第二章基因工程的工具酶.ppt

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1、第二章基因工程的工具酶现在学习的是第1页，共28页1.工具酶的概念工具酶的概念应用与基因工程的各种酶的总称应用与基因工程的各种酶的总称.大量应用的是核酸酶大量应用的是核酸酶.切切:限制性内切酶限制性内切酶连连:DNA连接酶连接酶修饰酶，聚合酶修饰酶，聚合酶现在学习的是第2页，共28页http:/ Escherichia coli流感嗜血菌 Haemophilus influenzae短杆菌 Brevibacterium albidum 粘质沙雷式菌 Serratia marcescens现在学习的是第6页，共28页同一菌种具有不同的菌株或菌型基本名称 菌株或菌型(小写)大肠杆菌k型菌株 Eco

2、k流感嗜血菌d型菌株 Hind限制酶由染色体外的成分，如病毒、质粒等引起基本名称 质粒、病毒的辅助字母EcoR现在学习的是第7页，共28页某一菌株具有多个不同的限制酶体系，用罗马字母表示发现的先后顺序Hind II:EcoR I:现在学习的是第8页，共28页有的限制酶前冠以系统名R：限制性核酸内切酶，常省略M：甲基化酶R.Hind IIIM.Hind III现在学习的是第9页，共28页限制酶的识别位点II型限制酶的识别系统识别46个碱基对，一般富含GC；少数识别6个以上的碱基对，为稀有酶识别序列具有回文结构识别序列严格，少数仅识别一二位专一现在学习的是第10页，共28页限制酶剪切方式产生5突出

3、的黏性末端产生5突出的黏性末端产生平齐末端现在学习的是第11页，共28页II型限制酶的反应条件U-一个单位的限制性内切酶合适的温度和缓冲液，20 ul体系，1 h降解1ug DNA所需酶量注意酶的稀释与保存现在学习的是第12页，共28页影响限制酶活性的因素DNA纯度DNA甲基化程度酶切反应的温度DNA的分子结构缓冲液现在学习的是第13页，共28页3.DNA连接酶连接酶连接酶的作用是：将互补配对的两个黏性末连接酶的作用是：将互补配对的两个黏性末端连接起来，使之成为一个完整的端连接起来，使之成为一个完整的DNA分分子。子。在在DNA复制、修复及体内外重组过程中起着复制、修复及体内外重组过程中起着重

4、要作用。重要作用。现在学习的是第14页，共28页连接机理连接机理一条DNA链上的3游离羟基与另一条DNA链上的5末端磷酸基团形成3,5-磷酸二脂键。现在学习的是第15页，共28页DNA连接酶的种类(1).T4噬菌体噬菌体DNA连接酶连接酶 不受不受dNTP的抑制，催化的抑制，催化DNA片断的连接。片断的连接。(2).E.coli DNA连接酶连接酶 不能连接平端不能连接平端DNA,不能连接不能连接RNA。现在学习的是第16页，共28页 T4噬菌体噬菌体DNA连接酶连接酶广泛应用，可以连接：两个带有互补黏性末端的双链DNA分子两个带有平头末端的双链DNA分子一条链带有切口的双链DNA分子RNA-

5、DNA杂合体中RNA链切口，RNA末端与DNA连接现在学习的是第17页，共28页DNA连接酶反应体系1230下反应116h。黏性末端：1216，保证退火、酶活性、反应速率间的平衡平头末端：1020，10100倍酶量终止反应：EDTA或75水浴现在学习的是第18页，共28页影响连接反应的因素影响连接反应的因素DNA末端的结构DNA片段浓度相对分子量反应温度离子浓度现在学习的是第19页，共28页4.DNA聚合酶催化合成DNA的反应的酶现在学习的是第20页，共28页DNA聚合酶分类依赖DNA的聚合酶大肠杆菌DNA聚合酶I 大肠杆菌DNA聚合酶I的的Klenow大片段大片段酶T4 DNA聚合酶T7 D

6、NA聚合酶Taq DNA聚合酶依赖于RNA的DNA聚合酶逆转录酶现在学习的是第21页，共28页依赖DNA的DNA聚合酶(1)大肠杆菌DNA聚合酶I（E.coli DNA pol I)：具有三种酶活性a、5-3DNA聚合酶活性CCGATA-OH E.coli DNA pol I CCGATAGCCTGGCTATCGGA Mg2+dNTP GGCTATCGGAb、3-5 外切酶活性-校正作用CGCATCG-OH E.coli DNA pol I CGC ATCGGCG Mg2+dNTP GCGc、5-3外切酶活性CGCATTAG E.coli DNA pol I CATTAGGCGTAATC Mg

7、2+GCGTAATC现在学习的是第22页，共28页大肠杆菌DNA聚合酶I制备制备杂交探针。杂交探针。Mg2+，低浓度DNA聚合酶I，同位素标记的核苷，同位素标记的核苷酸酸处理双链DNA产生单链DNADNA聚合酶I53外切酶活性和聚合酶活性同外切酶活性和聚合酶活性同时发生，产生时发生，产生切口平移切口平移，形成带标记的，形成带标记的DNA分分子子现在学习的是第23页，共28页(2).Klenow酶：也称DNA聚合酶I大片段，只是从DNA聚合酶I全酶中去除了5-3外切酶活性Klenow酶的基本用途：a.补平由核酸内切酶产生的5粘性末端b.DNA片段的同位素末端标记c.cDNA第二链的合成d.双脱氧

8、末端终止法测定DNA序列现在学习的是第24页，共28页(3)Taq DNA聚合酶：耐热的DNA聚合酶PCR反应扩增所需酶具5-3聚合酶活性和3-5外切酶活性（4）逆转录酶体外mRNA为模板合成互补的DNA现在学习的是第25页，共28页5.碱性磷酸酶碱性磷酸酶去除去除DNA或者或者RNA的的5磷酸，可防止自身环磷酸，可防止自身环化。化。5pDNA 5OHDNA 5pRNA 5OHRNA现在学习的是第26页，共28页6.末端转移酶末端转移酶分子量分子量60000D,在二价阳离子的作用下，催化在二价阳离子的作用下，催化dNTP加于加于DNA分子的分子的3羟基端。羟基端。底物：底物：带带3羟基端单链羟基端单链DNA或带或带3羟基突出端的羟基突出端的双链双链DNA。现在学习的是第27页，共28页7.核酸酶核酸酶S1S1核核酸酸酶酶的的基基本本特特性性：来来自自稻稻谷谷曲曲霉霉菌菌（Aspergillus oryzae）水水解解单单链链核核酸酸以以及及双双链链核核酸酸中中的的单单链链区区或或单单链链末末端端，产产生生5核苷酸和核苷酸和5末端为末端为p的寡核苷酸。的寡核苷酸。Zn2+必需必需,最适最适pH范围为范围为4.0-4.3,需要需要NaCl 10-300 mM.降解单链降解单链DNA的速度比降解双链的速度比降解双链DNA快快75000倍倍现在学习的是第28页，共28页