12基因工程的基本操作程序(修改)eek.pptx

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1、1.2 1.2 基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序补充：补充：基因的结构基因的结构（1 1）原核生物基因结构）原核生物基因结构编码区编码区非编码区非编码区非编码区非编码区编码区上游编码区上游编码区下游编码区下游编码蛋白质编码蛋白质调控遗传信息的表达调控遗传信息的表达（调控程序）（调控程序）启动子启动子终止子终止子AATGTGCACGTAGTTA.GT.TACACGTGCATCAAT.C编码区编码区非编码区非编码区非编码区非编码区启动子启动子终止子终止子ATGTGCACGTAGTTAATGTGCACGTAGTTATACACGTGCATCAATTACACGTGCATCAATRNARNA聚

2、合酶聚合酶聚合酶聚合酶AUGUGCACGUAGUUAAUGUGCACGUAGUUA 启动子：启动子：位于基因位于基因首端首端一段能与一段能与RNARNA聚合酶聚合酶结合并能起结合并能起始始mRNAmRNA合成的序列。合成的序列。没有启动子，基因就不能转录没有启动子，基因就不能转录。RNARNA聚合酶聚合酶:能够识别能够识别启动子上的结合位点启动子上的结合位点并与其结合并与其结合的一种蛋白质的一种蛋白质.终止子：终止子：位于基因的位于基因的尾端尾端的一段特殊的的一段特殊的DNADNA片断，它片断，它能能阻碍阻碍RNARNA聚合酶的移动聚合酶的移动，并使其从，并使其从DNADNA模板链上脱离模板链

3、上脱离下来，下来，使转录终止使转录终止。不能转录不能转录为信使为信使RNARNA，不能不能 编码编码蛋白质的序列。蛋白质的序列。：能转录能转录相应的信使相应的信使RNARNA，能能 编码编码蛋白质的序列。蛋白质的序列。编码区编码区非编码区非编码区原核原核细胞细胞的的 基因基因结构结构是是调控调控遗传信息表达的核遗传信息表达的核 苷酸序列，在该序列中，苷酸序列，在该序列中，最重要的是最重要的是位于编码区上位于编码区上 游的游的RNARNA聚合酶结合位点聚合酶结合位点。（也就是启动子）（也就是启动子）（2 2）真核细胞的基因结构真核细胞的基因结构编码区编码区非编码区非编码区非编码区非编码区与与RN

4、ARNA聚酶聚酶结合位点结合位点内含子内含子 外显子外显子 能够编码蛋白质的序列叫做外显子能够编码蛋白质的序列叫做外显子 不能够编码蛋白质的序列叫做内含子，不能够编码蛋白质的序列叫做内含子，内含子内含子能转录能转录为信使为信使RNA RNA 启动子启动子终止子终止子编码区上游编码区上游 编码区下游编码区下游 内含子：内含子：外显子：外显子：真核细胞的一个基因的编码区转录出真核细胞的一个基因的编码区转录出前体前体mRNAmRNA，需把其中的需把其中的内含子内含子切除，切除，外显子外显子拼接成拼接成成熟成熟mRNAmRNA。真核真核细胞细胞的的 基因基因结构结构编码区编码区非编码区非编码区外显子：

5、外显子：能编码蛋白质的序列能编码蛋白质的序列内含子：内含子：不能编码蛋白质的序列不能编码蛋白质的序列：有调控作用的核苷酸序列，：有调控作用的核苷酸序列，包括位于编码区上游的包括位于编码区上游的RNARNA 聚合酶结合位点。聚合酶结合位点。非编码序列：非编码序列：包括非编码区和内含子包括非编码区和内含子原核细胞原核细胞真核细胞真核细胞不同点不同点编码区是编码区是_的的编码区是间隔的、编码区是间隔的、_的的相同点相同点都由能够编码蛋白质的都由能够编码蛋白质的_和具和具有调控作用的有调控作用的_区组成的区组成的原核细胞与真核细胞的基因结构比较原核细胞与真核细胞的基因结构比较思思考考编码相同数目氨基酸

6、的蛋白质，原核编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核细胞与真核细胞基因结构一样长吗？细胞与真核细胞基因结构一样长吗？连续连续不连续不连续编码区编码区非编码非编码真核基因长真核基因长1.21.2基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序二二.基因表达载体的构基因表达载体的构建建三、将目的基因导三、将目的基因导入受体细胞入受体细胞四、目的基因的检测四、目的基因的检测与鉴定与鉴定一一.目的基因的获取目的基因的获取基本操作的四个步骤基本操作的四个步骤一、目的基因的获取一、目的基因的获取1 1、目的基因主要是指、目的基因主要是指_编码蛋白质的结构基因编码蛋白质的结构基因2 2、获取目的基因的方法、获取目的基

7、因的方法（1 1）从基因文库中获取）从基因文库中获取（2 2）利用）利用PCRPCR技术扩增技术扩增（3 3）人工合成）人工合成生物抗逆性相关基因、与优良品质相关的基因、与生物生物抗逆性相关基因、与优良品质相关的基因、与生物药物和保健品相关的基因、与毒物降解相关的基因、与药物和保健品相关的基因、与毒物降解相关的基因、与工业用酶相关的基因等工业用酶相关的基因等 将含有某种生物不同基因的许多将含有某种生物不同基因的许多DNADNA片断，片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库这种生物的不同基因，称为基因文库基因文库基因文

8、库 基因组文库基因组文库部分基因文库部分基因文库（如（如:cDNA:cDNA文库）文库）1 1、基因文库基因文库（一）从基因文库中直接获取（一）从基因文库中直接获取一、目的基因的获取一、目的基因的获取限制酶限制酶基因组基因组DNADNA基因重组基因重组转化细菌转化细菌体外包装体外包装1)1)基因组文库基因组文库(Genomic library)(Genomic library)是指将某种生物体的是指将某种生物体的全部基因组全部基因组DNADNA，用用限制性内切酶限制性内切酶或机械力或机械力量量切割切割成一定长度范围的成一定长度范围的DNADNA片片段，再与合适的段，再与合适的载体载体在体外重组

9、在体外重组后，导入后，导入受体菌的群体中储存受体菌的群体中储存，这个群体就称为该生物这个群体就称为该生物基因组文基因组文库库。其目的是分离有用的目的基其目的是分离有用的目的基因和保存某种生物的全部基因。因和保存某种生物的全部基因。cDNA(cDNA(互补互补DNA)DNA)：是用某种生物发育的某个时是用某种生物发育的某个时期的期的mRNAmRNA反转录反转录产生的多种产生的多种互补互补DNADNA（也叫（也叫 cDNAcDNA）片片段段，与，与载体连接载体连接后储存在一后储存在一个受体菌群中，这个受体菌个受体菌群中，这个受体菌群就叫做这种生物的群就叫做这种生物的cDNAcDNA文文库库 2)c

10、DNA2)cDNA文库文库 (cDNA library(cDNA library)基因重组基因重组反转录酶反转录酶mRNAmRNAcDNAcDNA提取某种生物的全部提取某种生物的全部DNADNA一定大小的一定大小的DNADNA片段片段导入受体菌中储存导入受体菌中储存用适当的限制酶切割用适当的限制酶切割将将DNADNA片段与载体连接片段与载体连接基因组文库基因组文库直接分离法直接分离法(鸟枪法鸟枪法)多用于原核生物多用于原核生物2 2、基因组文库的建立方法基因组文库的建立方法某种生物的单链某种生物的单链mRNAmRNA单链互补单链互补DNADNA双链双链cDNAcDNA片段片段导入受体菌中储存导

11、入受体菌中储存与载体连接与载体连接cDNAcDNA文库文库反（逆）转录酶反（逆）转录酶DNADNA聚合酶聚合酶3 3、cDNAcDNA文库的构建文库的构建-反转录法反转录法多用于多用于真核生物真核生物 文库类型文库类型 cDNA文库文库 基因组文库基因组文库 文库大小文库大小基因中启动子（具有启基因中启动子（具有启动作用的动作用的DNADNA片段）片段）基因中内含子基因中内含子(位于编位于编码蛋白质序列的非编码码蛋白质序列的非编码DNADNA片段）片段）基因多少基因多少 物种间的基因交流物种间的基因交流小小大大无无有有无无有有某种生物的部分基因某种生物的部分基因 某种生物的全部基因某种生物的全

12、部基因可以可以部分基因可以部分基因可以基因组文库和部分基因组文库基因组文库和部分基因组文库(cDNA(cDNA文库文库)比较比较基因组基因组文库与文库与部分基部分基因文库因文库的关系的关系怎样从基因文库中得到我们所需的目怎样从基因文库中得到我们所需的目的基因呢的基因呢?依据：目的基因的有关信息。依据：目的基因的有关信息。如：根据基因的核苷酸序列如：根据基因的核苷酸序列 基因的功能基因的功能 基因在染色体上的位置基因在染色体上的位置 基因的转录产物基因的转录产物mRNAmRNA 基因翻译产物蛋白质等特性基因翻译产物蛋白质等特性4 4、从基因文库中得到目的基因的方法从基因文库中得到目的基因的方法寻

13、根问底寻根问底为什么要构建基因文库？直接从含有目的基因的生物为什么要构建基因文库？直接从含有目的基因的生物体内提取不行吗？体内提取不行吗？提示：构建基因文库是获取目的基因的方法之一，并提示：构建基因文库是获取目的基因的方法之一，并不是不是惟一的方式惟一的方式。如果所需要的目的基因。如果所需要的目的基因序列已知序列已知，就可以通过就可以通过PCRPCR方式方式从含有该基因的生物的从含有该基因的生物的DNADNA中，直中，直接获得，也可以通过接获得，也可以通过反转录反转录，用，用PCRPCR方式从方式从mRNAmRNA中获中获得，不一定要构建基因文库。但如果所需要的目的基得，不一定要构建基因文库。

14、但如果所需要的目的基因的因的序列完全不知序列完全不知，或只知道目的基因，或只知道目的基因序列的一段序列的一段，或想从一种生物体内或想从一种生物体内获得许多基因获得许多基因，或者想知道这种，或者想知道这种生物与另一种生物之间生物与另一种生物之间有多少基因不同有多少基因不同，或者想知道，或者想知道一种生物在个体发育的一种生物在个体发育的不同阶段表达的基因有什么不不同阶段表达的基因有什么不同同，或者想得到一种生物的全基因组序列，往往就需，或者想得到一种生物的全基因组序列，往往就需要构建基因文库。要构建基因文库。1818（二）利用（二）利用PCRPCR扩增目的基因扩增目的基因(二二)利用利用PCRPC

15、R技术扩增技术扩增(二二)利用利用PCRPCR技术扩增技术扩增 概念：概念：PCRPCR全称为全称为_，是一项，是一项 在生物在生物_复制复制_的核酸合成技术的核酸合成技术 条件：条件：_、_ _、_(_(做启动子做启动子)、_。原理：原理：_方式：方式：以以_方式扩增，即方式扩增，即_（n n为扩增循为扩增循 环的次数）环的次数）结果：结果：聚合酶链式反应聚合酶链式反应体外体外特定特定DNADNA片段片段DNADNA复制复制已知基因的核苷酸序列已知基因的核苷酸序列四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸一对引物一对引物热稳定热稳定DNADNA聚合酶（聚合酶（TaqTaq酶）酶）指数指数2 2n n使目的

16、基因的片段在短时间内成百万倍地扩增使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增前提条件前提条件过程：过程：a a、DNADNA变性变性（90-9690-96）：双链）：双链DNADNA模板模板 在热作用下，在热作用下，_断裂，形成断裂，形成_b b、退火、退火（复性（复性5 55-655-65）：系统温度降低，）：系统温度降低，引引 物物与与DNADNA模板结合，形成局部模板结合，形成局部_。c c、延伸、延伸（70-7570-75）：在）：在DNADNA聚合聚合酶的作用下，酶的作用下，从引物的从引物的55端端33端端延伸，合成与模板互补延伸，合成与模板互补的的_。氢键氢键单链单链DNADNA双链

17、双链DNADNA链链DNADNA合成方向总是从子链的合成方向总是从子链的55端端33端端延伸延伸PCR技术扩增与技术扩增与DNA复制的比较复制的比较PCR技术技术DNA复制复制相相同同点点原理原理原料原料条件条件不不同同点点解旋解旋方式方式场所场所酶酶结果结果碱基互补配对碱基互补配对四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸模板、能量、酶模板、能量、酶DNADNA在高温下变性解旋在高温下变性解旋解旋酶催化解旋酶催化体外复制体外复制细胞核内细胞核内热稳定热稳定DNADNA聚合酶聚合酶细胞内的细胞内的DNADNA聚合酶聚合酶大量的大量的DNADNA片段片段形成整个形成整个DNADNA分子分子（三）（三）、人工合

18、成法：、人工合成法：基因基因较小较小，核苷酸，核苷酸序列已知序列已知，可以，可以利用利用DNADNA合成仪合成仪人工合成人工合成反反转录法转录法目的基因的信使目的基因的信使RNARNA目的基因目的基因化学合成法化学合成法肽链氨基酸序列肽链氨基酸序列信使信使RNARNA序列序列基因的核苷酸序列基因的核苷酸序列目的基因目的基因合成合成逆转录逆转录人工合成法人工合成法推测推测推测推测单链单链DNADNA合成合成1 1、下列属于获取目的基因的方法的是、下列属于获取目的基因的方法的是()()利用利用mRNAmRNA反转录形成反转录形成从基因组文库中提取从基因组文库中提取从受体细胞中提取从受体细胞中提取

19、利用利用PCRPCR技术技术 利用利用DNADNA转录转录 人工合成人工合成A.B.C.D.A.B.C.D.2 2、有关基因工程的叙述正确的是、有关基因工程的叙述正确的是 （）A A、限制酶只在获得目的基因时才用、限制酶只在获得目的基因时才用 B B、重组质粒的形成在细胞内完成、重组质粒的形成在细胞内完成 C C、质粒都可作为运载体、质粒都可作为运载体 D D、蛋白质的结构可为合成目的基因提供资料、蛋白质的结构可为合成目的基因提供资料D1 1.作用作用：二二.基因表达载体的构建基因表达载体的构建核心核心IMNIMN2 2.组成组成：使目的基因在受体细胞中稳定存在使目的基因在受体细胞中稳定存在并

20、遗传给子代并遗传给子代。同时使目的基因能表达和发挥作用。同时使目的基因能表达和发挥作用。(3)(3)终止子：终止子：(4)(4)标记基因：标记基因：(2)(2)启动子：启动子：(1)(1)目的基因。目的基因。（5 5）复制原点：）复制原点：不同受体细胞，目的基因导入受体细胞的方法不不同受体细胞，目的基因导入受体细胞的方法不同，基因表达载体的构建有所差异。同，基因表达载体的构建有所差异。是是RNARNA聚合酶识别和结合部位。聚合酶识别和结合部位。是使转录在需要的地方停止。是使转录在需要的地方停止。是鉴别受体细胞中是否含有目的基因是鉴别受体细胞中是否含有目的基因从而将含有目的基因的细胞筛选出来。从

21、而将含有目的基因的细胞筛选出来。是复制的起点。是复制的起点。载体载体与与表达载体表达载体的区别：二者都有标记基因的区别：二者都有标记基因和复制原点两部分和复制原点两部分DNADNA片段。片段。表达载体在载体表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构分结构用到的工具酶：用到的工具酶：既用到限制酶切割载体，又既用到限制酶切割载体，又用到用到DNADNA连接酶将目的基因和载体拼接，两种连接酶将目的基因和载体拼接，两种酶作用的化学键都是磷酸二酯键酶作用的化学键都是磷酸二酯键启动子、终止子启动子、终止子对于目的基因表达必不可少对于目的基因表达必不

22、可少目的基因不能单独进入受体细胞，目的基因不能单独进入受体细胞，必需以表必需以表达载体的方式携带进去。达载体的方式携带进去。注意注意寻根问底：将目的基因直接导入受体细胞不是更简便吗寻根问底：将目的基因直接导入受体细胞不是更简便吗？如果这么做，结果会怎样？如果这么做，结果会怎样？提示：有人采用总提示：有人采用总DNADNA注射法进行遗传转化，即将一个注射法进行遗传转化，即将一个生物中的总生物中的总DNADNA提取出来，通过注射或花粉管通道法导提取出来，通过注射或花粉管通道法导入受体植物，没有进行表达载体的构建，这种方法针对入受体植物，没有进行表达载体的构建，这种方法针对性差，完全靠运气，也无法确

23、定什么基因导入了受体植性差，完全靠运气，也无法确定什么基因导入了受体植物。此法目前争议颇多，物。此法目前争议颇多，严格来讲不算基因工程严格来讲不算基因工程。思考与探究：思考与探究：1.1.作为基因工程表达载体，只需含有目作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？为什么？的基因就可以完成任务吗？为什么？不可以。因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用，还需不可以。因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用，还需要有其他控制元件，如启动子、终止子和标记基因等。必须构建要有其他控制元件，如启动子、终止子和标记基因等。必须构建上述元件的主要理由是：上述元件的主要理由是：（1 1）生物之

24、间进行基因交流，只有使用受体生物自身基因的启生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身基因的启动子才能比较有利于基因的表达；动子才能比较有利于基因的表达；（2 2）通过通过cDNAcDNA文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入受体生物中无法转录；导入受体生物中无法转录；（3 3 3 3）目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记；目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记；目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记；目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记；（4 4 4 4）为了增强目的基因的表达水平，往往还要增加一些其他调为了增强目的基因的表达水平

25、，往往还要增加一些其他调为了增强目的基因的表达水平，往往还要增加一些其他调为了增强目的基因的表达水平，往往还要增加一些其他调控元件，如增强子等；控元件，如增强子等；控元件，如增强子等；控元件，如增强子等；（5 5 5 5）有时需要确定目的基因表达的产物存在于细胞的什么部位，有时需要确定目的基因表达的产物存在于细胞的什么部位，有时需要确定目的基因表达的产物存在于细胞的什么部位，有时需要确定目的基因表达的产物存在于细胞的什么部位，往往要加上可以标识存在部位的基因（或做成目的基因与标识基往往要加上可以标识存在部位的基因（或做成目的基因与标识基往往要加上可以标识存在部位的基因（或做成目的基因与标识基往

26、往要加上可以标识存在部位的基因（或做成目的基因与标识基因的融合基因），如绿色荧光蛋白基因等。因的融合基因），如绿色荧光蛋白基因等。因的融合基因），如绿色荧光蛋白基因等。因的融合基因），如绿色荧光蛋白基因等。3 3、将目的基因导入受体细胞、将目的基因导入受体细胞转化转化 方法方法将目的基因导入将目的基因导入植物细胞植物细胞将目的基因导入将目的基因导入动物细胞动物细胞将目的基因导入将目的基因导入微生物细胞微生物细胞农杆菌转化法农杆菌转化法基因枪法基因枪法花粉管通道法花粉管通道法显微注射法显微注射法感受态细胞法感受态细胞法目的基因进入目的基因进入_内，并且在受体细内，并且在受体细胞内维持胞内维持_和

27、和_的过程的过程受体细胞受体细胞稳定稳定表达表达常用的受体细胞：常用的受体细胞：有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。和动植物细胞等。1 1、将目的基因导入植物细胞的方法：、将目的基因导入植物细胞的方法：（1 1）农杆菌转化法）农杆菌转化法 农杆菌特点：农杆菌特点：易感染双子叶植物和裸子植物，对大多易感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力数单子叶植物没有感染能力原理：原理：TiTi质粒上质粒上的的T-DNAT-DNA可以转移可以转移到受体细胞，并到受体细胞，并整合到受体细胞染色整合到受体细胞染色体的体的DNADNA上上

28、。双子叶植物双子叶植物、祼子植物祼子植物适用生物适用生物?目的基因目的基因TiTi质粒上的质粒上的 T TDNADNA插入插入植物细胞植物细胞农杆菌农杆菌染色体染色体DNADNA上上维持稳定维持稳定和表达和表达并整并整合到合到导入导入感染感染同时同时T-DNAT-DNA导入导入过程：过程：优点优点：比较经济和有效比较经济和有效思考与探究思考与探究：2.2.根据农杆菌可将目的基因导入双根据农杆菌可将目的基因导入双子叶植物的机理子叶植物的机理,你能分析出不能导入单子叶植物你能分析出不能导入单子叶植物的原因吗的原因吗?若将一个抗病基因导入小麦中若将一个抗病基因导入小麦中,理论上理论上讲你应该怎样做讲

29、你应该怎样做?要选择合适的农杆菌菌株，因为不是所有的农杆菌要选择合适的农杆菌菌株，因为不是所有的农杆菌菌株都可以侵染单子叶植物；菌株都可以侵染单子叶植物；要加趋化和诱导的物质，一般为乙酰丁香酮等，目要加趋化和诱导的物质，一般为乙酰丁香酮等，目的是使农杆菌向植物组织的受伤部位靠拢（趋化性）的是使农杆菌向植物组织的受伤部位靠拢（趋化性）和激活农杆菌的和激活农杆菌的VirVir区（诱导）的基因，使区（诱导）的基因，使T-DNAT-DNA转移转移并插入到染色体并插入到染色体DNADNA上。上。3737（2 2）基因枪法：基因枪法：利用压缩气体产生的动利用压缩气体产生的动力力 ，将包裹在金属粒表，将包裹

30、在金属粒表面的表达载体面的表达载体DNADNA打入受打入受体细胞中，使目的基因体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法与其整合并表达的方法操作方法：操作方法：金属粒：金属粒：将目的基因导入单子叶植物细胞将目的基因导入单子叶植物细胞 钨粉粒子和金粉粒子，钨粉粒子和金粉粒子，粒子的直径一般在粒子的直径一般在0.60.64um 4um。适用：单子叶植物适用：单子叶植物缺点：缺点：成本较高成本较高（3 3）花粉管通道法：花粉管通道法：将目的基因导入植物细胞将目的基因导入植物细胞操作方法：操作方法：特点：特点：在植物受粉后，花粉形成花粉在植物受粉后，花粉形成花粉管还末愈合前期，剪去柱头，然后管还末愈合前

31、期，剪去柱头，然后，滴入，滴入DNADNA（含目的基因）使目的基因（含目的基因）使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞借助花粉管通道进入受体细胞十分简便经济十分简便经济例：例：转基因抗虫棉转基因抗虫棉2.2.将目的基因导入动物细胞将目的基因导入动物细胞显微注射技术显微注射技术提纯含目的基提纯含目的基因的表达载体因的表达载体取出受精卵取出受精卵显显微微注注射射受精卵移植入受精卵移植入输卵管或子宫输卵管或子宫发育成具新性状的动物发育成具新性状的动物方法：方法：程序：程序：培养成早期胚胎培养成早期胚胎原核生物特点：原核生物特点：繁殖快、多为单细胞、遗传物质相繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少，故早期

32、常作为受体细胞。对较少，故早期常作为受体细胞。大肠杆菌细胞大肠杆菌细胞感受态细胞感受态细胞用用CaCa2+2+处理处理重组表达载体重组表达载体DNA溶于缓冲液溶于缓冲液混合混合转入转入方法：方法：常用菌：常用菌：大肠杆菌大肠杆菌3.3.将目的基因导入微生物细胞将目的基因导入微生物细胞通过标记基因，进行筛选和检测通过标记基因，进行筛选和检测导入过程完成后，全部受体细胞都能摄入导入过程完成后，全部受体细胞都能摄入重组重组DNADNA分子吗？分子吗？真正能摄入重组真正能摄入重组DNADNA分子的受体细胞很少。分子的受体细胞很少。所以要对受体细胞作怎样的处理？所以要对受体细胞作怎样的处理？对受体细胞中

33、是否导入了目的基因进行检测对受体细胞中是否导入了目的基因进行检测怎样进行检测？怎样进行检测？4 4、目的基因的检测与鉴定、目的基因的检测与鉴定检查是否成功检查是否成功检测检测鉴定鉴定检测转基因生物检测转基因生物染色体的染色体的DNA DNA 上是否插入了目的基因上是否插入了目的基因检测目的基因检测目的基因是否转录出了是否转录出了mRNAmRNA检测目的基因检测目的基因是否翻译成蛋白质是否翻译成蛋白质抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等方法方法方法方法方法方法DNADNA分子杂交分子杂交分子杂交分子杂交抗原抗体杂交抗原抗体杂交DNADNA分子杂交示意图分子杂交示意图 采用

34、一定的技术手段，将两种生物的采用一定的技术手段，将两种生物的DNADNA分分子的单链放在一起，如果这两个单链具有互补子的单链放在一起，如果这两个单链具有互补的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合在一起，形成杂合双链区；在没有互补碱基序在一起，形成杂合双链区；在没有互补碱基序列的部位，仍然是两条游离的单链。列的部位，仍然是两条游离的单链。碱基互补配对碱基互补配对原理：原理：1 1.检测检测转基因生转基因生物的物的DNADNA探针探针15N N15N N14N N14N N（1 1）检测转基因生物染色体的）检测转基因生物染色体的DNADNA上是否插入了目上

35、是否插入了目的基因的基因基因探针：基因探针：放射性同位素等标记含有目的基因的放射性同位素等标记含有目的基因的DNADNA片段片段方法方法DNADNA分子杂交技术分子杂交技术方法方法 分子杂交技术分子杂交技术（2 2）检测目的基因）检测目的基因是否转录出了是否转录出了mRNAmRNA探针探针15N N15N N转基因生物转基因生物的的mRNAmRNA14N N提取提取（3 3）检测目的基因是否翻译成蛋白质）检测目的基因是否翻译成蛋白质方法方法苏云金杆菌苏云金杆菌BtBt毒素蛋白毒素蛋白将将BtBt毒蛋白注毒蛋白注射小鼠体内射小鼠体内从小鼠血管抽出从小鼠血管抽出血液分离出抗血液分离出抗BtBt毒素

36、的抗体毒素的抗体抗体抗体Bt毒素蛋毒素蛋白（抗原）白（抗原）出现出现杂交带杂交带脱分化脱分化组织培养组织培养证明：证明：提取蛋白质与提取蛋白质与BtBt毒素蛋白质一样毒素蛋白质一样抗原抗原-抗体杂交抗体杂交例：用棉铃饲喂棉例：用棉铃饲喂棉铃虫，如虫吃后不出现铃虫，如虫吃后不出现中毒症状，说明未摄入中毒症状，说明未摄入目的基因或摄入目的基目的基因或摄入目的基因未表达。如虫吃后中因未表达。如虫吃后中毒死亡，则说明摄入了毒死亡，则说明摄入了抗虫基因并得到表达。抗虫基因并得到表达。2 2.鉴定鉴定个体生物学水平的鉴定个体生物学水平的鉴定（1 1）多细胞个体）多细胞个体抗虫、抗病结种实验，活性比较实验抗

37、虫、抗病结种实验，活性比较实验 不能，受体细胞必须表现出特定的性状，才能不能，受体细胞必须表现出特定的性状，才能说明目的基因完成了说明目的基因完成了表达。表达。受体细胞摄入受体细胞摄入DNADNA分子后就说明目的基因分子后就说明目的基因 完成了表达吗？完成了表达吗？若不能表达，若不能表达，要对抗虫基因要对抗虫基因再进行再进行修饰修饰。无表达产物无表达产物无表达产物无表达产物有表达产物有表达产物无表达产物无表达产物细菌的检测，将细菌的检测，将每个每个受体细胞单独培养受体细胞单独培养形成菌落形成菌落，检测菌落中是否有目的基因的表达产物。淘汰无表达产检测菌落中是否有目的基因的表达产物。淘汰无表达产物

38、的菌落，保留有表达产物的进一步培养、研究。物的菌落，保留有表达产物的进一步培养、研究。（2 2）单细胞生物）单细胞生物3.3.利用大肠杆菌可以生产出人的胰岛素，联系前面有关利用大肠杆菌可以生产出人的胰岛素，联系前面有关细胞器功能的知识，结合基因工程操作程序的基本思路，细胞器功能的知识，结合基因工程操作程序的基本思路，思考一下，若要生产人的糖蛋白，可以用大肠杆菌吗？思考一下，若要生产人的糖蛋白，可以用大肠杆菌吗？有些蛋白质肽链上有共价结合的糖链，这些糖链是有些蛋白质肽链上有共价结合的糖链，这些糖链是在内质网和高尔基复合体上加工完成的，内质网和在内质网和高尔基复合体上加工完成的，内质网和高尔基复合

39、体存在于真核细胞中，大肠杆菌不存在高尔基复合体存在于真核细胞中，大肠杆菌不存在这两种细胞器，因此，在大肠杆菌中生产这种糖蛋这两种细胞器，因此，在大肠杆菌中生产这种糖蛋白是不可能的。白是不可能的。思考与探究：思考与探究：5353（1 1 1 1）从小鼠中克隆出）从小鼠中克隆出）从小鼠中克隆出）从小鼠中克隆出-珠蛋白基因的编码序列（珠蛋白基因的编码序列（珠蛋白基因的编码序列（珠蛋白基因的编码序列（cDNAcDNAcDNAcDNA）（2 2 2 2）将）将）将）将cDNAcDNAcDNAcDNA前接上在大肠杆菌中可以适用的启动子前接上在大肠杆菌中可以适用的启动子前接上在大肠杆菌中可以适用的启动子前接

40、上在大肠杆菌中可以适用的启动子和和和和终终终终止子止子止子止子，另外加上抗四环素的基因，构建成一个表达载体。，另外加上抗四环素的基因，构建成一个表达载体。，另外加上抗四环素的基因，构建成一个表达载体。，另外加上抗四环素的基因，构建成一个表达载体。（3 3 3 3）将表达载体导入无四环素抗性的大肠杆菌中，然后）将表达载体导入无四环素抗性的大肠杆菌中，然后）将表达载体导入无四环素抗性的大肠杆菌中，然后）将表达载体导入无四环素抗性的大肠杆菌中，然后在含有四环素的培养基上培养大肠杆菌。如果表达载体未在含有四环素的培养基上培养大肠杆菌。如果表达载体未在含有四环素的培养基上培养大肠杆菌。如果表达载体未在含

41、有四环素的培养基上培养大肠杆菌。如果表达载体未进入大肠杆菌中，大肠杆菌会因不含有抗四环素基因而死进入大肠杆菌中，大肠杆菌会因不含有抗四环素基因而死进入大肠杆菌中，大肠杆菌会因不含有抗四环素基因而死进入大肠杆菌中，大肠杆菌会因不含有抗四环素基因而死掉；如果培养基上长出大肠杆菌菌落，则表明掉；如果培养基上长出大肠杆菌菌落，则表明掉；如果培养基上长出大肠杆菌菌落，则表明掉；如果培养基上长出大肠杆菌菌落，则表明-珠蛋白珠蛋白珠蛋白珠蛋白基因已进入其中。基因已进入其中。基因已进入其中。基因已进入其中。（4 4 4 4）培养进入了）培养进入了）培养进入了）培养进入了-珠蛋白基因的大肠杆菌，收集菌体，珠蛋白

42、基因的大肠杆菌，收集菌体，珠蛋白基因的大肠杆菌，收集菌体，珠蛋白基因的大肠杆菌，收集菌体，破碎后从中提取破碎后从中提取破碎后从中提取破碎后从中提取-珠蛋白。珠蛋白。珠蛋白。珠蛋白。4 4.-.-珠蛋白是动物血红蛋白的重要组成成分。当它的珠蛋白是动物血红蛋白的重要组成成分。当它的成分异常时，动物有可能患某种疾病，如镰刀形细胞成分异常时，动物有可能患某种疾病，如镰刀形细胞贫血症。假如让你用基因工程的方法，使大肠杆菌生贫血症。假如让你用基因工程的方法，使大肠杆菌生产出鼠的产出鼠的-珠蛋白，想一想，应如何进行设计？珠蛋白，想一想，应如何进行设计？54541）以下说法正确的是）以下说法正确的是 （）A、

43、所所有有的的限限制制酶酶只只能能识识别别一一种种特特定定的的核核苷苷酸序列酸序列 B、质粒是基因工程中唯一的运载体、质粒是基因工程中唯一的运载体 C、运运载载体体必必须须具具备备的的条条件件之之一一是是：具具有有多多个限制酶切点，以便与外源基因连接个限制酶切点，以便与外源基因连接 D、基因控制的性状都能在后代表现出来、基因控制的性状都能在后代表现出来C C练习练习2）不属于质粒被选为基因运载体的理由是）不属于质粒被选为基因运载体的理由是 A、能复制、能复制 （）B、有多个限制酶切点、有多个限制酶切点 C、具有标记基因、具有标记基因 D、它是环状、它是环状DNAD D练习练习3）有关基因工程的叙

44、述中，错误的是（）有关基因工程的叙述中，错误的是（）A、DNA连接酶将黏性末端的碱基对连接起来连接酶将黏性末端的碱基对连接起来 B、限制性内切酶用于目的基因的获得限制性内切酶用于目的基因的获得 C、目的基因须由运载体导入受体细胞、目的基因须由运载体导入受体细胞 D、人工合成目的基因不用限制性内切酶人工合成目的基因不用限制性内切酶A A练习练习4）有关基因工程的叙述中，错误的是（）有关基因工程的叙述中，错误的是（）A、DNA连接酶将黏性末端的碱基对连接起来连接酶将黏性末端的碱基对连接起来 B、限制性内切酶用于目的基因的获得限制性内切酶用于目的基因的获得 C、目的基因须由运载体导入受体细胞、目的基因须由运载体导入受体细胞 D、人工合成目的基因不用限制性内切酶人工合成目的基因不用限制性内切酶A A练习练习5）基基因因工工程程是是在在DNA分分子子水水平平上上进进行行设设计计施施工工的的。在在基基因因操操作作的的基基本本步步骤骤中中，不不进进行行碱基互补配对的步骤是碱基互补配对的步骤是 （）A、人工合成目的基因、人工合成目的基因 B、目的基因与运载体结合、目的基因与运载体结合 C、将目的基因导入受体细胞、将目的基因导入受体细胞 D、目的基因的检测和表达、目的基因的检测和表达C C练习练习演讲完毕，谢谢观看！