液相层析分离法讲稿.ppt
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1、关于液相层析分离法第一页,讲稿共八十七页哦按流动相分类第二页,讲稿共八十七页哦按原理分类纸色层:滤纸吸附的水作固定相,有机溶剂作流动相。薄层色谱:把吸附剂粉末舖成薄层作为固定相。本章仅讨论纸色层、薄层色谱法。第三页,讲稿共八十七页哦第一节、纸色层微量操作技术,简、分离效率高、但分离速度慢、基本原理纸色层纸上萃取色谱,它和萃取一样,它也是根据不同物质在两相间的分配比不同而进行分离的(相当于逆流萃取)。第四页,讲稿共八十七页哦1.层析缸2.滤纸3.原点4.展开剂5.前沿6.7.斑点12345673第五页,讲稿共八十七页哦xyRf的计算2.比移值Rf组份分离后,它们在滤纸上的位置用比移值Rf表示.定
2、义:xy第六页,讲稿共八十七页哦Rf的大小取决于溶质在二相间的分配系数及滤纸的性质.不同的组分具有不同的分配系数,因而也就有不同的Rf.这就是定性的依据.3.影响Rf的因素(1).欲分离物的本性:物质在两相的分配系数,决定了它的Rf大小;第七页,讲稿共八十七页哦(2).层析溶剂:同一组分在不同溶剂中Rf不同。通常应选这样的层析剂,使溶质的Rf在0.05 0.85之间,不同组分的Rf差值0.05.(3).pH:影响它们的存在状态(4).滤纸:质地均一、厚薄适当、具有一定机械强度、不含杂质第八页,讲稿共八十七页哦(5).温度:在层析缸中用红外灯照射。温度会影响溶质的分配系数及流动相的扩散速度。层析
3、操作应在恒温下进行,温度不超过 0.5oC(6).展开方式:展开方式不同,Rf也不同。下行法的Rf最大,上行法的Rf较小,环行法的 Rf也不大。第九页,讲稿共八十七页哦4.操作技术(1).滤纸(担体)滤纸的选择a.要求滤纸质地均匀、平整无折痕边缘整齐b.要求滤纸的纤维松紧适宜c.滤纸的杂质含量少第十页,讲稿共八十七页哦B.层析滤纸的性能与规格型号标重g/m2厚度(mm)吸水性(30min内水上升mm)灰分g/m2性能1900.17150 1200.08快速2900.16120 900.08中速3900.1590 600.08慢速41800,34151 1210.08快速51800.32120
4、900.08中速61800.3090 600.08慢速第十一页,讲稿共八十七页哦C.滤纸的处理以0.10.4mol/LHCl(或2mol/LHAc)浸泡数小时,除去无机杂质后,取出用蒸馏水洗净,再将滤纸放在丙酮-乙醇(1:1)中浸泡一周时间,除去有机杂质,再取出风干备用.第十二页,讲稿共八十七页哦固定相纸层析以吸着在纤维素上的水作固定相。反相纸层析用甲酰胺、二甲基甲酰胺、丙二醇等作固定相。若分离芳香油等非极性物,以石蜡油、硅油作固定相。(2).试样A.试样的溶解尽量避免用水。一般用乙醇、丙酮、氯仿等,最好采用与展开剂极性相似的溶剂。液体样,直接点样。第十三页,讲稿共八十七页哦点样方法a先用铅笔
5、在距纸条一端23cm处划一条直线(起始线)并在线上隔一定距离划一“x”号表示点样位置;见下示意图:第十四页,讲稿共八十七页哦b.点样工具:微量注射器、毛细滴管(0.5mm);c.点样方法:用点样工具吸取试液轻轻与“x”号接触,使点样的斑点直径为0.20.5cm,每次点样220l于滤纸上,以冷风吹干;d.干后,将纸的两边用线缝好,以圆筒形式置于层析缸中展开。第十五页,讲稿共八十七页哦C.展开a.展开剂v展开剂的选择:欲分离物在两相中的溶解度;展开剂的极性展开剂与欲分离物间应无化学反应欲分离物在展开剂中的分配系数最好不受温度的影响欲分离物在两相间的分配平衡瞬间达到第十六页,讲稿共八十七页哦v展开剂
6、水饱和的正丁醇、正戊醇、酚、四氯化碳、氯仿、苯、丁酮、丙酮、有机酸、有机碱,有时也加入一定比例的无机酸、无机碱、甲醇、乙醇等b.展层方法:展层前,层析缸与已点样滤纸必须予先经水蒸汽、溶剂蒸气饱和。方法:将溶剂和水置于分液漏斗中充分振荡,分层后,将水层放入小烧杯内,置于层析缸中平衡一段时间,使滤纸吸饱蒸汽,然后移去小烧杯,将溶剂倒入溶剂槽中,立即将点好样的滤纸的一端浸入溶剂槽内展层。第十七页,讲稿共八十七页哦a.上行法将点有试样的滤纸条的下端浸入溶剂(但不能浸没点样处)上端固定在层析缸的上部,保持垂直,将缸密闭,使溶剂沿下端上升而展层。待溶液上升到距离纸上端3 4 cm 时,将滤纸取出,用铅笔在
7、溶剂前沿处画线作记号(见右图)第十八页,讲稿共八十七页哦对于Rf十分接近的物质可采取连续挥发的色谱法a.纸条的上端暴露在层析缸外,以便令上升的溶剂挥发;b.只要保持纸条下端与溶剂面接触,溶剂便能不断地上升而挥发,展层过程就自动连续地进行;第十九页,讲稿共八十七页哦c.若溶剂沸点100oC,则可在纸条暴露部分用红外灯烘烤,促使溶剂挥发;d.该法不能测量前沿,但可达分离的目的。b.下行法溶剂自纸的上端向下降(借助于重力的作用),具有分离速度快及连续挥发色谱的优点。第二十页,讲稿共八十七页哦玻片玻璃棒原点玻皿剪成锯齿状,便于溶剂滴下第二十一页,讲稿共八十七页哦c.环行法又叫径向色谱法。这是一种既快又
8、方便的方法。取一张圆形滤纸在直径的两边各画两根平行线,用剪刀沿这两根线剪至圆心处,在纸的中央滴上试液,干后,将滤纸夹在两个大小相同培养皿之间,使剪开的纸条的尾端浸入流动相。第二十二页,讲稿共八十七页哦d.双向展开法有时用一种溶剂不能将样品中组份分开时,可以试用双向展开法。该法是用正方形或长方形滤纸,在纸的一角上点样,先用一种展开剂朝一个方向展开,展开完毕,待溶剂挥发后,再用另一种展开剂朝与原来垂直的方向进行第二次展层。若前后二次展开剂选择适当,可使各种组份完全分离。例如,氨基酸的分离可用此法。双向展开法也可以二次使用同一种展开剂展层。第二十三页,讲稿共八十七页哦D.显色展层后,将滤纸从层析缸中
9、取出,用铅笔在溶剂前沿作记号a.有色物:直接观察各个色斑b.无色物:物理法显色:用紫外灯照,观察有无吸收或发出各种不同颜色的荧光斑点,并用铅笔画下斑点的位置及大小。第二十四页,讲稿共八十七页哦.分析a.定性:各物质有各物质的Rf。为了查明未知物的组成,最好是在同样条件下与已知的纯物质做对照实验化学法显色:利用各种物质的特性反应,喷洒适当的显色剂,若被分离的物质含有羧酸,可喷酸碱指示剂溴甲酚绿,当斑点呈黄色,说明羧酸确实存在;若被分离的物质含有氨基酸,则可喷茚三酮,多数氨基酸呈紫色,个别氨基酸呈黄色。其它化合物所用显色剂可从手册里查阅。第二十五页,讲稿共八十七页哦xyRf的计算:Rf=x/y第二
10、十六页,讲稿共八十七页哦x1x2yRf的计算:Rf1=x1/yRf2=x2/y这样每一个斑点用两个Rf来描述第二十七页,讲稿共八十七页哦b.定量剪洗法:将斑点剪下,用适当的溶剂洗脱,然后用各种仪器方法(如红外、紫外、原子吸收、发射光谱),也可将斑点剪下灰化,再用适当的溶剂溶解,测之。比较法:经纸色谱将各种组份分开后,可在相同条件下,制得标准系列图谱,与待测斑点颜色、面积进行比较,确定其可能的含量。反射散射光谱法:第二十八页,讲稿共八十七页哦物质受光照射时,通常发生两种不同的反射现象(即镜面反射与散射)。镜面反射同镜子反射一样,光线不被物质吸收,反射角等于入射角;散射则必须满足Kubelka-M
11、unk方程式:其中,R=IR/I0,I0、IR分别为入射光与散射光强度,S为反射系数,K为线性吸收系数,为被测物的摩尔吸光系数,C为被测物的物质的量浓度,K=/S。仪器上显示的反射散射吸收值为AR=lgI0/IR=lg1/R。由上可建立方程组:第二十九页,讲稿共八十七页哦(2)式代入(1)式,得:(3)式即为反射散射吸收光谱测量值F与C的定量关系;若以F为纵坐标、C为横坐标,则可得一截踞为2的直线,斜率为K。第三十页,讲稿共八十七页哦图1.反射散射附件的光路示意图M:反射镜;S:样品:PC:光电管1234sMPCM1长颈漏斗,2滤纸,3垫板,4抽滤瓶第三十一页,讲稿共八十七页哦F.应用例氨基酸
12、的分离(固定相为水)流动相分离情况正丁醇:2 mol/L HAc =1 :1酪氨酸、二碘酪氨酸用水饱和的苄醇亮氨酸、异亮氨酸叔丁醇:甲乙酮:甲酸:水16 :16:0.1 :3.9亮氨酸、异亮氨酸第三十二页,讲稿共八十七页哦流动相分离情况丁醇:醋酸:水32:2:22甲状腺素、二碘酪氨酸流动相:丁醇:HAc:H2O=4:1:5流动相:M甲酚酚:pH=9.33硼酸缓冲液=1 :1亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、酪氨酸、丙氨酸、脯氨酸、谷氨酸、苏氨酸、门冬氨酸、谷氨酰酸、门冬酰氨、精氨酸、组氨酸、赖氨酸、胱氨酸等第三十三页,讲稿共八十七页哦例2.糖的分离(固定相为水)流动相分离情
13、况醋酸乙脂:吡啶:水=2:1:1木糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖丁醇:吡啶:水=45:25:40乳糖、半乳糖、葡萄糖丁醇:乙醇:水:NH3=40:10 :49:1尿中葡萄糖丁醇:乙醇:水=10:1:2蜜二糖、果糖、葡萄糖、第三十四页,讲稿共八十七页哦流动相分离情况流动相:酚流动相:丁醇:醋酸:水=1:1:1鼠李糖、核糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖、乳糖、半乳糖醛酸丁醇:乙醇:水=4:1:5低聚糖75%2丙醇:醋酸9:1直链淀粉丁醇:吡啶:水:苯=50:30:3:45棉子糖第三十五页,讲稿共八十七页哦例脂肪酸的分离(固定相为水)流动相分离情况95%乙醇:浓氨水100:1同系的直链脂肪酸
14、正己醇:1.5 mol/L 氨水1:1烷氧基酸流动相1:乙醇:浓氨水:H2O=80:5:15流动相2:乙二醇乙醚:桉树脑:88%甲酸=5:5:2草酸、酒石酸、柠檬酸、苹果酸、羟基醋酸、顺丁烯二酸、丙二酸、乳酸、琥珀酸、乌头酸、己二酸、延胡索酸、葵二酸第三十六页,讲稿共八十七页哦流动相分离情况丁醇:醋酸:水 4:1:5甲胺、乙胺、丙胺、丁胺、戊胺、苯苄胺甲醇:戊醇:苯:水4:2:2:2萘胺、间苯二胺、对苯二胺、苯胺丁醇:1.5 mol/L 氨水1:1C7以下的脂肪酸例4.胺类的分离(固定相为水)第三十七页,讲稿共八十七页哦例5.醇、酚的分离(固定相为水)流动相分离情况丁醇:5%NaHCO3 1:
15、1甲醇、乙醇、异丙醇、异丁醇、异戊醇、辛醇己烷饱和甲醇乙醇、异丙醇、丙醇、异丁醇、正丁醇丁醇:乙醇:水 4:1.1:1.9乙二醇、丙三醇、甘露糖醇、山梨醇、肌醇第三十八页,讲稿共八十七页哦流动相分离情况丁醇:醋酸:水 4:1:5苯甲酸、儿茶酚、肉桂酸、邻香豆酸、没食子酸、间羟基苯甲酸、对羟基苯甲酸、5-甲基苯二酚、间苯三酚、2,4,6三羟基苯甲酸、2,4二羟基苯甲酸、1,2,3苯三酚、对苯二酚、间苯二酚、羟基苯甲酸、邻羟基苯甲酸、香草酸第三十九页,讲稿共八十七页哦例核酸降解物(核苷酸、嘌呤、嘧啶碱基)的分离(固定相为水)流动相分离情况饱和(NH4)2SO4:水:2丙醇 79:10:2鸟嘌呤、腺
16、嘌呤、胞苷正丁醇:水:乙二醇:醋酸5:1:5:2AMP、ADP、ATP正丁醇:二苷酸:0.1 mol/L HCl4:1:1黄嘌呤、鸟嘌呤正丁醇:二苷酸:水4:1:1腺嘌呤、次黄嘌呤第四十页,讲稿共八十七页哦例.其它类的分离(固定相为水)流动相分离情况正丁醇:浓氨水:水4:1:5磺胺嘧啶、磺胺噻睉、磺胺嘧啶、磺胺噻睉、SulfamerzineSulfamerzine、p,pp,p-sulfonyldianiline-sulfonyldianiline正丁醇:醋酸:水 4:1:5对胺基苯甲酸、维生素C、N甲基菸酰胺、菸碱酰胺、菸酸、潘妥宁、泛酸、VB6、VB1VB甲苯:石油醚:乙醇:水200:10
17、0:30:70200:100:30:70雌酮、雌二酮、雌三酮、马烯雌酮、脱氢皮质甾酮酸、孕甾酮、顺式睾丸甾酮第四十一页,讲稿共八十七页哦流动相分离情况丁醇:浓盐酸98:2阿托品、莨菪胺、后马托品、莨菪碱、d古苛碱、d假古苛碱、托把柯卡因、金雀花碱、高金雀花碱、吗啡、可待因、蒂巴因、海洛因、那可叮、可它宁、北美黄莲碱、马钱子碱、二甲马钱子碱、奎咛、辛可宁、辛可宁啶、毛果碱、异毛果碱、毛果心碱、菸碱、吡啶、胆碱、乙酰胆碱、波尔啶碱、槟榔碱第四十二页,讲稿共八十七页哦例8无机应用(固定相为水)流动相分离情况12 mol/LHCl:甲醇:丁醇:甲基异丁酮55:35:5:5K+、Rb+、Cs+乙醇:水8
18、0:20Li+、Na+、K+10%HCl的水饱和丁醇Zn 2+Ga 3+In 3+Al 3+苯酚:甲醇:HCl 5:3:2Al 3+Ga 3+In 3+Tl 3+第四十三页,讲稿共八十七页哦流动相分离情况丁醇:HAc:乙酸乙脂:水10 :2:1:7从Fe、Al、Ti中分离出Ga乙酸乙脂:水:HNO385:10:5从稀土、Zr、Ti、Th中分离出Sc乙醚:浓HNO3 87.5:12.5HfZr4 mol/L HCl 饱和丁醇 UO2Th第四十四页,讲稿共八十七页哦例9生物学应用FeCuCoNiNiNiNiTiMo黑毛红毛黄毛白毛兔毛的色谱图毛发是这样,皮肤是否是这样?取不同颜色兔毛(300500
19、mg),干法灰化,溶于稀HCl中,用丙酮:丁醇:HCl=10:4:2,展开后,显色第四十五页,讲稿共八十七页哦用纸色谱法分离A、B两种物质,在某条件下两物质的比移值Rf分别为0.36、0.40。设A、B两物质斑点的直径分别为0.2 cm,0.4 cm,当展开剂的前沿达到10 cm时,A、B能否完全分离?设A、B两物质色谱斑点的中心距原点分别为x1,x 2 cm,则x1/10=0.36 x2/10=0.40 x2-x1=(0.40-0.36)10=0.4(cm)欲分离两物质,两斑点中心距离至少为(0.20+0.40)/2=0.30cm,而实际两斑点中心距离为0.4 cm,故在此条件下A B两物质
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