12基因工程的基本操作程序zleer.pptx

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1、 1.2 1.2 基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序 v目的基因的获取目的基因的获取目的基因的获取目的基因的获取v基因表达载体的构建基因表达载体的构建基因表达载体的构建基因表达载体的构建v将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞v目的基因的检测与鉴定目的基因的检测与鉴定目的基因的检测与鉴定目的基因的检测与鉴定一、目的基因的获取一、目的基因的获取1 1、目的基因主要是指、目的基因主要是指_编码蛋白质的结构基因编码蛋白质的结构基因例子例子?2 2、获取目的基因的常用方法有哪些、获取目的基因的常用方法有哪些?（1 1）从）从基因文库基因文库中

2、获取中获取（2 2）利用）利用PCRPCR技术扩增技术扩增（3 3）人工合成）人工合成(一一)从基因文库中获取目的基因从基因文库中获取目的基因1.1.什么是基因文库？种类？如何构建？什么是基因文库？种类？如何构建？一、目的基因的获取一、目的基因的获取基因组文库基因组文库cDNAcDNA文库文库含有一种生物含有一种生物的的全部全部基因基因含有一含有一种生物种生物的的部分部分基因基因种类：种类：基因组文库基因组文库cDNAcDNA文库文库基因组基因组DNADNA文库文库cDNAcDNA文库文库基因组基因组DNADNA文库与文库与cDNAcDNA文库的比较文库的比较非编码区非编码区非编码区非编码区编

3、码区编码区编码区上游编码区上游 编码区下游编码区下游 启动子启动子终止子终止子与与RNARNA聚合酶结合位点聚合酶结合位点：编码蛋白质：编码蛋白质,连续不间断连续不间断编码区编码区非编码区非编码区原核原核细胞细胞 基因基因结构结构不编码蛋白质。不编码蛋白质。调控遗传信息表达调控遗传信息表达,上游有启动上游有启动 子，下游有终止子子，下游有终止子真核真核细胞细胞 基因基因结构结构编码区编码区非编码区非编码区外显子：能编码蛋白质的序列外显子：能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列：调控，上游有启动子，下游有终止子：调控，上游有启动子，下游有终止子非编码序列：非编

4、码序列：包括非编码区和内含子包括非编码区和内含子编码区编码区非编码区非编码区非编码区非编码区与与RNA聚合聚合酶结合位点酶结合位点内含子内含子 外显子外显子 启动子启动子终止子终止子编码区上游编码区上游 编码区下游编码区下游 原核细胞原核细胞真核细胞真核细胞不同点不同点编码区是编码区是_的的编码区是间隔的、编码区是间隔的、_的的相同点相同点都由能够编码蛋白质的都由能够编码蛋白质的_和具和具有调控作用的有调控作用的_区组成的区组成的原核细胞与真核细胞的基因结构比较原核细胞与真核细胞的基因结构比较连续连续不连续不连续编码区编码区非编码非编码(一一)从基因文库中获取目的基因从基因文库中获取目的基因1

5、.1.什么是基因文库？种类？如何构建？什么是基因文库？种类？如何构建？2.2.怎样从基因文库中得到我们所需的目的基因？怎样从基因文库中得到我们所需的目的基因？一、目的基因的获取一、目的基因的获取依据：目的基因的有关信息。依据：目的基因的有关信息。如：如：根据基因的核苷酸序列根据基因的核苷酸序列 基因的功能基因的功能 基因在染色体上的位置基因在染色体上的位置 基因的转录产物基因的转录产物mRNAmRNA 基因翻译产物蛋白质基因翻译产物蛋白质等特性。等特性。1 1有关目的基因的获取和基因文库的理解，不正确的是有关目的基因的获取和基因文库的理解，不正确的是()A A目的基因可以从自然界中分离，也可以

6、人工合成目的基因可以从自然界中分离，也可以人工合成B B目的基因主要指编码蛋白质的结构基因目的基因主要指编码蛋白质的结构基因C C基因文库就是基因组文库基因文库就是基因组文库D DcDNAcDNA文库只含有某种生物的一部分基因文库只含有某种生物的一部分基因2 2下列属于获取目的基因方法的是下列属于获取目的基因方法的是利用利用mRNAmRNA反转录形成反转录形成从基因文库中获取从基因文库中获取从受体细胞中提取从受体细胞中提取 利用利用PCRPCR技术扩增技术扩增利用利用DNADNA转录转录 人工合成人工合成A A B BC C D DDC(二）利用二）利用PCRPCR技术扩增目的基因技术扩增目的

7、基因PCRPCR技术技术多聚酶链式反应多聚酶链式反应原理：原理：前提：前提：条件：条件：DNADNA双链复制双链复制一段已知目的基因的核苷酸序列一段已知目的基因的核苷酸序列四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸一对引物一对引物热稳定热稳定DNADNA聚合酶聚合酶(Taq(Taq酶）酶）DNADNA的两条链为模板的两条链为模板温度控制温度控制一、目的基因的获取一、目的基因的获取复习：复习：1 1、目的基因？例子、目的基因？例子?2 2、获取目的基因的常用方法有哪些、获取目的基因的常用方法有哪些?3 3、什么是基因文库？种类？、什么是基因文库？种类？5 5、原核细胞与真核细胞的基因结构？、原核细胞与真核细胞

8、的基因结构？6 6、怎样从基因文库中得到我们所需的目的基因？、怎样从基因文库中得到我们所需的目的基因？4 4、基因组文库？、基因组文库？cDNA cDNA文库？文库？变性：变性：加热至加热至90909595双链双链DNADNA解链成解链成为单链为单链DNADNA退火：退火：冷却至冷却至55556060部分引物与模部分引物与模板的单链板的单链DNADNA的特定的特定互补部位相配对和互补部位相配对和结合结合延伸：延伸：加热至加热至70707575以目的基因为以目的基因为模板，合成互补的模板，合成互补的新新DNADNA链链退火退火变性变性延伸延伸(二）利用二）利用PCRPCR技术扩增目的基因技术扩增

9、目的基因(三三)通过通过DNADNA合成仪用化学的方法直接人工合成合成仪用化学的方法直接人工合成一、目的基因的获取一、目的基因的获取蛋白质的氨基酸序列蛋白质的氨基酸序列mRNAmRNA的核苷酸序列的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列推测推测推测推测目的基因目的基因化学合成化学合成根据已知的氨基酸序列合成根据已知的氨基酸序列合成DNADNA法：法：1 1、在已知序列信息的情况下，获取目的基因的最、在已知序列信息的情况下，获取目的基因的最方便方法是方便方法是A A、化学合成法、化学合成法 B B、基因组文库法、基因组文库法C C、cDNAcDNA文库法文库法 D D、多聚酶链式反应

10、、多聚酶链式反应2 2、下列获取目的基因的方法中需要模板链的是、下列获取目的基因的方法中需要模板链的是从基因文库中获取目的基因从基因文库中获取目的基因 利用利用PCRPCR技技术扩增目的基因术扩增目的基因 反转录法反转录法 通过通过DNADNA合成仪合成仪利用化学方法人工合成利用化学方法人工合成A A B B C C D DA AD D 3.3.下表关于基因工程中有关基因操作的名词及对应下表关于基因工程中有关基因操作的名词及对应 的内容，正确的组合是的内容，正确的组合是C4 4、在基因工程中，把选出的目的基因（共、在基因工程中，把选出的目的基因（共10001000个脱氧个脱氧核苷酸对，其中腺嘌

11、呤脱氧核苷酸是核苷酸对，其中腺嘌呤脱氧核苷酸是460460个）放入个）放入DNADNA扩扩增仪中扩增增仪中扩增4 4代，那么，在扩增仪中应放入胞嘧啶脱氧核代，那么，在扩增仪中应放入胞嘧啶脱氧核苷酸的个数是苷酸的个数是A.540A.540个个 B.8100 B.8100个个 C.17280 C.17280个个 D.7560 D.7560个个B B5 5、目的基因主要是指、目的基因主要是指_的结构基因。获的结构基因。获得目的基因的常见方法有三种：（得目的基因的常见方法有三种：（1 1）从基因文库中获）从基因文库中获取目的基因，根据基因的取目的基因，根据基因的_序列，基因在序列，基因在_上的位置，基

12、因的上的位置，基因的_产物产物mRNAmRNA，基因的，基因的_产物蛋白质等获取目的基因。（产物蛋白质等获取目的基因。（2 2）利用）利用PCRPCR技技术扩增目的基因，该技术是一项在术扩增目的基因，该技术是一项在_完成的核酸完成的核酸合成技术，前提条件是有一段已知目的基因的合成技术，前提条件是有一段已知目的基因的_序列，以便于合成序列，以便于合成_。（。（3 3）如果基因较小且核）如果基因较小且核苷酸序列已知，可以通过苷酸序列已知，可以通过_方法。方法。编码蛋白质编码蛋白质核苷酸核苷酸染色体染色体转录转录表达表达体外体外核苷酸核苷酸引物引物人工合成人工合成二、基因表达载体的构建二、基因表达载

13、体的构建（核心）（核心）(1)(1)用一定的用一定的_切割切割 质粒，使其出现一个切质粒，使其出现一个切 口，露出口，露出_。(2)(2)用用_切断目切断目 的基因，使其产生的基因，使其产生_ _ _。(3)(3)将切下的目的基因片段插入质粒的将切下的目的基因片段插入质粒的_处，处，再加入适量再加入适量_，形成了一个重组，形成了一个重组 DNA DNA分子（重组质粒）分子（重组质粒）限制酶限制酶黏性末端黏性末端同一种限制酶同一种限制酶的黏性末端的黏性末端切口切口DNADNA连接酶连接酶相同相同1 1、目的：、目的：2 2、过程：、过程：基因表达载体的组成：基因表达载体的组成：a、目的基因目的基

14、因b、启动子启动子c、终止子终止子d、标记基因标记基因2 2、下列关于基因表达载体的叙述不正确的是、下列关于基因表达载体的叙述不正确的是A A基因表达载体的构建视受体细胞及导入方式不同而有基因表达载体的构建视受体细胞及导入方式不同而有所差别所差别B B启动子和终止子都是特殊结构的启动子和终止子都是特殊结构的DNADNA短片段，对短片段，对mRNAmRNA的的转录起调控作用转录起调控作用C C标记基因是为了鉴别受体细胞中是否有目的基因从而标记基因是为了鉴别受体细胞中是否有目的基因从而便于筛选便于筛选D D启动子是与启动子是与RNARNA聚合酶识别和结合的部位，是起始密码聚合酶识别和结合的部位，是

15、起始密码D1 1、（多选）一个基因表达载体的构建应包括、（多选）一个基因表达载体的构建应包括A A目的基因目的基因 B B启动子启动子 C C终止子终止子 D D标记基因标记基因ABCD三、将目的基因导入受体细胞三、将目的基因导入受体细胞转化转化 方法方法将目的基因导入将目的基因导入植物细胞植物细胞将目的基因导入将目的基因导入动物细胞动物细胞将目的基因导入将目的基因导入微生物细胞微生物细胞农杆菌转化法农杆菌转化法基因枪法基因枪法花粉管通道法花粉管通道法显微注射法显微注射法感受态细胞感受态细胞目的基因进入目的基因进入_内，并且在受体细内，并且在受体细胞内维持胞内维持_和和_的过程的过程受体细胞受

16、体细胞稳定稳定表达表达1 1、基因工程中科学家常用细菌、酵母菌等微生物作、基因工程中科学家常用细菌、酵母菌等微生物作为受体细胞，原因是为受体细胞，原因是 A A结构简单、操作方便结构简单、操作方便 B B繁殖速度快繁殖速度快 C C遗传物质含量少、简单遗传物质含量少、简单 D D性状稳定、变异少性状稳定、变异少2 2、基因工程常用的受体细胞有、基因工程常用的受体细胞有 大肠杆菌大肠杆菌 枯草杆菌枯草杆菌 支原体支原体 动植物细胞动植物细胞A A B B C C D DB BD D3.3.采用基因工程的方法培育抗虫棉，下列导入目的基因采用基因工程的方法培育抗虫棉，下列导入目的基因的做法正确的是的

17、做法正确的是将毒素蛋白质注射到棉受精卵中将毒素蛋白质注射到棉受精卵中 将编码毒素蛋白将编码毒素蛋白的的DNADNA序列注射到棉受精卵中序列注射到棉受精卵中 将编码毒素蛋白的将编码毒素蛋白的DNADNA序列与细菌质粒重组，注射到棉的子房并进入受精卵中序列与细菌质粒重组，注射到棉的子房并进入受精卵中 将编码毒素蛋白的将编码毒素蛋白的DNADNA序列与质粒重组，导入细菌感染序列与质粒重组，导入细菌感染棉的体细胞，再进行组织培养棉的体细胞，再进行组织培养A A B B C C D DC C4.4.下列属于基因工程中导入目的基因方法的是下列属于基因工程中导入目的基因方法的是农杆菌转化法农杆菌转化法 基因

18、枪法基因枪法 花粉管道法花粉管道法 显微显微注射法注射法 胚胎移植胚胎移植 DNA DNA分子杂交法分子杂交法A A B BC C D DC C四、目的基因的检测与鉴定四、目的基因的检测与鉴定检测检测鉴定鉴定是否插入了目的基因是否插入了目的基因是否转录出了是否转录出了mRNAmRNA是否翻译成蛋白质是否翻译成蛋白质抗虫鉴定、抗病鉴定抗虫鉴定、抗病鉴定活性鉴定等活性鉴定等方法方法方法方法方法方法DNADNA分子杂交分子杂交mRNAmRNA与与DNADNA分子杂交分子杂交抗原抗原-抗体杂交抗体杂交个体生物学水平的鉴定个体生物学水平的鉴定知识延伸知识延伸DNADNA分子杂交技术分子杂交技术标记标记待

19、检测待检测1.1.比较载体与基因表达载体的区别。比较载体与基因表达载体的区别。2.2.切割切割DNADNA获取目的基因和切割载体时一般情况下为什么获取目的基因和切割载体时一般情况下为什么 要选用同一种限制性核酸内切酶？经过重组过程后会形要选用同一种限制性核酸内切酶？经过重组过程后会形 成几种成几种DNADNA分子？分子？3.3.分析为什么动物的受体细胞不能为体细胞？分析为什么动物的受体细胞不能为体细胞？4.4.讨论大肠杆菌细胞转化时为什么要用讨论大肠杆菌细胞转化时为什么要用Ca2+Ca2+处理细胞。处理细胞。5.5.目的基因进入受体细胞内并在受体细胞内稳定保存的实目的基因进入受体细胞内并在受体

20、细胞内稳定保存的实 质是什么？质是什么？6.6.基因探针的实质是什么？基因探针的实质是什么？7.7.若使农杆菌也能感染单子叶植物，应如何操作？若使农杆菌也能感染单子叶植物，应如何操作？8.8.基因工程操作的四个步骤中，有哪几个步骤涉及到碱基基因工程操作的四个步骤中，有哪几个步骤涉及到碱基 互补配对？互补配对？小结小结:基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序1.获取目的基因获取目的基因u从基因文库从基因文库u利用利用PCRu化学方法人工合成化学方法人工合成2.构建基因表达载体构建基因表达载体u目的基因、启动子、终止子、标记基因目的基因、启动子、终止子、标记基因3.将目的基因导入受体细胞将目

21、的基因导入受体细胞u农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法、显微农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法、显微注射技术、感受态细胞注射技术、感受态细胞4.目的基因的检测与鉴定目的基因的检测与鉴定u检测：是否插入、转录、翻译检测：是否插入、转录、翻译n鉴定鉴定1.1.细菌的质粒分子带有一个抗菌素抗性基因，该抗细菌的质粒分子带有一个抗菌素抗性基因，该抗性基因在基因工程中的主要作用是性基因在基因工程中的主要作用是 A A提高受体细胞在自然环境中的耐药性提高受体细胞在自然环境中的耐药性 B B有利于对目的基因是否导入进行检测有利于对目的基因是否导入进行检测C C增加质粒分子的分子量增加质粒分子的分子量D D

22、便于与外源基因连接便于与外源基因连接2.2.有关基因工程的叙述正确的是有关基因工程的叙述正确的是A A限制酶只在获得目的基因时才用限制酶只在获得目的基因时才用B B重组质粒的形成是在细胞内完成的重组质粒的形成是在细胞内完成的C C质粒都可作为运载体质粒都可作为运载体 D D蛋白质的结构可为合成目的基因提供资料蛋白质的结构可为合成目的基因提供资料BD3.3.哪项不是基因表达载体的组成部分哪项不是基因表达载体的组成部分 A.A.启动子启动子 B.B.终止密码子终止密码子 C.C.标记基因标记基因 D.D.目的基因目的基因4.4.下列哪项不是将目的基因导入植物细胞的方法下列哪项不是将目的基因导入植物

23、细胞的方法 A A基因枪法基因枪法 B B显微注射法显微注射法 C.C.农杆菌转化法农杆菌转化法 D D花粉管通道法花粉管通道法BB5 5、有关基因工程的叙述中，错误的是、有关基因工程的叙述中，错误的是 A A、DNADNA连接酶将黏性末端的碱基对连接起来连接酶将黏性末端的碱基对连接起来 B B、限制性内切酶用于目的基因的获得、限制性内切酶用于目的基因的获得 C C、目的基因须由运载体导入受体细胞、目的基因须由运载体导入受体细胞 D D、人工合成目的基因不用限制性内切酶、人工合成目的基因不用限制性内切酶A A6.6.将将ada(ada(腺苷酸脱氨酶基因腺苷酸脱氨酶基因)通过质粒通过质粒pET2

24、8bpET28b导入大肠杆导入大肠杆菌并成功表达腺苷酸脱氨酶。下列叙述错误的是菌并成功表达腺苷酸脱氨酶。下列叙述错误的是A.A.每个大肠杆菌细胞至少含一个重组质粒每个大肠杆菌细胞至少含一个重组质粒B.B.每个重组质粒至少含一个限制性核酸内切酶识别位点每个重组质粒至少含一个限制性核酸内切酶识别位点C.C.每个限制性核酸内切酶识别位点至少插入一个每个限制性核酸内切酶识别位点至少插入一个adaadaD.D.每个插入的每个插入的adaada至少表达一个腺苷酸脱氨酶分子至少表达一个腺苷酸脱氨酶分子C C7.7.农杆菌是一种在土壤中生活的微生物，能在自然条农杆菌是一种在土壤中生活的微生物，能在自然条件下感

25、染植物，因而在植物基因工程中得到了广泛的件下感染植物，因而在植物基因工程中得到了广泛的应用。下图为农杆菌转化法的示意图，试回答下列问应用。下图为农杆菌转化法的示意图，试回答下列问题：题：(1)(1)一般情况下农杆菌不能感染的植物是一般情况下农杆菌不能感染的植物是_，利用农杆，利用农杆菌能在自然条件下感染植物的特点，能实现菌能在自然条件下感染植物的特点，能实现_。具体原理是在农杆菌的具体原理是在农杆菌的TiTi质粒上存在质粒上存在T-DNAT-DNA片段，它具有片段，它具有可转移到受体细胞并整合到受体细胞的可转移到受体细胞并整合到受体细胞的_上的特点，因上的特点，因此只要将携带外源基因的此只要将

26、携带外源基因的DNADNA片段插入到片段插入到_(_(部位部位)即可。即可。(2)(2)根据根据T-DNAT-DNA这一转移特点，猜测该这一转移特点，猜测该DNADNA片段上可能含有片段上可能含有控制控制_(_(酶酶)合成的基因。合成的基因。(3)(3)图中图中c c过程中，能促进农杆菌移向植物细胞的物质是过程中，能促进农杆菌移向植物细胞的物质是_ _ _类化合物。类化合物。(4)(4)植物基因工程中将目的基因导入受体细胞的方法除了植物基因工程中将目的基因导入受体细胞的方法除了农杆菌转化法之外，还可采取农杆菌转化法之外，还可采取_。(至少至少写出两种写出两种)单子叶植物单子叶植物目的基因导入到

27、植物细胞目的基因导入到植物细胞染色体染色体DNADNAT-DNAT-DNA片段片段(内部内部)DNADNA连接酶、限制酶连接酶、限制酶酚酚基因枪法、花粉管通道法基因枪法、花粉管通道法1 1、将目的基因导入植物细胞的方法：、将目的基因导入植物细胞的方法：农杆菌转化法农杆菌转化法三、将目的基因导入受体细胞三、将目的基因导入受体细胞花粉管通道法花粉管通道法1 1、将目的基因导入植物细胞的方法：、将目的基因导入植物细胞的方法：三、将目的基因导入受体细胞三、将目的基因导入受体细胞基因枪法基因枪法2 2、将目的基因导入动物细胞、将目的基因导入动物细胞 显微注射法显微注射法目的基因表达载体提纯目的基因表达载

28、体提纯 取卵（受精卵）取卵（受精卵）显微注射受精卵显微注射受精卵 移植到输卵管或子宫移植到输卵管或子宫 新性新性状动物状动物3 3、将目的基因导入微生物细胞、将目的基因导入微生物细胞用用CaCa2+2+处理细胞处理细胞 感受态细胞感受态细胞 表达载体与感表达载体与感受态细胞混合受态细胞混合 感受态细胞吸收感受态细胞吸收DNADNA分子分子处理物质：处理物质：常用菌：常用菌：微生物作受体细胞原因：微生物作受体细胞原因：CaCa2+2+处理处理大肠杆菌大肠杆菌繁殖快、繁殖快、多为单细胞、多为单细胞、遗传物质相对少遗传物质相对少过程：过程：思考与探究：思考与探究：2.根据农杆菌可将目的基因导入双子叶

29、植物的机理根据农杆菌可将目的基因导入双子叶植物的机理,你能分你能分析出不能导入单子叶植物的原因吗析出不能导入单子叶植物的原因吗?若将一个抗病基因导若将一个抗病基因导入小麦中入小麦中,理论上讲你应该怎样做理论上讲你应该怎样做?要选择合适的农杆菌菌株，因为不是所有的农杆菌菌株都要选择合适的农杆菌菌株，因为不是所有的农杆菌菌株都可以侵染单子叶植物；可以侵染单子叶植物；要加趋化和诱导的物质，一般为乙要加趋化和诱导的物质，一般为乙酰丁香酮等，目的是使农杆菌向植物组织的受伤部位靠拢酰丁香酮等，目的是使农杆菌向植物组织的受伤部位靠拢（趋化性）和激活农杆菌的（趋化性）和激活农杆菌的Vir区（诱导）的基因，使区

30、（诱导）的基因，使T-DNA转移并插入到染色体转移并插入到染色体DNA上。上。3.3.利用大肠杆菌可以生产出人的胰岛素，联系前面有关细胞器功利用大肠杆菌可以生产出人的胰岛素，联系前面有关细胞器功能的知识，结合基因工程操作程序的基本思路，思考一下，若要能的知识，结合基因工程操作程序的基本思路，思考一下，若要生产人的糖蛋白，可以用大肠杆菌吗？生产人的糖蛋白，可以用大肠杆菌吗？有些蛋白质肽链上有共价结合的糖链，这些糖链是在内质网有些蛋白质肽链上有共价结合的糖链，这些糖链是在内质网和高尔基复合体上加工完成的，内质网和高尔基复合体存在和高尔基复合体上加工完成的，内质网和高尔基复合体存在于真核细胞中，大肠

31、杆菌不存在这两种细胞器，因此，在大于真核细胞中，大肠杆菌不存在这两种细胞器，因此，在大肠杆菌中生产这种糖蛋白是不可能的。肠杆菌中生产这种糖蛋白是不可能的。4.-4.-珠蛋白是动物血红蛋白的重要组成成分。当它的成分异珠蛋白是动物血红蛋白的重要组成成分。当它的成分异常时，动物有可能患某种疾病，如镰刀形细胞贫血症。假如常时，动物有可能患某种疾病，如镰刀形细胞贫血症。假如让你用基因工程的方法，使大肠杆菌生产出鼠的让你用基因工程的方法，使大肠杆菌生产出鼠的-珠蛋白，珠蛋白，想一想，应如何进行设计？想一想，应如何进行设计？（1 1）从小鼠中克隆出）从小鼠中克隆出-珠蛋白基因的编码序列（珠蛋白基因的编码序列

32、（cDNA)cDNA)。（2 2）将）将cDNAcDNA前接上在大肠杆菌中可以适用的启动子，另外前接上在大肠杆菌中可以适用的启动子，另外加上抗四环素的基因，构建成一个表达载体。加上抗四环素的基因，构建成一个表达载体。（3 3）将表达载体导入无四环素抗性的大肠杆菌中，然后在）将表达载体导入无四环素抗性的大肠杆菌中，然后在含有四环素的培养基上培养大肠杆菌。如果表达载体未进入含有四环素的培养基上培养大肠杆菌。如果表达载体未进入大肠杆菌中，大肠杆菌会不含有抗四环素基因而死掉；如果大肠杆菌中，大肠杆菌会不含有抗四环素基因而死掉；如果培养基上长出大肠杆菌菌落，则表明培养基上长出大肠杆菌菌落，则表明-珠蛋白

33、基因已进入珠蛋白基因已进入其中。其中。（4 4）培养进入了）培养进入了-珠蛋白基因的大肠杆菌，收集菌体，破珠蛋白基因的大肠杆菌，收集菌体，破碎后从中提取碎后从中提取-珠蛋白。珠蛋白。结构基因结构基因外显子外显子内含子内含子转录、加工修饰转录、加工修饰mRNA详细过程一、获取目的基因（一、获取目的基因（指编码蛋白质结构基因指编码蛋白质结构基因）鸟枪法鸟枪法供体供体DNADNADNADNA片段片段目的基因目的基因逆转录法逆转录法信使信使RNARNA目的基因目的基因化学合成法化学合成法肽链氨基酸序列肽链氨基酸序列信使信使RNARNA序列序列基因基因DNADNA序列序列目的基因目的基因合成合成推测推测

34、逆转录逆转录合成合成直接提取法（原核生物）直接提取法（原核生物）人工合成法（真核生物）人工合成法（真核生物）n 聚合酶链式反应（PCR）l变性、退火、延伸三步曲变性：双链DNA解链成为单链DNA退火：部分引物与模板的单链DNA的特定互补部位相配对和结合延伸：以目的基因为模板，合成互补的新DNA链PCR(多聚酶链式反应)lPCR技术的发明PCR的发明是DNA操作技术的革命美国Mullis教授 开汽车时的联想 逶迤崎岖的山路DNA双螺旋 行驶的汽车一小段DNA引物 1988年发明了PCR技术 1993年获得诺贝尔奖检测是否插入目的基因，检测是否插入目的基因，利用利用DNADNA分子杂交技术分子杂交

35、技术，目的基因，目的基因DNADNA一条链（作探针）与受体细胞中提取的一条链（作探针）与受体细胞中提取的DNADNA杂交，看是否有杂交，看是否有杂交带。杂交带。检测是否转录出了检测是否转录出了mRNAmRNA，利用利用DNADNA分子杂交技术，分子杂交技术，目的基因目的基因DNADNA一条链（作探针）与受体细胞中提取的一条链（作探针）与受体细胞中提取的mRNAmRNA杂交，看是否有杂交，看是否有杂交带。杂交带。检测目的基因是否翻译成蛋白质。检测目的基因是否翻译成蛋白质。抗体与蛋白质进行抗原抗体与蛋白质进行抗原抗体杂交，看是否有杂交带。抗体杂交，看是否有杂交带。还可以进行个体水平的鉴定，根据其性

36、状。还可以进行个体水平的鉴定，根据其性状。提示：提示：DNADNA分子杂交技术首先提取受体细胞中的分子杂交技术首先提取受体细胞中的DNADNA，然后高，然后高温解成单链，再与同位素标记的温解成单链，再与同位素标记的DNADNA探针杂交；探针杂交；抗原抗体杂抗原抗体杂交所用到的抗体是用表达出的蛋白质注射动物进行免疫，产生交所用到的抗体是用表达出的蛋白质注射动物进行免疫，产生相应的抗体，并提取出而来的。相应的抗体，并提取出而来的。不可以。因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用，不可以。因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用，还需要有其他控制元件，如启动子、终止子和标记基因等。还需要有其他控

37、制元件，如启动子、终止子和标记基因等。必须构建上述元件的主要理由是：必须构建上述元件的主要理由是：（1）生物之间进行基因交流，只有使用生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身基因受体生物自身基因的启动子才能比较有利于基因的表达；的启动子才能比较有利于基因的表达；（2）通过通过cDNA文库获得的目的基因没有启动子，只将编码文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入受体生物中无法转录；序列导入受体生物中无法转录；（3）目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记；目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记；（4）为了增强目的基因的表达水平，往往还要增加一些其为了增强目的基因的表达水平，往往还要增加

38、一些其他调控元件，如增强子等；他调控元件，如增强子等；（5）有时需要确定目的基因表达的产物存在于细胞的什么有时需要确定目的基因表达的产物存在于细胞的什么部位，往往要加上可以标识存在部位的基因（或做成目的基部位，往往要加上可以标识存在部位的基因（或做成目的基因与标识基因的融合基因），如绿色荧光蛋白基因等。因与标识基因的融合基因），如绿色荧光蛋白基因等。1.2 1.2 基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序v目的基因的获取目的基因的获取目的基因的获取目的基因的获取v基因表达载体的构建基因表达载体的构建基因表达载体的构建基因表达载体的构建v将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞v目的基因的检测与鉴定目的基因的检测与鉴定目的基因的检测与鉴定目的基因的检测与鉴定cDNAcDNA文库文库演讲完毕，谢谢观看！