叶绿体色素含量测定.ppt

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1、关于叶绿体色素含量的测定第一张，PPT共三十一页，创作于2022年6月实实 验验 目目 的的 叶片的叶绿素含量直接影响着光合速率，并与氮素营养叶片的叶绿素含量直接影响着光合速率，并与氮素营养有密切的关系，在栽培、生理、农化、育种等研究上是有密切的关系，在栽培、生理、农化、育种等研究上是重要的诊断指标，常需测定和控制叶绿素含量。重要的诊断指标，常需测定和控制叶绿素含量。掌握使用分光光度计定量测定叶绿素含量掌握使用分光光度计定量测定叶绿素含量第二张，PPT共三十一页，创作于2022年6月叶绿素含量测定方法叶绿素含量测定方法叶绿素的含量测定方法有多种，其中主要有：叶绿素的含量测定方法有多种，其中主要

2、有：1.原子吸收光谱法：通过测定镁元素的含量，进而间接原子吸收光谱法：通过测定镁元素的含量，进而间接计算叶绿素的含量计算叶绿素的含量2.分光光度法：利用分光光度计测定叶绿素提取液在最大吸分光光度法：利用分光光度计测定叶绿素提取液在最大吸收波长下的吸光值，即可用朗伯收波长下的吸光值，即可用朗伯-比尔定律计算出提取液比尔定律计算出提取液中各色素的含量中各色素的含量第三张，PPT共三十一页，创作于2022年6月实实 验验 原原 理理 1根据根据朗伯朗伯-比尔定律比尔定律 当一束单色光通过溶液时，溶液的吸光度与溶液当一束单色光通过溶液时，溶液的吸光度与溶液的浓度和液层厚度的乘积成正比。的浓度和液层厚度

3、的乘积成正比。即：即：A=K*L*CA=K*L*C K K：比吸收系数：比吸收系数 L L：液层厚度：液层厚度 C C：溶质浓度：溶质浓度 (克克/L)第四张，PPT共三十一页，创作于2022年6月比吸收系数比吸收系数()的物理意义的物理意义Lambert-Beer 定律中的比例系数定律中的比例系数“K”的物理意义是：的物理意义是：吸光物质在单位浓度、单位液层厚度时的吸光度吸光物质在单位浓度、单位液层厚度时的吸光度第五张，PPT共三十一页，创作于2022年6月比吸收系数比吸收系数()的性质的性质n 与溶液的浓度和液层厚度无关，与与溶液的浓度和液层厚度无关，与吸光物质的特性吸光物质的特性及及光的

4、波光的波长长等有关，也受温度和溶剂的影响。等有关，也受温度和溶剂的影响。n 对于同一波长下，当其他条件一定时对于同一波长下，当其他条件一定时(温度、溶剂等温度、溶剂等)，的的大小取决于物质的性质。大小取决于物质的性质。n 对于同一物质，当其他条件一定时对于同一物质，当其他条件一定时(温度、溶剂等温度、溶剂等)，的大小取的大小取决于波长。决于波长。nn 能表示能表示物质对某一波长的光的吸收能力物质对某一波长的光的吸收能力。n越大越大，表明物质对某波长的光吸收能力，表明物质对某波长的光吸收能力越强越强。第六张，PPT共三十一页，创作于2022年6月实实 验验 原原 理理 2吸光度的加和性吸光度的加

5、和性如果溶液中有数种吸光物质，则此混合液如果溶液中有数种吸光物质，则此混合液在某一波长下的总吸光度等于各组分在相在某一波长下的总吸光度等于各组分在相应波长下吸光度的总和应波长下吸光度的总和即：即：A=A1+A2+An第七张，PPT共三十一页，创作于2022年6月n叶绿体色素提取液中叶绿体色素提取液中叶绿素叶绿素a、b和类胡萝卜素和类胡萝卜素;n只需测定该溶液在三个特定波长下的吸光度只需测定该溶液在三个特定波长下的吸光度;n根据这三个色素在该波长下的吸光系数即可求出其浓根据这三个色素在该波长下的吸光系数即可求出其浓度度第八张，PPT共三十一页，创作于2022年6月红光区红光区蓝紫光区蓝紫光区64

6、5nm663nm叶绿素叶绿素a:663nm 处最大吸收峰；处最大吸收峰；叶绿素叶绿素b:645nm 处最大吸收峰；且两处最大吸收峰；且两吸收曲线相交于吸收曲线相交于652nm 处处第九张，PPT共三十一页，创作于2022年6月类类胡萝卜素胡萝卜素吸收兰紫光，不吸收红光等长吸收兰紫光，不吸收红光等长 波长的光波长的光 叶绿素叶绿素吸收红光、兰紫光吸收红光、兰紫光在测定叶绿素在测定叶绿素a、叶绿素、叶绿素b时，为了排除类胡萝时，为了排除类胡萝卜素的干扰，所用单色光的波长选择叶绿素卜素的干扰，所用单色光的波长选择叶绿素在红光区的最大吸收峰。在红光区的最大吸收峰。第十张，PPT共三十一页，创作于202

7、2年6月叶绿素叶绿素a a和叶绿素和叶绿素b b的的80%80%丙酮溶液，当丙酮溶液，当浓度在浓度在1g/L1g/L时，比时，比吸收系数吸收系数k k值值:波长波长（nm）K值值叶绿素叶绿素a叶绿素叶绿素b66382.049.2764516.7545.60645nm663nm第十一张，PPT共三十一页，创作于2022年6月据此可列出下列方程式：据此可列出下列方程式：A A663663、A A645645分别为叶绿素溶液在波长分别为叶绿素溶液在波长663663、645nm645nm处的光密度处的光密度;CaCa、CbCb分别为叶绿素分别为叶绿素a a、b b的浓度的浓度(单位单位:克克/升升)A

8、663=A叶绿素叶绿素a +A叶绿素叶绿素bA663=Ka L Ca+Kb L CbA663=82.04 Ca+9.27 Cb(1)A645=16.75 Ca+45.6 Cb(2)第十二张，PPT共三十一页，创作于2022年6月将上式整理，可以得到下式：将上式整理，可以得到下式：Ca(g/L)=0.0127A663-0.00269A645（3）Cb(g/L)=0.0229A645-0.00468A663（4）将叶绿素的浓度将叶绿素的浓度改为改为mg/L，则上式变为：则上式变为：Ca(mg/L)=12.7A663-2.69A645（5）Cb(mg/L)=22.9A645-4.68A663（6）C

9、T=Ca+Cb=8.02A663+20.21A645（7）CT为叶绿素的总浓度为叶绿素的总浓度第十三张，PPT共三十一页，创作于2022年6月红光区红光区蓝紫光区蓝紫光区645nm663nm470nm第十四张，PPT共三十一页，创作于2022年6月类胡萝卜素含量的测定类胡萝卜素含量的测定n在叶绿素存在的条件下，用分光光度法可同时测定溶在叶绿素存在的条件下，用分光光度法可同时测定溶液中的类胡萝卜素含量液中的类胡萝卜素含量n在在80丙酮提取液中三种色素含量的计算公式丙酮提取液中三种色素含量的计算公式 (单位：单位：mg/L)：nC类胡萝卜素类胡萝卜素=(1000A470 3.27Ca 104Cb)

10、/229第十五张，PPT共三十一页，创作于2022年6月由于叶绿体色素在不同溶剂中的吸收光谱由于叶绿体色素在不同溶剂中的吸收光谱有差异，因此，使用其他溶剂提取色素时，有差异，因此，使用其他溶剂提取色素时，计算公式有所不同计算公式有所不同第十六张，PPT共三十一页，创作于2022年6月实验材料实验材料与器材与器材实验材料实验材料：青菜：青菜 实验器材实验器材：50ml50ml容量瓶、小漏斗，容量瓶、小漏斗，5ml5ml移液管一只，移液管一只，研钵一套，剪刀一把，滤纸，天平，研钵一套，剪刀一把，滤纸，天平，722722型分光光度型分光光度计计 实验试剂：实验试剂：80%80%丙酮丙酮 第十七张，P

11、PT共三十一页，创作于2022年6月实验步骤实验步骤 11 1.鲜叶洗净，吸水纸吸干，称取鲜叶洗净，吸水纸吸干，称取0.50.5克克（避开主叶脉）（避开主叶脉）剪碎置于研钵中加少量石英砂和剪碎置于研钵中加少量石英砂和80%80%丙酮（约丙酮（约2-3ml2-3ml）研成匀浆；）研成匀浆；2.2.倒入约倒入约20ml 80%20ml 80%丙酮，静置丙酮，静置1010分钟；分钟；3.3.将上清液沿玻棒移入过滤的漏斗中将上清液沿玻棒移入过滤的漏斗中（滤纸用（滤纸用80%80%的丙酮的丙酮湿润）湿润），滤入，滤入50ml50ml容量瓶容量瓶中；中；4.4.残渣留在研钵里，再用残渣留在研钵里，再用80

12、%80%丙酮反复提取丙酮反复提取2-32-3次，直至次，直至残渣变白无绿色；残渣变白无绿色；5.5.然后用丙酮液冲洗滤纸变白为止；然后用丙酮液冲洗滤纸变白为止；6.6.再用丙酮液再用丙酮液定容定容到刻度，即为叶绿素提取液。到刻度，即为叶绿素提取液。第十八张，PPT共三十一页，创作于2022年6月实验步骤实验步骤 2将上述提取液注入将上述提取液注入1cm1cm光径的比色皿中光径的比色皿中 （以（以80%80%丙酮液为对照）丙酮液为对照）用分光光度计分别在用分光光度计分别在645nm645nm、663nm663nm、470nm470nm处读取光密度。处读取光密度。第十九张，PPT共三十一页，创作于

13、2022年6月Ca=12.7A663-2.69A645Cb=22.9A645-4.68A663(单位：单位：mg/L)C类胡萝卜素类胡萝卜素=(1000A470 3.27Ca 104Cb)/229第二十张，PPT共三十一页，创作于2022年6月实验步骤实验步骤 3n将读取的光密度将读取的光密度A A645645和和A A663663，计算提取液叶绿素，计算提取液叶绿素a a、b b和和类胡萝卜素类胡萝卜素的浓的浓度或叶绿素的总浓度，然后按下式计算叶绿素度或叶绿素的总浓度，然后按下式计算叶绿素类胡萝卜素类胡萝卜素在叶片中的含在叶片中的含量：量：n叶绿素含量或叶绿素含量或类胡萝卜素类胡萝卜素(鲜重

14、鲜重%)=%)=n或：叶绿素含量或或：叶绿素含量或类胡萝卜素类胡萝卜素(毫克毫克/克鲜重克鲜重)=)=第二十一张，PPT共三十一页，创作于2022年6月实验步骤实验步骤叶片洗净、吸干、去大叶脉叶片洗净、吸干、去大叶脉称称0.5g叶叶,用用80%丙酮研磨丙酮研磨匀浆过滤（用匀浆过滤（用80%丙酮洗研钵及残渣，合并滤液）丙酮洗研钵及残渣，合并滤液）滤液用滤液用80%丙酮定容到丙酮定容到50ml测测A645、A663、A470 计算浓度和含量计算浓度和含量第二十二张，PPT共三十一页，创作于2022年6月实验结果实验结果第二十三张，PPT共三十一页，创作于2022年6月注意事项注意事项1.为了避免叶

15、绿素的光分解，操作时应在为了避免叶绿素的光分解，操作时应在弱光下弱光下进行，进行，研磨时间尽量短些研磨时间尽量短些2.注意叶绿素注意叶绿素一定要提取干净一定要提取干净，避免造成测定误差，避免造成测定误差3.叶绿素叶绿素提取液不能混浊提取液不能混浊4.分光光度计分光光度计转换波长时要重新调零转换波长时要重新调零5.实验过程中使用实验过程中使用同一台分光光度计测量同一台分光光度计测量第二十四张，PPT共三十一页，创作于2022年6月思考题思考题1 1、分光光度法与一般的比色法有何异同？、分光光度法与一般的比色法有何异同？2 2、叶绿素、叶绿素a a和和b b在蓝光区也均有最大吸收峰，能否用在蓝光区

16、也均有最大吸收峰，能否用这最大吸收峰波长进行叶绿素的定量测定分析？这最大吸收峰波长进行叶绿素的定量测定分析？为什么？为什么？第二十五张，PPT共三十一页，创作于2022年6月分光光度计使用方法分光光度计使用方法1.开启电源，指示灯亮，仪器预热开启电源，指示灯亮，仪器预热20分钟。分钟。2.波长调至测试用波长波长调至测试用波长。3.开盖开盖T调调0。（调节（调节“0”旋钮，使数字显示为旋钮，使数字显示为“00.0”）4.放入空白对照液，将光路对准空白对照位置放入空白对照液，将光路对准空白对照位置5.关盖关盖T调调100。（调节透过率（调节透过率“100%”旋钮，使数字显示为旋钮，使数字显示为“100.0”）6.调调A为为0。（调节吸光度调零旋钮，使得数字显示为（调节吸光度调零旋钮，使得数字显示为“.000”）7.将将被被测测样样品品移移入入光光路路，进进行行测测定定，显显示示值值即即为为被被测测样样品品的的吸吸光光度值。度值。第二十六张，PPT共三十一页，创作于2022年6月第二十七张，PPT共三十一页，创作于2022年6月第二十八张，PPT共三十一页，创作于2022年6月第二十九张，PPT共三十一页，创作于2022年6月第三十张，PPT共三十一页，创作于2022年6月感谢大家观看第三十一张，PPT共三十一页，创作于2022年6月