酸在食品和药品领域中的应用核酸在食品和药品领域中的应用?第七张,PPT共二十六页,创作于2022年6月核酸工业的市场分析核酸工业的市场分析l l核酸药物产品的开发已
8、有近核酸药物产品的开发已有近核酸药物产品的开发已有近核酸药物产品的开发已有近7070年历史。目前,日本是核酸产年历史。目前,日本是核酸产年历史。目前,日本是核酸产年历史。目前,日本是核酸产品的最大生产国,其年产量约品的最大生产国,其年产量约品的最大生产国,其年产量约品的最大生产国,其年产量约75007500吨,约占世界产量的吨,约占世界产量的吨,约占世界产量的吨,约占世界产量的90%90%;西方国家中,意大利也有核酸产品,但产量不是很;西方国家中,意大利也有核酸产品,但产量不是很;西方国家中,意大利也有核酸产品,但产量不是很;西方国家中,意大利也有核酸产品,但产量不是很大。近年来,韩国核酸产业
9、兴起,主要为调味品。大。近年来,韩国核酸产业兴起,主要为调味品。大。近年来,韩国核酸产业兴起,主要为调味品。大。近年来,韩国核酸产业兴起,主要为调味品。l l我国核酸产品的研究开发起步较早,并取得了令人瞩目的成就。我国核酸产品的研究开发起步较早,并取得了令人瞩目的成就。我国核酸产品的研究开发起步较早,并取得了令人瞩目的成就。我国核酸产品的研究开发起步较早,并取得了令人瞩目的成就。然而目前我国核酸药物产品主要依靠进口,仅然而目前我国核酸药物产品主要依靠进口,仅然而目前我国核酸药物产品主要依靠进口,仅然而目前我国核酸药物产品主要依靠进口,仅ATPATP一项每年就一项每年就一项每年就一项每年就从日本
10、进口金额达八千万美元从日本进口金额达八千万美元从日本进口金额达八千万美元从日本进口金额达八千万美元 第八张,PPT共二十六页,创作于2022年6月5.2核酸的理化性质核酸的理化性质l l5.2.1核酸的一般性质核酸的一般性质1 1、DNADNA分子与蛋白质分子、分子与蛋白质分子、分子与蛋白质分子、分子与蛋白质分子、RNARNA相对分子质量?相对分子质量?相对分子质量?相对分子质量?2 2、DNADNA白色纤维状固体,白色纤维状固体,白色纤维状固体,白色纤维状固体,RNARNA白色粉末,均微溶于水,稀碱溶液白色粉末,均微溶于水,稀碱溶液白色粉末,均微溶于水,稀碱溶液白色粉末,均微溶于水,稀碱溶液
11、中成盐后易溶于水,不溶于有机溶剂,但可溶于乙醇的水溶液,中成盐后易溶于水,不溶于有机溶剂,但可溶于乙醇的水溶液,中成盐后易溶于水,不溶于有机溶剂,但可溶于乙醇的水溶液,中成盐后易溶于水,不溶于有机溶剂,但可溶于乙醇的水溶液,乙醇乙醇乙醇乙醇5050(w/ww/w)时,)时,)时,)时,DNADNA析出,析出,析出,析出,当当当当7575时,时,时,时,RNARNA也沉也沉也沉也沉淀出来淀出来淀出来淀出来l l溶解度差别分离溶解度差别分离溶解度差别分离溶解度差别分离101066几千到百万几千到百万 几万到几百万几万到几百万第九张,PPT共二十六页,创作于2022年6月盐溶液中溶解度差异盐溶液中溶
12、解度差异l提取提取RNA时时NaCl盐溶液浓度仅为盐溶液浓度仅为0.14mol/L即即可可l而提取而提取DNA时,需先用时,需先用0.14mol/LNaCl将将RNA除掉,再继续增加除掉,再继续增加NaCl浓度至浓度至1mol/L时才能够时才能够将将DNA提取出来提取出来第十张,PPT共二十六页,创作于2022年6月5.2.1核酸的一般性质核酸的一般性质3 3、DNADNA极稀的溶液黏度极大,变性时黏度降低,极稀的溶液黏度极大,变性时黏度降低,极稀的溶液黏度极大,变性时黏度降低,极稀的溶液黏度极大,变性时黏度降低,pHpH超出超出超出超出5.6-10.95.6-10.9时,相对黏度突然降低时,
13、相对黏度突然降低时,相对黏度突然降低时,相对黏度突然降低4 4、可被可被可被可被酸、碱或酶水解酸、碱或酶水解酸、碱或酶水解酸、碱或酶水解成各种组分,用层析、电泳等方法分离,成各种组分,用层析、电泳等方法分离,成各种组分,用层析、电泳等方法分离,成各种组分,用层析、电泳等方法分离,主要利用:主要利用:主要利用:主要利用:RNARNA的磷酸酯键对碱敏感:的磷酸酯键对碱敏感:的磷酸酯键对碱敏感:的磷酸酯键对碱敏感:室温,室温,室温,室温,0.31mol/LKOH0.31mol/LKOH,24h24h,可将,可将,可将,可将RNARNA完全水解,得到完全水解,得到完全水解,得到完全水解,得到2-2-或
14、或或或3-3-核苷酸的混合物。核苷酸的混合物。核苷酸的混合物。核苷酸的混合物。DNADNA抗碱水解抗碱水解抗碱水解抗碱水解生理意义生理意义生理意义生理意义:DNADNA更稳定更稳定更稳定更稳定,遗传信息。,遗传信息。,遗传信息。,遗传信息。RNARNA是是是是DNADNA的的的的信信信信使使使使,完完完完成成成成任务后迅速降解。任务后迅速降解。任务后迅速降解。任务后迅速降解。第十一张,PPT共二十六页,创作于2022年6月5.2.2核酸的紫外吸收性质核酸的紫外吸收性质l l嘌呤、嘧啶环嘌呤、嘧啶环嘌呤、嘧啶环嘌呤、嘧啶环共轭双键共轭双键共轭双键共轭双键紫外吸收,核酸紫外吸收,核酸紫外吸收,核酸
15、紫外吸收,核酸 max max 260nm260nm附附附附近,而近,而近,而近,而 min min 230nm230nm1 1、鉴定纯度、鉴定纯度、鉴定纯度、鉴定纯度纯纯纯纯DNADNA的的的的A A260260/A/A2802801.81.8;纯纯纯纯RNARNA的的的的A A260260/A/A2802802.02.0若溶液中含有杂蛋白或苯酚,则若溶液中含有杂蛋白或苯酚,则若溶液中含有杂蛋白或苯酚,则若溶液中含有杂蛋白或苯酚,则A A260260/A/A280280 2 2、含量计算,含量计算,含量计算,含量计算,吸光值为吸光值为吸光值为吸光值为1.001.00时,相当于:时,相当于:时
16、,相当于:时,相当于:50ug/mL50ug/mL双螺旋双螺旋双螺旋双螺旋DNADNA或:或:或:或:40ug/mL40ug/mL单链单链单链单链DNADNA(或(或(或(或RNARNA)或:或:或:或:20ug/mL20ug/mL寡核苷酸寡核苷酸寡核苷酸寡核苷酸第十二张,PPT共二十六页,创作于2022年6月lDNA和和RNA均在紫外光下有最高吸收峰,可采用均在紫外光下有最高吸收峰,可采用OD260nm测定其浓度测定其浓度l另一方面另一方面DNA和和RNA含磷含糖,所以可通过糖含量及磷含含磷含糖,所以可通过糖含量及磷含量的测定方法间接表征核酸的含量量的测定方法间接表征核酸的含量lRNA所含糖
17、为核糖所含糖为核糖苔黑酚法测定;苔黑酚法测定;lDNA所含糖为脱氧核糖所含糖为脱氧核糖二苯胺法测定。二苯胺法测定。l含磷量测定时均需先经过消化将有机磷转变为无机磷才能含磷量测定时均需先经过消化将有机磷转变为无机磷才能测定,纯测定,纯RNA含磷量为含磷量为9,而纯,而纯DNA含磷量为含磷量为9.2%。第十三张,PPT共二十六页,创作于2022年6月5.2.3核酸的变性和复性核酸的变性和复性 高温(热变性)、酸碱(高温(热变性)、酸碱(高温(热变性)、酸碱(高温(热变性)、酸碱(pHpH小于小于小于小于4 4或大于或大于或大于或大于1111)及某些变性剂(尿素、)及某些变性剂(尿素、)及某些变性剂
18、(尿素、)及某些变性剂(尿素、盐酸胍、甲醛)能破坏核酸双螺旋区的氢键断裂,变成单链,不盐酸胍、甲醛)能破坏核酸双螺旋区的氢键断裂,变成单链,不盐酸胍、甲醛)能破坏核酸双螺旋区的氢键断裂,变成单链,不盐酸胍、甲醛)能破坏核酸双螺旋区的氢键断裂,变成单链,不涉及共价键断裂。涉及共价键断裂。涉及共价键断裂。涉及共价键断裂。第十四张,PPT共二十六页,创作于2022年6月变性后的理化性质变性后的理化性质DNADNA的变性是爆发式的变性是爆发式的变性是爆发式的变性是爆发式的,变性的,变性的,变性的,变性作用发生在一个很窄的温度范围内。作用发生在一个很窄的温度范围内。作用发生在一个很窄的温度范围内。作用发
19、生在一个很窄的温度范围内。粘度降低,浮力密度升高。粘度降低,浮力密度升高。粘度降低,浮力密度升高。粘度降低,浮力密度升高。二级结构改变,部分失活。二级结构改变,部分失活。二级结构改变,部分失活。二级结构改变,部分失活。260nm260nm吸收值升高。吸收值升高。吸收值升高。吸收值升高。增色效应与减色效应增色效应与减色效应增色效应与减色效应增色效应与减色效应增色效应:在增色效应:在增色效应:在增色效应:在DNADNA的变性过程中,摩尔吸光系数增大的变性过程中,摩尔吸光系数增大的变性过程中,摩尔吸光系数增大的变性过程中,摩尔吸光系数增大减色效应:在减色效应:在减色效应:在减色效应:在DNADNA的
20、复性过程中,摩尔吸光系数减小。的复性过程中,摩尔吸光系数减小。的复性过程中,摩尔吸光系数减小。的复性过程中,摩尔吸光系数减小。第十五张,PPT共二十六页,创作于2022年6月熔解温度(熔解温度(Tm):):DNADNA的的的的双双双双螺螺螺螺旋旋旋旋结结结结构构构构失失失失去去去去一一一一半半半半时时时时对对对对应应应应的的的的温度。温度。温度。温度。浓浓浓浓度度度度50ug/mL50ug/mL时时时时,双双双双链链链链DNADNA A A260260=1.00=1.00;完全变性(单链)完全变性(单链)完全变性(单链)完全变性(单链)A A260260=1.37=1.37 当当当当A A26
21、0260增增增增加加加加到到到到最最最最大大大大增增增增大大大大值值值值一一一一半半半半时时时时,即即即即1.1851.185时,对应的温度即为时,对应的温度即为时,对应的温度即为时,对应的温度即为T Tmm。DNADNA的的的的T Tmm一般在一般在一般在一般在82958295之间之间之间之间第十六张,PPT共二十六页,创作于2022年6月影响影响DNA的的Tm值的因素值的因素1 1、DNADNA均一性均一性均一性均一性:均一性高,变性的温度范围越窄,据此可均一性高,变性的温度范围越窄,据此可均一性高,变性的温度范围越窄,据此可均一性高,变性的温度范围越窄,据此可分析分析分析分析DNADNA
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