6酶化学学习教程.pptx

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1、23 三月 20231酶及化学本质酶的催化特性酶的组成及分类第一节 概 述第1页/共131页第一页，编辑于星期五：八点 十三分。23 三月 20232一、酶的概念1.酶是生物催化剂2.酶的化学本质绝大多数酶是蛋白质(蛋白质类酶 P）依据：少数酶是核酸RNA(核酸类酶 ribozyme 核酶 R）3.酶和生命活动密切相关参与生命过程生物进化和组织功能分化的基础酶的活性调节机制第2页/共131页第二页，编辑于星期五：八点 十三分。23 三月 20233酶的缺陷症苯丙酮尿症白化症鲟鱼第3页/共131页第三页，编辑于星期五：八点 十三分。23 三月 20234蛋白质类酶的发现历史1783年，意大利科学

2、家斯巴兰让尼1857年，巴斯德(Pasteur)就酒的发酵提出存在“ferments”（酵素）。1878年,库恩（Kuhne）提出Enzyme。1926年 美国 萨姆纳Sumner 从刀豆种子中提取了脲酶的结晶。19301936年，Northrop和Kunitz得到了胃蛋白酶、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶结晶。1949年Sumner 和Northrop共同获得诺贝尔化学奖。J.B.SumnerJ.H.Northrop第4页/共131页第四页，编辑于星期五：八点 十三分。23 三月 20235核酸类酶的发现（ribozyme ribozyme 核酶 R R）1982年,Cech等研究原生动物四膜虫。1

3、983年Altman 等人在研究细菌 RNase P(20%的蛋白质和80%的RNA组成)时发现Cech和Altman也因此获得了1989年的诺贝尔奖。Thomas Cech University of Colorado at Boulder,USA Sidney Altman Yale University New Haven,CT,USA 第5页/共131页第五页，编辑于星期五：八点 十三分。23 三月 20236二、酶的催化特性101页（一）酶和一般催化剂的比较共性：10-4 S-110-6 S-1AB反应速率常数（基态）（过渡态）（活化能）第6页/共131页第六页，编辑于星期五：八点

4、十三分。23 三月 20237（二）酶作为生物催化剂的特点1.酶易失活2.酶催化效率高转换数(Kcat)：是指在一定条件下每秒钟每个酶分子转换底物的分子数。3%过氧化氢溶液少许铁粉生马铃薯块反应速率常数为610-4mol/s反应速率常数为6106mol/s第7页/共131页第七页，编辑于星期五：八点 十三分。23 三月 20238第8页/共131页第八页，编辑于星期五：八点 十三分。23 三月 202393.酶具有高度专一性4.酶的活性受到调节和控制调节酶的浓度：诱导或抑制酶的合成；降解。通过激素调节酶活性：反馈抑制调节酶活性：抑制剂和激活剂对酶活性的调节：别构调控、酶原激活、酶的可逆共价修饰

5、和同工酶。第9页/共131页第九页，编辑于星期五：八点 十三分。23 三月 202310三、酶的组成及分类（蛋白类酶）1.按组成成分分单纯酶（简单蛋白质）结合酶（结合蛋白质）全酶(holoenzyme）=酶蛋白+辅因子决定酶反应的专一性及催化的高效率主要作用是作为电子、原子或某些基团的载体参与反应并促进整个催化过程。多数辅酶或辅基的前体物质是维生素表62第10页/共131页第十页，编辑于星期五：八点 十三分。23 三月 202311第11页/共131页第十一页，编辑于星期五：八点 十三分。23 三月 202312第12页/共131页第十二页，编辑于星期五：八点 十三分。23 三月 202313

6、2.2.根据酶的结构特点及分子组成形式分为单体酶（monomeric enzymes）卵溶菌酶第13页/共131页第十三页，编辑于星期五：八点 十三分。23 三月 202314寡聚酶（oligomeric enzymesoligomeric enzymes）第14页/共131页第十四页，编辑于星期五：八点 十三分。23 三月 202315第15页/共131页第十五页，编辑于星期五：八点 十三分。23 三月 202316第16页/共131页第十六页，编辑于星期五：八点 十三分。23 三月 202317多酶体系（multienzymes systemmultienzymes system）：由几个

7、功能相关的酶嵌合而成的复合体。E1E2E3E4EnABCDEP第17页/共131页第十七页，编辑于星期五：八点 十三分。23 三月 2023183.3.酶的命名与分类(1)习惯命名法(2)国际系统命名法（1961年国际生化学会）系统名应包括：底物（构型）、酶作用的基团、催化反应的类型习惯名称系统名称谷丙转氨酶丙氨酸 ：酮戊二酸氨基转移酶乙醇脱氢酶 乙醇：NAD+氧化还原酶第18页/共131页第十八页，编辑于星期五：八点 十三分。23 三月 202319（3）国际系统分类法及酶的编号（蛋白类酶）氧化还原酶（1）AH2BABH2转移酶（2）ABCABC水解酶（3）ABH2OAOHBH裂合酶（4）A

8、BAB异构酶（5）AB 连接酶或合成酶（6）：催化C-C、C-O、C-N 以及C-S 键的形成A AB BATPATPABABADPADPPiPi或 A AB BATPATPABABAMPAMPPPiPPi亚类编号依次为 1.2.3.4.5.6.亚亚类编号依次为 1.2.3.4.5.6.第19页/共131页第十九页，编辑于星期五：八点 十三分。23 三月 202320酶的编号的举例ATP葡萄糖磷酸转移酶(已糖激酶)EC 2.7.1.1 表示第二大类，即转移酶表示亚类，转移磷酸基团表示亚亚类，OH为受体表示此酶在此亚亚类中的顺序号第20页/共131页第二十页，编辑于星期五：八点 十三分。23 三

9、月 202321第二节 酶的结构与功能的关系酶的一级结构与催化功能的关系酶的高级结构与活性的关系第21页/共131页第二十一页，编辑于星期五：八点 十三分。23 三月 202322酶分子的结构特点裂缝、亲水区与疏水区、沟槽与洞穴。配体：酶的底物、辅酶或辅基、各种调节因子。第22页/共131页第二十二页，编辑于星期五：八点 十三分。23 三月 202323一、酶的一级结构与催化功能的关系1.必需基团常见的有：咪唑基、羟基(丝氨酸)、巯基2.酶原激活酶原与酶原激活：表633.共价修饰要求：修饰剂的要求，酶的要求，反应条件的要求。第23页/共131页第二十三页，编辑于星期五：八点 十三分。23 三月

10、 202324或胃蛋白酶肠激酶或胰蛋白酶胰蛋白酶糜蛋白酶胰蛋白酶胰蛋白酶第24页/共131页第二十四页，编辑于星期五：八点 十三分。23 三月 202325酶原激活胰蛋白酶原肠激酶 六肽胰蛋白酶弹性蛋白酶原胰凝乳蛋白酶原胰凝乳蛋白酶弹性蛋白酶羧肽酶原羧肽酶第25页/共131页第二十五页，编辑于星期五：八点 十三分。23 三月 202326胰凝乳蛋白酶原的激活第26页/共131页第二十六页，编辑于星期五：八点 十三分。23 三月 202327胰蛋白酶原的激活肠激酶酶活性中心第27页/共131页第二十七页，编辑于星期五：八点 十三分。23 三月 202328胃蛋白酶原激活过程第28页/共131页第

11、二十八页，编辑于星期五：八点 十三分。23 三月 202329酶级联反应：一种酶原的激活常常会引发一系列酶的激活，这样的系列激活反应称之酶级联反应。第29页/共131页第二十九页，编辑于星期五：八点 十三分。23 三月 202330共价修饰(1)体外常用的化学试剂有：二异丙基氟磷酸、碘乙酸、二硝基氟苯等(2)体细胞内磷酸化与脱磷酸乙酰化与脱乙酰甲基化与脱甲基腺苷化与脱腺苷等蛋白磷酸化酶蛋白激酶第30页/共131页第三十页，编辑于星期五：八点 十三分。23 三月 202331二、酶的活性与高级结构的关系1.活性中心（active center)酶分子中直接和底物结合并起催化反应的空间部位结合部位

12、催化部位决定酶专一性决定酶催化反应性质第31页/共131页第三十一页，编辑于星期五：八点 十三分。23 三月 202332245His57Ser195Asp10213161461494258182168例：胰凝乳蛋白酶的肽链折叠（示活性中心）Ser195（丝氨酸）His57（组氨酸）及Asp102（精氨酸）第32页/共131页第三十二页，编辑于星期五：八点 十三分。23 三月 202333第33页/共131页第三十三页，编辑于星期五：八点 十三分。23 三月 2023342.2.二、三级结构与活性中心的关系牛胰核糖核酸酶的拆分试验(RNase,水解RNA的酶)由124个氨基酸组成，有4对二硫键

13、。活性中心：119和12 位的组氨酸残基构成S肽（120）、S蛋白第34页/共131页第三十四页，编辑于星期五：八点 十三分。23 三月 202335酶活性中心的特点在酶分子的总体中只占小部分。是一个三维实体。催化部位一般只由23个氨基酸残基组成，结合部位的残基数因酶而异。表101。和底物的形状并不是正好互补，需-诱导契合。位于结构域或亚基之间的裂隙或是表面的凹陷部位。底物通过次级键结合到酶上。具有柔性或可运动性。第35页/共131页第三十五页，编辑于星期五：八点 十三分。23 三月 202336酶的必需基团与活性中心必需基团包括活性中心的基团对维持酶的活性中心的空间构象所必要的那些基团.第3

14、6页/共131页第三十六页，编辑于星期五：八点 十三分。23 三月 202337酶的调控部位(Regulatory site)(Regulatory site)。第37页/共131页第三十七页，编辑于星期五：八点 十三分。23 三月 202338CCCCCRR3.3.聚合与解聚(四级结构与酶活性的关系)第38页/共131页第三十八页，编辑于星期五：八点 十三分。23 三月 2023394.4.同工酶指能催化相同化学反应，但其酶蛋白本身的分子组成、结构、理化性质和免疫性能等方面都存在明显差异的一组酶。1959年Markert首次用电泳分离法发现动物的乳酸脱氢酶CH3CHOHCOONADCH3CC

15、OONADHHO乳酸丙酮酸LDH第39页/共131页第三十九页，编辑于星期五：八点 十三分。23 三月 202340乳酸脱氢酶同工酶（LDHLDH，存在于哺乳动物中的有五种）五种同工酶的亚基组成分别为H H H HH H H HH H HH H H M MH HH H M MM MH H M M MM M M M M M MM M M M第40页/共131页第四十页，编辑于星期五：八点 十三分。23 三月 202341M4 HM3 H2M2 H2M H3M H4第41页/共131页第四十一页，编辑于星期五：八点 十三分。23 三月 202342乳酸脱氢酶同工酶电泳图谱肝骨骼肌肾红细胞心肌阴级阳

16、级第42页/共131页第四十二页，编辑于星期五：八点 十三分。23 三月 202343研究同工酶的意义为细胞分化、发育、遗传等方面的研究提供了分子基础通过测定血清中某些酶的同工酶为某些疾病的诊断提供证据第43页/共131页第四十三页，编辑于星期五：八点 十三分。23 三月 202344第三节酶催化反应的机制酶促反应的本质酶反应机制第44页/共131页第四十四页，编辑于星期五：八点 十三分。23 三月 202345一、酶促反应的本质本质是降低反应的活化能。酶是如何工作的呢？第45页/共131页第四十五页，编辑于星期五：八点 十三分。23 三月 202346中间产物假说-酶的工作方式在酶催化的反应

17、中，第一步是酶与底物形成酶底物中间复合物。当底物分子在酶作用下发生化学变化后（过渡态），中间复合物再分解成产物和酶。E +S E-SE-S E-SE-S P +E过渡态物质注意：1.底物同酶结合成中间复合物是一种非共价结合 2.底物过渡态物质与酶的亲合力比底物更强第46页/共131页第四十六页，编辑于星期五：八点 十三分。23 三月 202347速度时间PESES中间产物假说证据 获得了结晶ES复合物第47页/共131页第四十七页，编辑于星期五：八点 十三分。23 三月 202348二、酶反应机制.酶作用专一性的机制 锁钥假说诱导契合假说.酶作用高效性的机制（17）第48页/共131页第四十八

18、页，编辑于星期五：八点 十三分。23 三月 202349.酶作用专一性的机制锁钥假说(lock and key hypothesis)：刚性模式,Emil Fisher提出第49页/共131页第四十九页，编辑于星期五：八点 十三分。23 三月 202350诱导契合假说（inducedinducedfit hypothesis)fit hypothesis)第50页/共131页第五十页，编辑于星期五：八点 十三分。23 三月 202351“三点结合”的催化理论第51页/共131页第五十一页，编辑于星期五：八点 十三分。23 三月 2023522.酶作用高效性的机制底物与酶的邻近效应与定向效应底物

19、形变和诱导契合共价催化酸碱催化金属离子催化作用多元催化和协同效应活性部位微环境的影响第52页/共131页第五十二页，编辑于星期五：八点 十三分。23 三月 2023531.1.底物与酶的邻近效应与定向效应(反应速率提高10108 8)邻近效应：ES的形成分子内反应定向效应：反应基团之间的正确取位第53页/共131页第五十三页，编辑于星期五：八点 十三分。23 三月 2023542.2.底物形变和诱导契合第54页/共131页第五十四页，编辑于星期五：八点 十三分。23 三月 2023553.3.共价催化(covalent catalysis)(covalent catalysis)110110页

20、亲核催化剂或亲电子催化剂酶中参与共价催化的基团主要包括 His 的咪唑基，Cys 的硫基，Asp 的羧基，Ser 的羟基等.第55页/共131页第五十五页，编辑于星期五：八点 十三分。23 三月 2023564.4.酸碱催化(acid-base catalysis)(acid-base catalysis)广义酸碱与狭义酸碱氨基、羧基、硫氢基、酚羟基及咪唑基表His 的咪唑基是酶的酸碱催化作用中最活泼的一个催化功能团第56页/共131页第五十六页，编辑于星期五：八点 十三分。23 三月 202357广义酸基团广义酸基团 广义碱基团广义碱基团（质子供体）（质子供体）（质子受体）（质子受体）第57

21、页/共131页第五十七页，编辑于星期五：八点 十三分。23 三月 202358第58页/共131页第五十八页，编辑于星期五：八点 十三分。23 三月 2023595.5.金属离子催化作用需金属的酶分类：金属酶；金属激活酶；金属离子参加催化作用途径第59页/共131页第五十九页，编辑于星期五：八点 十三分。23 三月 202360第60页/共131页第六十页，编辑于星期五：八点 十三分。23 三月 202361第四节 酶促反应动力学111页基本问题：反应进行的方向、可能性和限度；反应进行的速率和反应机制。化学动力学的研究：理论上：阐明化学反应的机制(过程和途径)。应用上：根据反应速率来估计反应进

22、行到某种程度所需的时间；也可根据影响反应因素进一步对反应进行控制。第61页/共131页第六十一页，编辑于星期五：八点 十三分。23 三月 202362反应速率及其测定测定不同时间的底物的减少和产物的生成量。tvtv第62页/共131页第六十二页，编辑于星期五：八点 十三分。23 三月 202363酶促反应的影响因素底物浓度对酶促反应速率的影响酶浓度对酶促反应速率的影响温度对酶促反应速率的影响pH对酶酶促反应速率的影响激活剂对酶促反应速率的影响抑制剂对酶促反应速率的影响第63页/共131页第六十三页，编辑于星期五：八点 十三分。23 三月 202364一、底物浓度对酶促反应速率的影响1.酶促反应

23、动力学（单底物）2.酶促反应的动力学方程式（单底物）3.Vmax 和Km第64页/共131页第六十四页，编辑于星期五：八点 十三分。23 三月 2023651.1.反应动力学第65页/共131页第六十五页，编辑于星期五：八点 十三分。23 三月 2023662.2.动力学方程式(单底物反应）E +S ES P +EK1K3K21913年，德国化学家Michaelis和Menten根据中间产物学说对酶促反映的动力学进行研究，推导出米氏方程。Km=K2+K3K1令第66页/共131页第六十六页，编辑于星期五：八点 十三分。23 三月 202367米氏方程的推导根据中间产物学说，酶促反应分两步进行引

24、入了三个假设：在反应初期阶段EPES可忽略SE，则S ES 约等于 S 反应处于动态平衡时，ES的生成速度与分解速度相等。E +S ES P +EK1K3K2K4第67页/共131页第六十七页，编辑于星期五：八点 十三分。23 三月 2023703.3.K Km m（米氏常数）和V Vmaxmax （最大反应速度）式中Km是ES的分解速度和形成速度的比值。当V V=1/2 =1/2 V Vmax,max,K Km=Sm=S，故Km为酶促反应速率达到最大反应速率一半时的底物浓度.(mol/L)VKm+SVmax SKm=K2+K3K1第70页/共131页第七十页，编辑于星期五：八点 十三分。23

25、 三月 202371(1)K(1)Km m值的求法第71页/共131页第七十一页，编辑于星期五：八点 十三分。23 三月 202372LineweaverLineweaverBurkBurk的作图法 双倒数作图法VKm+SVmax S第72页/共131页第七十二页，编辑于星期五：八点 十三分。23 三月 202373通过实验测定Km和Vmax的方法第73页/共131页第七十三页，编辑于星期五：八点 十三分。23 三月 202374(2)K(2)Km m是酶学研究中的重要数据是酶的特征性常数：对于特定的反应和特定的反应条件而言。它只与酶的性质有关而与酶的浓度无关。不同的酶，具有不同的Km。（。（

26、115页表页表6-5）当k3 极小时，Km值大小可表示酶与底物之间的亲和力高低。E +S ES P +EK1K3K2K4Km=（k2k3）/k1第74页/共131页第七十四页，编辑于星期五：八点 十三分。23 三月 202375对活细胞的实验表明酶的底物浓度通常就在这种底物的Km值附近不是大大高于或大大低于Km?第75页/共131页第七十五页，编辑于星期五：八点 十三分。23 三月 202376（3 3）酶的K Km m值与米氏方程的实际用途鉴定酶判断酶的最适底物或称天然底物计算一定速率下的底物浓度了解酶的底物在体内具有的浓度水平判断反应方向或趋势判断抑制类型推测代谢途径和限速步骤第76页/共

27、131页第七十六页，编辑于星期五：八点 十三分。23 三月 202377例：如某一反应要求的反应速率达到最大反应速度的99%，则S=？Km如：当S=3Km时，可求反应速率相当于Vmax的百分数为？酶1，2，3分别催化 A B C D，Km分别为10-2,10-3,10-4，A，B，C 浓度均为10-4，限速步骤？丙酮酸可被乳酸脱氢酶、丙酮酸脱氢酶和丙酮酸脱羧酶催化，Km分别为 1.710-5、1.310-3和 1.010-3mol/L，当丙酮酸浓度较低时，走哪条途径？第77页/共131页第七十七页，编辑于星期五：八点 十三分。23 三月 202378二、酶浓度对酶促反应速率的影响底物浓度大大超

28、过酶浓度。机理 酶浓度增加，？增加。ES第78页/共131页第七十八页，编辑于星期五：八点 十三分。23 三月 202379三.温度对酶促反应速率的影响最适温度动物3540植物与微生物3060、少数酶可达60以上。温度系数Q10、机理 双重影响第79页/共131页第七十九页，编辑于星期五：八点 十三分。23 三月 202380高温杀菌与低温保鲜的生化机理？第80页/共131页第八十页，编辑于星期五：八点 十三分。23 三月 202381四.pH对酶促反应速率的影响酶的最适pH第81页/共131页第八十一页，编辑于星期五：八点 十三分。23 三月 202382pH对酶促反应速率的影响机理1、影响

29、酶和底物的解离2.影响酶分子的构象变化（影响与底物亲合）或引起酶的变性失活。决定酶催化反应性质酶的提纯及测活时要选择酶的稳定pH,通常在某一缓冲液中进行？第82页/共131页第八十二页，编辑于星期五：八点 十三分。23 三月 202383五.激活剂对酶反应速率的影响激活剂(activator)大部分是离子或简单的有机化合物。酶的必需激活剂与非必需激活剂 第83页/共131页第八十三页，编辑于星期五：八点 十三分。23 三月 202384六、抑制剂对酶促反应速率的影响 抑制剂失活作用、去激活作用、酶活性降低抑制作用指酶的必需基团的性质受到某些化 学物质（抑制剂）的影响而发生改变，导致酶活性的降低

30、或丧失。第84页/共131页第八十四页，编辑于星期五：八点 十三分。23 三月 202385抑制剂（inhibitor)-inhibitor)-一般具备两个方面的特点在化学结构上与被抑制的底物分子或底物的过渡状态相似。能够与酶的活性中心以外的必需部位或别构部位结合。第85页/共131页第八十五页，编辑于星期五：八点 十三分。23 三月 2023861 1抑制作用的类型不可逆抑制作用（irreversible inhibition)可逆抑制作用(reversible inhibition)第86页/共131页第八十六页，编辑于星期五：八点 十三分。23 三月 202387（1 1）不可逆抑制作用

31、（irreversible irreversible inhibition)inhibition)抑制剂与酶的必需基团以共价形式结合，引起酶的活力丧失。不能通过透析等方法除去抑制剂而复活。非专一性不可逆抑制专一性不可逆抑制第87页/共131页第八十七页，编辑于星期五：八点 十三分。23 三月 202388常见不可逆抑制剂有机磷化合物：可与酶活力有关的丝氨酸的羟基结合有机汞、有机砷化物、重金属盐：可与酶的SH结合金属螯合剂：EDTA（乙二胺四乙酸）可除去重金属离子烷化试剂：可与酶巯基、氨基、羧基、咪唑基和硫醚基氰化物、硫化物和CO：可与酶中金属离子形成络合物青霉素：与糖肽转肽酶活性部位丝氨酸羟基

32、结合第88页/共131页第八十八页，编辑于星期五：八点 十三分。23 三月 202389DFP、1605、敌百虫有机磷化物作用：胆碱酯酶解毒剂PAM(解磷定)含 CH=NOH第89页/共131页第八十九页，编辑于星期五：八点 十三分。23 三月 202390神经肌接头放大示意图接头前膜小泡中含乙酰胆碱神经末梢肌纤维接头后膜第90页/共131页第九十页，编辑于星期五：八点 十三分。23 三月 202391（2 2）可逆抑制作用(reversible inhibition)抑制剂与酶以非共价方式结合，引起酶活性暂时性丧失。抑制剂可以通过透析等方法被除去，并且能部分或全部恢复酶的活性。即抑制剂与酶的

33、结合是可逆的。竞争性抑制非竞争性抑制反竞争性抑制第91页/共131页第九十一页，编辑于星期五：八点 十三分。23 三月 202392竞争性抑制作用第92页/共131页第九十二页，编辑于星期五：八点 十三分。23 三月 202393丙二酸、苹果酸及草酰乙酸皆和琥珀酸的结构相似，是琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制剂。琥珀酸脱氢酶第93页/共131页第九十三页，编辑于星期五：八点 十三分。23 三月 202394磺胺药抑菌机理第94页/共131页第九十四页，编辑于星期五：八点 十三分。23 三月 202395利用竞争性抑制的原理设计药物过度态底物ES ES ES EP设计过渡态底物类似物抑制剂？第95页/共

34、131页第九十五页，编辑于星期五：八点 十三分。23 三月 202396非竞争性抑制作用第96页/共131页第九十六页，编辑于星期五：八点 十三分。23 三月 202397反竟争性抑制作用第97页/共131页第九十七页，编辑于星期五：八点 十三分。23 三月 2023983.抑制作用的动力学 Km和Vmax的变化竞争性抑制作用的速率方程第98页/共131页第九十八页，编辑于星期五：八点 十三分。23 三月 202399竞争性抑制作用曲线及特点Km值增大，且Km值随I的增高而增大；在E固定时，当S Km(1+I/Ki),则v=Vmax能通过增加底物浓度来消除或降低抑制剂的作用。第99页/共131

35、页第九十九页，编辑于星期五：八点 十三分。23 三月 2023100非竞争性抑制作用的速率方程第100页/共131页第一百页，编辑于星期五：八点 十三分。23 三月 2023101非竞争性抑制作用曲线及特点Km值不变，V值随I的增高而降低；不能通过增加底物浓度来消除或低抑制剂的作用。第101页/共131页第一百零一页，编辑于星期五：八点 十三分。23 三月 2023102反竞争性抑制作用的速率方程第102页/共131页第一百零二页，编辑于星期五：八点 十三分。23 三月 2023103反竞争性抑制作用曲线Km和Vmax值均减小，且都随I的增高而降低。第103页/共131页第一百零三页，编辑于星

36、期五：八点 十三分。23 三月 2023104三种可逆抑制剂的区别页表第104页/共131页第一百零四页，编辑于星期五：八点 十三分。23 三月 2023105第五节酶的制备酶的制备及纯化酶活性测定第105页/共131页第一百零五页，编辑于星期五：八点 十三分。23 三月 2023106一、酶的制备及纯化1.酶的提纯要进行的工作2.基本原则3.基本操作程序第106页/共131页第一百零六页，编辑于星期五：八点 十三分。23 三月 20231071.1.酶的提纯要进行的工作把酶制剂从含有大量的杂质蛋白和其他大分子物质的原材料中分离出来。把酶制剂从大体积浓缩到比较小的体积。第107页/共131页第

37、一百零七页，编辑于星期五：八点 十三分。23 三月 20231082.基本原则(1)尽量减少酶变性失活低温 04摄氏度，pH不能过高、过低有机溶剂：-15-20摄氏度预冷,逐滴加入，边轻搅。抽提液（适宜的缓冲液，盐）加入EDTA（络合金属）抽提液加入巯基乙醇（防止-SH酶失活）不能过度搅拌，以免产生大量泡沫，使酶变性(2)尽量除去目的酶以外物质(杂质)(3)每一涉骤都应测定酶的总活力和比活力。(4)判断提纯方法的优劣第108页/共131页第一百零八页，编辑于星期五：八点 十三分。23 三月 20231093.3.基本操作程序选材和预处理破碎细胞方法的选择抽提：缓冲液的选择分离：粗分级方法的选择

38、纯化：细分级方法的选择：根据酶分子物理化学性质；与杂质的差异；使用目的；技术难易；成本；污染等。浓缩：采用蒸发和超过滤方法固体（干燥冰冻升华，喷雾干燥，真空干燥）液体保存：低温下短期保存。一般在-20以下低温保存。第109页/共131页第一百零九页，编辑于星期五：八点 十三分。23 三月 2023110二、酶活性的测定（酶的定量测定）1.酶活力（酶活性)-酶的定量测定2.酶的比活力-表示酶纯度的指标3.酶的转换数表示酶催化能力大小4.酶活力测定方法不同酶选用不同的方法5.总活力、纯化倍数和回收率第110页/共131页第一百一十页，编辑于星期五：八点 十三分。23 三月 2023111二、酶活性

39、的测定1.定性测定定性鉴定提取物中某一酶是否存在，一般是根据此酶引起的化学反应来判断。2.定量测定：酶活力的测定。注：酶制剂因含杂质多易失活等原因，故不能用称重或测量体积来定量。第111页/共131页第一百一十一页，编辑于星期五：八点 十三分。23 三月 20231121.1.酶活力（酶活性）-酶的定量测定指酶催化某一定化学反应的能力，通常以在一定条件下酶所催化的某一化学反应速率来表示。注：酶制剂因含杂质多易失活等原因，故不能用称重或测量体积来定量。第112页/共131页第一百一十二页，编辑于星期五：八点 十三分。23 三月 2023115酶活性测定优化条件最适温度、最适pH、足够大的底物浓度

40、、适宜的离子强度、适当稀释的酶液及严格的反应时间，抑制剂不可有，辅助因子不可缺。测反应初速率（反应速率与酶量呈线性关系）tv第115页/共131页第一百一十五页，编辑于星期五：八点 十三分。23 三月 20231172.酶的比活力表示酶纯度的指标每单位酶蛋白所含的活力单位数。对固体酶：活力单位/mg酶蛋白 对液体酶：活力单位/ml酶液比活力越大，酶的活力越大，含酶量或有活性的酶量越多。第117页/共131页第一百一十七页，编辑于星期五：八点 十三分。23 三月 20231194.总活力、纯化倍数和回收率总活力比活力 总体积(ml)纯化倍数每次比活力/第一次比活力回收率（）（每次总活力/第一次总

41、活力）100判断提纯方法的优劣总活力的回收。比活力提高的倍数。对同一种酶来说比活力愈高酶愈纯。第119页/共131页第一百一十九页，编辑于星期五：八点 十三分。23 三月 2023121第六节酶的多样性一、核酶(ribozyme)二、调节酶共价修饰调节酶别构调节酶聚合解聚调节酶三、多功能酶四、人工酶抗体酶（abzyme）突变酶模拟酶第121页/共131页第一百二十一页，编辑于星期五：八点 十三分。23 三月 2023122第七节酶在工业上的应用及酶工程一、酶在食品工业中的应用二、酶在化工、轻工、方面的应用三、酶在医药工业中的应用四、固定化酶五、酶工程第122页/共131页第一百二十二页，编辑于

42、星期五：八点 十三分。23 三月 2023123固定化酶（immobilizek enzyme)immobilizek enzyme)是通过吸附、耦联、交联和包埋等物理或化学的方法把酶连接到某种载体上，仍具有酶催化活性的水不溶性酶。作用特点：酶不仅具有高的催化效率和高度专一性，稳定性提高，易分离，可反复使用，提高操作的机械强度。第123页/共131页第一百二十三页，编辑于星期五：八点 十三分。23 三月 2023124酶工程是把酶学基本原理与化学工程技术及基因重组技术有机结合而形成的新型应用技术。主要研究酶的生产、纯化、固定化技术，酶分子结构的修饰和改造以及在工农业、医药卫生和理论研究等方面的

43、应用。将酶所具有的生物催化功能，借助工程手段应用于社会生活的一门科学技术。包括：化学酶工程和生物酶工程。第124页/共131页第一百二十四页，编辑于星期五：八点 十三分。23 三月 2023125.化学酶工程是指天然酶、化学修饰酶、固定化酶及人工模拟酶的研究和应用。第125页/共131页第一百二十五页，编辑于星期五：八点 十三分。23 三月 20231262.生物酶工程（高级酶工程）包括：克隆酶、突变酶（基因修饰酶）和不曾有的新酶。第126页/共131页第一百二十六页，编辑于星期五：八点 十三分。23 三月 2023127(1)(1)克隆酶第127页/共131页第一百二十七页，编辑于星期五：八点 十三分。23 三月 2023128(2)(2)基因修饰酶采用基因定点突变技术将酶基因的一个或几个碱基变换，得到突变酶基因，将这种突变酶基因转移到适当的宿主细菌中，经培养繁殖、扩增、表达和筛选，得到突变酶。对酶的结构进行修饰。第128页/共131页第一百二十八页，编辑于星期五：八点 十三分。23 三月 2023129（3 3）产生新酶设计新酶基因，合成自然界不曾有的新酶。第129页/共131页第一百二十九页，编辑于星期五：八点 十三分。23 三月 2023131感谢您的观看。第131页/共131页第一百三十一页，编辑于星期五：八点 十三分。