核酸的分离纯化 (2)讲稿.ppt

《核酸的分离纯化 (2)讲稿.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《核酸的分离纯化 (2)讲稿.ppt（88页珍藏版）》请在淘文阁 - 分享文档赚钱的网站上搜索。

1、关于核酸的分离纯化关于核酸的分离纯化(2)第一页，讲稿共八十八页哦DNADNA和和RNARNA是是生生物物体体中中最最重重要要的的核核酸酸分分子子，是分子生物学和分子诊断的研究对象是分子生物学和分子诊断的研究对象DNADNA和和RNARNA的的分分离离纯纯化化是是分分子子生生物物学学研研究及分子诊断最基础的工作究及分子诊断最基础的工作第二页，讲稿共八十八页哦核酸分离纯化的核酸分离纯化的原则原则:保持核酸一级结构的完整性保持核酸一级结构的完整性尽可能提高核酸制品的纯度尽可能提高核酸制品的纯度第三页，讲稿共八十八页哦核酸分子提取的技术路线核酸分子提取的技术路线I.I.材料准备材料准备II.II.破

2、碎细胞或包膜内容物释放破碎细胞或包膜内容物释放III.III.核酸分离、纯化核酸分离、纯化IV.IV.沉淀或吸附核酸，并去除杂质沉淀或吸附核酸，并去除杂质V.V.核酸溶解在适量缓冲液或水中核酸溶解在适量缓冲液或水中第四页，讲稿共八十八页哦第一节第一节 核酸分离纯化的设计及原则核酸分离纯化的设计及原则第二节第二节 基因组基因组DNADNA的分离纯化的分离纯化第三节第三节 质粒质粒DNADNA的提取与纯化的提取与纯化第四节第四节 RNARNA的分离纯化的分离纯化第五节第五节 核酸的保存与鉴定核酸的保存与鉴定第五页，讲稿共八十八页哦第一节 核酸分离纯化的设计及原则第六页，讲稿共八十八页哦一、材料与方

3、法的选择一、材料与方法的选择二、技术路线的设计二、技术路线的设计三、核酸的鉴定与保存三、核酸的鉴定与保存第七页，讲稿共八十八页哦（一）材料与方法的选择不同的研究目的对核酸的完整性、纯不同的研究目的对核酸的完整性、纯度、度、产量及浓度有不同的要求。产量及浓度有不同的要求。需考虑制备核酸所需的时间与成本需考虑制备核酸所需的时间与成本应选择安全的试剂与制备方案应选择安全的试剂与制备方案一、材料与方法的选择一、材料与方法的选择第八页，讲稿共八十八页哦 1.1.保持核酸碱基序列的完整性保持核酸碱基序列的完整性 2.2.尽量清除其它分子的污染，保证核酸纯度尽量清除其它分子的污染，保证核酸纯度 3.3.保持

4、核酸的完整性保持核酸的完整性 尽量简化分离纯化步骤，缩短提取时间尽量简化分离纯化步骤，缩短提取时间 尽量避免各种有害因素对核酸的破坏尽量避免各种有害因素对核酸的破坏 （二）（二）选择原则选择原则一、材料与方法的选择一、材料与方法的选择第九页，讲稿共八十八页哦二、技术路线的设计二、技术路线的设计（一）核酸的释放（一）核酸的释放（二）核酸的分离与纯化（二）核酸的分离与纯化（三）核酸的浓缩、沉淀与洗涤（三）核酸的浓缩、沉淀与洗涤第十页，讲稿共八十八页哦（一）核酸的释放DNADNA和和RNARNA均均位位于于细细胞胞内内（病病毒毒除除外外），因因此此核核酸酸分分离离与与纯纯化化的的第第一一步步即即是是

5、裂裂解细胞、释放核酸。解细胞、释放核酸。第十一页，讲稿共八十八页哦第十二页，讲稿共八十八页哦应该清除的杂质主要包括应该清除的杂质主要包括:1.1.非核酸的大分子污染物非核酸的大分子污染物 蛋白质、多糖及脂类物质等蛋白质、多糖及脂类物质等 2.2.非需要的核酸分子非需要的核酸分子 分分离离某某一一核核酸酸分分子子时时，其其它它核核酸酸皆皆为为杂质杂质 3.3.加入的有机溶剂和某些金属离子加入的有机溶剂和某些金属离子（二）核酸的分离与纯化（二）核酸的分离与纯化第十三页，讲稿共八十八页哦（三）核酸的浓缩、沉淀与洗涤沉淀沉淀是是浓缩浓缩核酸最常用的方法核酸最常用的方法常用的常用的盐类盐类:醋酸钠、醋酸

6、钾、醋酸铵、醋酸钠、醋酸钾、醋酸铵、氯化钠、氯化钾及氯化镁氯化钠、氯化钾及氯化镁常用的常用的有机溶剂有机溶剂:乙醇、异丙醇和聚乙乙醇、异丙醇和聚乙二醇二醇核酸沉淀常常含有少量共沉淀的盐，核酸沉淀常常含有少量共沉淀的盐，需用需用70%70%75%75%的乙醇洗涤的乙醇洗涤去除去除第十四页，讲稿共八十八页哦三、核酸的鉴定与保存三、核酸的鉴定与保存（一）核酸的鉴定（一）核酸的鉴定（二）核酸的保存（二）核酸的保存第十五页，讲稿共八十八页哦（一）核酸的鉴定（一）核酸的鉴定1.1.浓度鉴定浓度鉴定2.2.纯度鉴定纯度鉴定3.3.完整性鉴定完整性鉴定第十六页，讲稿共八十八页哦 紫外分光光度法：紫外分光光度法

7、：核核酸酸分分子子中中的的碱碱基基具具有有共共轭轭双双键键结结构构，可可以以吸吸收收紫紫外外线线，其其最最大大吸吸收收波长为波长为260nm260nm。1.1.浓度鉴定浓度鉴定第十七页，讲稿共八十八页哦 各种碱基的紫外吸收光谱各种碱基的紫外吸收光谱第十八页，讲稿共八十八页哦 荧光光度法：荧光光度法：核核酸酸的的荧荧光光染染料料溴溴化化乙乙锭锭嵌嵌入入碱碱基基平平面面后后，本本身身无无荧荧光光的的核核酸酸在在 UV UV 激激发发下下发发出出红红色色荧荧光光。荧荧光光强强度度的的积积分分与与溶液中核酸的含量呈正比。溶液中核酸的含量呈正比。第十九页，讲稿共八十八页哦EBEB与与DNADNA的结合的

8、结合第二十页，讲稿共八十八页哦第二十一页，讲稿共八十八页哦 紫外分光光度法：紫外分光光度法：主主要要通通过过A A260260与与A A280280的的比比值值来来判判定定有有无无蛋蛋白白质质的的污污染染。比比值值升升高高或或降降低低均均提提示示制备的核酸纯度不佳。制备的核酸纯度不佳。2.2.纯度鉴定纯度鉴定第二十二页，讲稿共八十八页哦1.DNA1.DNA或或RNARNA的定量的定量ODOD260260=1.0=1.0相当于相当于 50 50g/mlg/ml双链双链DNADNA 40g/ml 40g/ml单链单链DNADNA（或（或RNARNA）20g/ml 20g/ml寡核苷酸寡核苷酸2.2

9、.判断核酸样品的纯度判断核酸样品的纯度 DNA DNA纯品纯品:ODOD260260/OD/OD280 280=1.8=1.8 RNA RNA纯品纯品:ODOD260260/OD/OD280 280=2.0=2.0第二十三页，讲稿共八十八页哦荧光光度法：荧光光度法：EBEB等等荧荧光光染染料料示示踪踪的的核核酸酸电电泳泳可可判判定定核核酸制品的纯度。酸制品的纯度。第二十四页，讲稿共八十八页哦琼脂糖凝胶电泳：琼脂糖凝胶电泳：以以EBEB为为示示踪踪剂剂的的核核酸酸凝凝胶胶电电泳泳可可判判定定核酸制品的完整性核酸制品的完整性基基因因组组DNADNA如如果果发发生生降降解解，电电泳泳图图呈呈拖尾状拖

10、尾状 3.3.完整性鉴定完整性鉴定第二十五页，讲稿共八十八页哦DNADNA的降解的降解第二十六页，讲稿共八十八页哦 完完整整的的或或降降解解很很少少的的总总RNARNA电电泳泳图图谱谱中中，三条三条带荧光强度应呈特定的比值。带荧光强度应呈特定的比值。沉沉降降系系数数大大，电电泳泳迁迁移移率率低低，荧荧光光强强度高度高沉降系数小，电泳迁移率高，荧光强度低沉降系数小，电泳迁移率高，荧光强度低 第二十七页，讲稿共八十八页哦28S28S（或或23S23S）RNARNA的的荧荧光光强强度度一一般般约约为为18S18S（或或16S16S）RNARNA的的2 2倍倍，否否则则提提示示有有RNARNA的降解的

11、降解若若在在点点样样孔孔附附近近有有着着色色条条带带，提提示示可可能存在能存在DNADNA的污染的污染第二十八页，讲稿共八十八页哦第二十九页，讲稿共八十八页哦（二）核酸的保存（二）核酸的保存1.DNA1.DNA的储存的储存2.RNA2.RNA的储存的储存第三十页，讲稿共八十八页哦 溶溶于于TETE缓缓冲冲液液中中的的DNADNA在在-70-70冰冰箱箱可可保保存数年。存数年。TETE的的pHpH为为8.08.0时时，DNADNA的的脱脱氨氨反反应应减减少少，pHpH低低7.07.0时时DNADNA易变性。易变性。1.1.DNADNA的保存的保存第三十一页，讲稿共八十八页哦 2.RNA的保存 R

12、NARNA溶于溶于H H2 2O O或或0.3mol/L0.3mol/L的的NaAcNaAc溶液中，溶液中，-70-70 保存保存 RNARNA溶液中加入溶液中加入RNasinRNasin或或VRCVRC，可延长保存时间，可延长保存时间 用于配置试剂及溶解用于配置试剂及溶解RNARNA的的H H2 2O O均应经均应经DEPCDEPC处理处理第三十二页，讲稿共八十八页哦第二节 真核基因组DNA的分离纯化第三十三页，讲稿共八十八页哦生物体组织细胞生物体组织细胞玻棒缠绕法玻棒缠绕法酚抽提法酚抽提法基因组基因组 DNA粗品粗品PFGE分离分离特定的特定的DNA片段片段AGE分离分离PAGE分离分离乙

13、醇沉淀洗涤乙醇沉淀洗涤基因组基因组DNA纯品纯品精分离精分离粗分离粗分离前处理前处理离子交换层析纯化离子交换层析纯化有机溶剂抽提有机溶剂抽提细胞裂解蛋白质变性沉细胞裂解蛋白质变性沉淀降解淀降解DNA释放释放甲酰胺解聚法甲酰胺解聚法 哺乳动物基因组哺乳动物基因组DNADNA分离纯化的一般技术路线分离纯化的一般技术路线第三十四页，讲稿共八十八页哦基因组基因组DNA的提取的提取-酚抽提法酚抽提法样品的准备细胞的裂解蛋白质变性DNA的抽提DNA的沉淀第三十五页，讲稿共八十八页哦血基因组血基因组DNA试剂盒试剂盒酵母基因组酵母基因组DNA试剂盒试剂盒细菌基因组细菌基因组DNA试剂盒试剂盒细胞基因组细胞基

14、因组DNA试剂盒试剂盒第三十六页，讲稿共八十八页哦一、酚抽提法一、酚抽提法二、甲酰胺解聚法二、甲酰胺解聚法三、玻棒缠绕法三、玻棒缠绕法四、其它方法四、其它方法五、五、DNADNA片段的纯化片段的纯化六、六、DNADNA片段的回收片段的回收第三十七页，讲稿共八十八页哦 一、酚抽提法19761976年年由由StaffordStafford及及其其同同事事创创立立，现现在在使用的是改进的方法使用的是改进的方法以以含含EDTAEDTA、SDSSDS及及RNaseRNase的的裂裂解解缓缓冲冲液液裂裂解解细胞细胞经经蛋蛋白白酶酶K K处处理理后后，用用pH8.0pH8.0的的TrisTris饱饱和和酚酚

15、抽提，获得抽提，获得DNADNA粗制品粗制品第三十八页，讲稿共八十八页哦第三十九页，讲稿共八十八页哦二、甲酰胺解聚法 19871987年年KupiecKupiec等等报报道道了了甲甲酰酰胺胺解解聚聚法法，其其中中细细胞胞裂裂解解和和蛋蛋白白质质水水解解步步骤骤同同酚酚抽抽提法，但不进行酚的抽提。提法，但不进行酚的抽提。第四十页，讲稿共八十八页哦三、玻棒缠绕法玻玻棒棒缠缠绕绕法法是是在在Bowtell(1987)Bowtell(1987)方方法法的的基基础础上上经经改改进而来进而来第四十一页，讲稿共八十八页哦四、其它方法 有有些些分分子子诊诊断断技技术术并并不不需需要要高高分分子子量量的的DNA

16、DNA样样品品，因因此此步步骤骤简简化化、操操作作简简便的便的DNADNA快速提取法广泛使用。快速提取法广泛使用。1.1.异丙醇沉淀法异丙醇沉淀法 2.2.玻璃珠吸附法玻璃珠吸附法第四十二页，讲稿共八十八页哦五、DNA片段的纯化 常用的纯化方法：常用的纯化方法：有机溶剂抽提法有机溶剂抽提法 柱柱层层析析法法（column column chromatographychromatography）第四十三页，讲稿共八十八页哦第四十四页，讲稿共八十八页哦六、DNA片段的回收原则与要求原则与要求:1.1.提高片段的回收率提高片段的回收率 2.2.清除回收的清除回收的DNADNA样品中的杂质样品中的杂质

17、第四十五页，讲稿共八十八页哦（二）（二）从聚丙烯酰胺凝胶中回收从聚丙烯酰胺凝胶中回收DNADNA片段片段（一）（一）从琼脂糖凝胶中回收从琼脂糖凝胶中回收DNADNA片段片段第四十六页，讲稿共八十八页哦1.1.二二乙乙基基氨氨基基乙乙基基-纤纤维维素素膜膜插插片片电泳法电泳法2.2.电泳洗脱法电泳洗脱法3.3.冷冻挤压法冷冻挤压法4.4.低熔点琼脂糖凝胶挖块回收法低熔点琼脂糖凝胶挖块回收法（一）从琼脂糖凝胶中回收DNA片段第四十七页，讲稿共八十八页哦（二）从聚丙烯酰胺凝胶中回收DNA片段 标标准准方方法法是是压压碎碎与与浸浸泡泡法法。费费时时但但操作简单，是小片段操作简单，是小片段DNADNA回

18、收的较好方法。回收的较好方法。第四十八页，讲稿共八十八页哦第三节 质粒DNA的提取与纯化 第四十九页，讲稿共八十八页哦质粒是细菌内独立于染色体并能自我复制的小环状DNA分子其大小范围从lkb至200kb以上不等已经在形形色色的细菌类群中发现质粒这些质粒都是独立于细菌染色体之外进行复制和遗传的辅助性遗传单位。质粒是携带外源基因进入细菌中扩增或表达的重要媒介物，这种基因运载工具在基因工程中具有极广泛的应用价值，而质粒的分离与提取则是最常用、最基本的实验技术。第五十页，讲稿共八十八页哦第五十一页，讲稿共八十八页哦质粒特性质粒特性1.分子相对小 2.含有高效的自主复制成分 3.不相容性4.转移性5.选

19、择的标记6.限制性内切酶单一切。第五十二页，讲稿共八十八页哦第五十三页，讲稿共八十八页哦质粒质粒DNADNA的提取和纯化的提取和纯化 1 1细菌的培养细菌的培养 先分离单个菌落，先分离单个菌落，接种到含少量适接种到含少量适当抗生素的培养当抗生素的培养基中扩增，随着基中扩增，随着细菌的生长，质细菌的生长，质粒粒DNADNA也在自主复也在自主复制。制。质粒质粒DNA的小量制备的小量制备2-5ml质粒质粒DNA的大量制备的大量制备500ml第五十四页，讲稿共八十八页哦2细菌的收集细胞生长过程中，排出大量代谢产物，为了提高质粒DNA的纯度，离心弃上清，细菌沉淀最好用STE或生理盐水悬浮，漂洗l-2次，

20、离心管壁上的液体也应该仔细去除干净 第五十五页，讲稿共八十八页哦 碱裂解法碱裂解法 煮沸法煮沸法 SDSSDS裂解法裂解法 Triton-Triton-溶菌酶法溶菌酶法 3细菌的裂解方法方法4质粒DNA的提取-适用于大质粒适用于大质粒DNA-不适宜含糖高的菌株如不适宜含糖高的菌株如HB101第五十六页，讲稿共八十八页哦二、煮沸裂解法二、煮沸裂解法三、三、SDS裂解法裂解法四、其他方法四、其他方法一、碱裂解法一、碱裂解法五、质粒五、质粒DNADNA的纯化的纯化第五十七页，讲稿共八十八页哦一、碱裂解法 在在强强碱碱（pH12.0pH12.012.612.6）条条件件下下，用用SDSSDS破破坏坏细

21、细胞胞壁壁和和裂裂解解细细胞胞，并并使使细细胞胞的的蛋蛋白白质质与与DNADNA发发生生变变性性，释释放放出出质质粒粒DNADNA。第五十八页，讲稿共八十八页哦细细胞胞裂裂解解后后，细细胞胞壁壁、细细胞胞膜膜的的碎碎片片、变变性性的的蛋蛋白白质质和和染染色色体体DNADNA形形成成大大的的复复合物合物当当pHpH调调至至中中性性，质质粒粒DNADNA重重新新恢恢复复天天然然的超螺旋结构的超螺旋结构在在高高盐盐条条件件下下沉沉淀淀，经经离离心心分分离离，质质粒粒DNADNA保留在上清液中保留在上清液中第五十九页，讲稿共八十八页哦第六十页，讲稿共八十八页哦二、煮沸裂解法 将将细细菌菌悬悬浮浮于于含

22、含TritonX-100TritonX-100和和溶溶菌菌酶酶的的缓缓冲冲液液中中，TritonX-100TritonX-100和和溶溶菌菌酶酶能能破破坏坏细细胞胞壁壁，再再用用沸沸水水浴浴裂裂解解细细胞胞，并并使宿主细胞的蛋白质与使宿主细胞的蛋白质与DNADNA变性。变性。第六十一页，讲稿共八十八页哦质质粒粒DNADNA因因结结构构紧紧密密不不会会解解链链，当当温温度度下下降降后后，可可重重新新恢恢复复其其天天然然超超螺螺旋旋结结构构通通过过离离心心去去除除变变性性的的蛋蛋白白质质和和染染色色体体DNA,DNA,然后回收上清液中的质粒然后回收上清液中的质粒DNADNA第六十二页，讲稿共八十八

23、页哦三、三、SDSSDS裂解法裂解法将将细细菌菌悬悬浮浮于于等等渗渗的的蔗蔗糖糖溶溶液液中中，用用溶溶菌菌酶和酶和EDTAEDTA处理以破坏细胞壁处理以破坏细胞壁用用SDSSDS裂裂解解去去壁壁细细胞胞，温温和和释释放放质质粒粒到到等等渗渗液中液中用酚用酚/氯仿抽提，乙醇沉淀、洗涤质粒氯仿抽提，乙醇沉淀、洗涤质粒DNADNA第六十三页，讲稿共八十八页哦 由由于于条条件件温温和和，SDSSDS裂裂解解法法特特别别适适用用于于大大质质粒粒DNADNA（15kb15kb）的的提提取取。但但由由于于部部分分质质粒粒DNADNA会会与与细细胞胞碎碎片片缠缠绕绕在在一起而丢失，故产率不高。一起而丢失，故产

24、率不高。第六十四页，讲稿共八十八页哦四、其他方法（二）牙签少量制备法（二）牙签少量制备法(一一)小量一步提取法小量一步提取法第六十五页，讲稿共八十八页哦直接将酚直接将酚/氯仿与细菌培养物混合，然后离氯仿与细菌培养物混合，然后离心去除大部分蛋白质和染色体心去除大部分蛋白质和染色体DNADNA，最后从，最后从上清液中回收质粒上清液中回收质粒DNADNA简单快捷、成本低，提取的质粒可用于限简单快捷、成本低，提取的质粒可用于限制性内切酶图谱分析制性内切酶图谱分析(一)小量一步提取法第六十六页，讲稿共八十八页哦（二）牙签少量制备法（二）牙签少量制备法用牙签直接挑取生长在琼脂用牙签直接挑取生长在琼脂平板上

25、的细平板上的细菌菌落制备质粒菌菌落制备质粒DNADNA由于制备的质粒由于制备的质粒DNADNA有较多污染，不能有较多污染，不能用于分子克隆中的酶学反应，但可用于质用于分子克隆中的酶学反应，但可用于质粒的鉴定粒的鉴定第六十七页，讲稿共八十八页哦五、质粒DNA的纯化.CsCl-EB.CsCl-EB法法.聚乙二醇沉淀法聚乙二醇沉淀法.柱层析法柱层析法第六十八页，讲稿共八十八页哦 在过量在过量EBEB存在的条件下，各种不同密度的物存在的条件下，各种不同密度的物质经离心平衡后得以分开。质经离心平衡后得以分开。蛋白质由于密度小而浮于液面蛋白质由于密度小而浮于液面RNARNA密度大而沉于管底密度大而沉于管底

26、各种各种DNADNA密度介于蛋白质与密度介于蛋白质与RNARNA之间，处之间，处于中部于中部 EB-CsCl密度梯度离心法第六十九页，讲稿共八十八页哦第七十页，讲稿共八十八页哦 不同分子构型的不同分子构型的DNADNA与与EBEB的结合能力不同，的结合能力不同，密度下降也不同，因而可将它们有效分密度下降也不同，因而可将它们有效分离开。离开。染色体染色体DNADNA、开环质粒、开环质粒DNADNA等可嵌入更多的等可嵌入更多的EBEB，因而密度下降较多，因而密度下降较多 闭环质粒闭环质粒DNADNA为超螺旋三级结构，为超螺旋三级结构，EBEB不不易插入而结合量少，密度下降较少易插入而结合量少，密度

27、下降较少 第七十一页，讲稿共八十八页哦第七十二页，讲稿共八十八页哦第四节 真核细胞RNA的分离纯化第七十三页，讲稿共八十八页哦细胞细胞RNA的含量的含量每个细胞的每个细胞的RNA量约为量约为10-5g80%-85%rRNA10%-15%tRNA1%-5%mRNA其他其他RNA：hnRNA、snRNA、snoRNA第七十四页，讲稿共八十八页哦二、酸性异硫氰酸胍二、酸性异硫氰酸胍-酚酚-氯仿一步法氯仿一步法三、商品化试剂单相裂解法三、商品化试剂单相裂解法四、四、mRNAmRNA的分离纯化的分离纯化一、一、RNARNA制备的条件与环境制备的条件与环境第七十五页，讲稿共八十八页哦一、RNA制备的条件与

28、环境RNARNA易易被被RNaseRNase水水解解，RNaseRNase除除细细胞胞内内还还广广泛泛存存在在于于人人的的皮皮肤肤、唾唾液液、汗汗液液及及周周围围的的环环境中境中RNaseRNase分分子子结结构构中中的的二二硫硫键键使使其其生生物物学学活活性性非非常常稳稳定定，去去除除变变性性剂剂后后，RNaseRNase的的活活性性又又可恢复可恢复第七十六页，讲稿共八十八页哦去去除除RNaseRNase的的污污染染和和抑抑制制其其活活性性是是RNARNA制备成功与否的关键制备成功与否的关键在在总总RNARNA提提取取分分离离的的最最初初阶阶段段，尽尽可可能地灭活细胞内能地灭活细胞内RNas

29、eRNase的活性的活性第七十七页，讲稿共八十八页哦 选选择择性性地地使使用用RNaseRNase的的变变性性剂剂（如如酚酚、氯仿及强烈的胍类变性剂）氯仿及强烈的胍类变性剂）使用使用蛋白酶蛋白酶K K 使使用用阴阴离离子子去去污污剂剂如如SDSSDS、十十二二烷烷基基肌肌氨酸钠氨酸钠或脱氧胆酸钠或脱氧胆酸钠第七十八页，讲稿共八十八页哦联联合合使使用用RNaseRNase的的特特异异抑抑制制剂剂（如如RNasinRNasin与与DEPCDEPC等等）能能极极大大地地防防止止内内源源性性RNaseRNase对对RNARNA的降解的降解加加入入-巯巯基基乙乙醇醇、二二硫硫苏苏糖糖醇醇（DTTDTT）

30、等等还还原原剂剂可可以以还还原原RNaseRNase中中的的二二硫硫键键，有利于有利于RNaseRNase的变性、水解与灭活的变性、水解与灭活第七十九页，讲稿共八十八页哦二、酸性异硫氰酸胍二、酸性异硫氰酸胍-酚酚-氯仿一步法氯仿一步法以以含含异异硫硫氰氰酸酸胍胍、-疏疏基基乙乙醇醇和和十十二二烷烷基肌氨酸钠的基肌氨酸钠的变性溶液变性溶液裂解细胞裂解细胞在在pH4.0pH4.0的的条条件件下下，酚酚/氯氯仿仿抽抽提提细细胞胞裂裂解溶液解溶液通通过过异异丙丙醇醇沉沉淀淀与与75%75%的的乙乙醇醇洗洗涤涤而而获获得得总总RNARNA第八十页，讲稿共八十八页哦 总总RNARNA产产量量取取决决于于标

31、标本本的的起起始始量量，每每mgmg组组织织大大约约能能制制备备4 47 7g g总总RNARNA，每每10106 6个细胞大约能制备个细胞大约能制备4 41010g g总总RNARNA。第八十一页，讲稿共八十八页哦三、商品化试剂单相裂解法是是异异硫硫氰氰酸酸胍胍-酚酚-氯氯仿仿一一步步法法的的改改进进方案方案以以异异硫硫氰氰酸酸胍胍-酚酚的的单单相相裂裂解解液液裂裂解解细细胞，再加入胞，再加入氯仿氯仿后形成两相后形成两相第八十二页，讲稿共八十八页哦变变性性的的DNADNA与与蛋蛋白白质质介介于于两两相相的的交交界界面面，可使用乙醇和异丙醇分级沉淀出来可使用乙醇和异丙醇分级沉淀出来保保留留于于

32、上上层层水水相相的的RNARNA，通通过过异异丙丙醇醇沉沉淀与淀与75%75%乙醇洗涤而制备乙醇洗涤而制备第八十三页，讲稿共八十八页哦 目目前前，该该法法已已成成为为实实验验室室最最常常用用的的总总RNARNA提提取取法法，其其产产量量及及质质量量与与酸酸性性异异硫氰酸胍硫氰酸胍-酚酚-氯仿一步法氯仿一步法相当。相当。第八十四页，讲稿共八十八页哦四、mRNA的分离纯化除除血血红红蛋蛋白白及及组组蛋蛋白白的的mRNAmRNA外外，绝绝大大多多数数mRNAmRNA在在其其3 3末端带有长短不同的末端带有长短不同的polypoly（A A）尾巴）尾巴利利用用碱碱基基配配对对原原则则，通通过过olig

33、ooligo（dTdT）-纤纤维维素素或或polypoly（U U）-琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶的的亲亲和和层层析析，可可以以很很容容易易地地从从总总RNARNA制品中分离纯化制品中分离纯化mRNAmRNA第八十五页，讲稿共八十八页哦1.oligo1.oligo（dTdT）-纤维素柱层析法纤维素柱层析法2.oligo2.oligo（dTdT）-纤维素柱离心法纤维素柱离心法3.oligo3.oligo（dTdT）-纤维素液相结合离心法纤维素液相结合离心法4.4.磁珠分离法磁珠分离法第八十六页，讲稿共八十八页哦5m7G AAAAAAAAAAAA3 3TTTTTTTTTTTT-Biotin5+总RNA中的

34、poly(A)+RNA分子退火形成杂交体 5m7G AAAAAAAAAAAA3 3TTTTTTTTTTTT-Biotin5链亲和素标记的磁珠+Streptavidin-磁5m7G AAAAAAAAAAAA3 3TTTTTTTTTTTT-Biotin5Streptavidin-磁生物素与链亲和素的特异性结合 磁性分离5m7G AAAAAAAAAAAA3 磁铁3TTTTTTTTTTTT-Biotin5Streptavidin-磁洗涤与洗脱水相(含纯化的mRNA)固相生物素标记的oligo(dT)磁铁5m7G AAAAAAAAAAAA3 3TTTTTTTTTTTT-Biotin5Streptavidin-磁第八十七页，讲稿共八十八页哦感感谢谢大大家家观观看看第八十八页，讲稿共八十八页哦