基因重组和转移.ppt

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1、关于基因的重组与转移关于基因的重组与转移第一张，PPT共四十页，创作于2022年6月一、什么是受体细胞（一、什么是受体细胞（receptor cell）?第一节第一节 受体细胞受体细胞又称又称host cell，从实验技术上讲从实验技术上讲是能摄取外是能摄取外源源DNA并使其稳定遗传的细胞；并使其稳定遗传的细胞；从实验目的上讲从实验目的上讲是有应用价值和理论研究价是有应用价值和理论研究价值的细胞。值的细胞。显然并不是所有细胞都能作为受体细胞显然并不是所有细胞都能作为受体细胞第二张，PPT共四十页，创作于2022年6月二、受体细胞的选择应符合哪些基本原则？二、受体细胞的选择应符合哪些基本原则？九

2、大原则！九大原则！第三张，PPT共四十页，创作于2022年6月1 1、便于重组、便于重组DNADNA分子的导入。分子的导入。2 2、能使重组、能使重组DNADNA分子稳定的存在于细胞中分子稳定的存在于细胞中3 3、便于重组体的筛选。、便于重组体的筛选。4 4、遗传稳定性高，易于扩大培养或发酵生长、遗传稳定性高，易于扩大培养或发酵生长5 5、安全性高无致病性，不会对外界环境造成生物污染、安全性高无致病性，不会对外界环境造成生物污染6 6、选用内源蛋白水解酶基因缺失或蛋白酶含量低的细胞。、选用内源蛋白水解酶基因缺失或蛋白酶含量低的细胞。7 7、受体细胞在遗传密码的应用上无明显偏倚性、受体细胞在遗传

3、密码的应用上无明显偏倚性8 8、具有较好的转译后加工机制，便于真核目的基因的高效表达。、具有较好的转译后加工机制，便于真核目的基因的高效表达。9 9、在理论研究和生产实践上有较高的应用价值。、在理论研究和生产实践上有较高的应用价值。第四张，PPT共四十页，创作于2022年6月三、目前常用的受体细胞？三、目前常用的受体细胞？这些受体细胞各有哪些特点？这些受体细胞各有哪些特点？1、大肠杆菌、大肠杆菌2、枯草杆菌、枯草杆菌3、蓝细菌、蓝细菌4、棒状杆菌、棒状杆菌5、链霉菌、链霉菌原核生物细胞原核生物细胞6、酵母菌、酵母菌7、植物细胞、植物细胞8、动物细胞、动物细胞真核生物细胞真核生物细胞第五张，PP

4、T共四十页，创作于2022年6月原核生物细胞？原核生物细胞？这是较为理想的受体细胞类型！这是较为理想的受体细胞类型！没有坚硬的细胞壁没有坚硬的细胞壁原原因因没有核膜，染色体没有核膜，染色体DNA没有固定没有固定结合的蛋白质结合的蛋白质基因组简单，不含线粒体基因组基因组简单，不含线粒体基因组培养简单、繁殖迅速，培养简单、繁殖迅速，实验周期短，重复实验快实验周期短，重复实验快第六张，PPT共四十页，创作于2022年6月原核生物细胞？原核生物细胞？原核生物细胞作为受体存在的缺陷！原核生物细胞作为受体存在的缺陷！不具备真核生物的蛋白质折叠复性系统不具备真核生物的蛋白质折叠复性系统原原因因缺乏真核生物的

5、蛋白质加工系统缺乏真核生物的蛋白质加工系统存在内源性蛋白酶存在内源性蛋白酶第七张，PPT共四十页，创作于2022年6月真菌细胞真菌细胞酵母菌酵母菌外源真核基因最理想的表达系统外源真核基因最理想的表达系统基因表达调控机理比较清楚基因表达调控机理比较清楚优优势势具有真核生物蛋白翻译后修饰加工系统具有真核生物蛋白翻译后修饰加工系统不含有特异性的病毒，不产生毒素不含有特异性的病毒，不产生毒素培养简单、利于大规模发酵生产，成本低廉培养简单、利于大规模发酵生产，成本低廉能将外源基因表达产物分泌至培养基中能将外源基因表达产物分泌至培养基中第八张，PPT共四十页，创作于2022年6月植物细胞植物细胞优优势势具

6、有全能性具有全能性第九张，PPT共四十页，创作于2022年6月动物细胞动物细胞用于大规模表达生产天然状态的复杂蛋白质或动物疫苗、动用于大规模表达生产天然状态的复杂蛋白质或动物疫苗、动物品种的遗传改良及人类疾病的基因治疗等物品种的遗传改良及人类疾病的基因治疗等能识别和除去外源真核基因中的内含子能识别和除去外源真核基因中的内含子优优势势真核生物蛋白翻译后能被正确加工或修饰真核生物蛋白翻译后能被正确加工或修饰易被重组易被重组DNA质粒转染质粒转染可将表达产物分泌至培养基中可将表达产物分泌至培养基中组织培养技术要求高组织培养技术要求高缺缺点点第十张，PPT共四十页，创作于2022年6月研究性作业研究性

7、作业题目：国内外利用不同受体细胞开发生物题目：国内外利用不同受体细胞开发生物反应器的研究进展情况反应器的研究进展情况基本内容要点：基本内容要点：1、目前国内外都开发了哪些受体细胞作为生物反应器，并分别用、目前国内外都开发了哪些受体细胞作为生物反应器，并分别用它们生产了哪些基因工程产品？为什么要选择它作为生产该产品它们生产了哪些基因工程产品？为什么要选择它作为生产该产品的反应器？的反应器？2、生物反应器这一领域目前存在哪些问题？将来发展趋势如何？、生物反应器这一领域目前存在哪些问题？将来发展趋势如何？3、目前，国内外有哪些从事生物反应器开发的企业？你认为、目前，国内外有哪些从事生物反应器开发的企

8、业？你认为如果今后你去这里求职应该从知识上做哪些储备？如果今后你去这里求职应该从知识上做哪些储备？要求：中文参考文献不少于要求：中文参考文献不少于20篇篇英文参考文献不少于英文参考文献不少于5篇篇第十一张，PPT共四十页，创作于2022年6月第二节第二节 重组体导入受体细胞重组体导入受体细胞一、重组一、重组DNA分子转入原核生物细胞分子转入原核生物细胞二、重组二、重组DNA分子转入真核生物细胞分子转入真核生物细胞第十二张，PPT共四十页，创作于2022年6月一、如何将重组一、如何将重组DNA分子转入原核生物细胞？分子转入原核生物细胞？以大肠杆菌为例以大肠杆菌为例转化途径转化途径转导途径转导途径

9、第十三张，PPT共四十页，创作于2022年6月什么是转化（什么是转化（transformation）？）？重组质粒重组质粒DNA分子通过与膜蛋白结合进入受体分子通过与膜蛋白结合进入受体细胞，并在受体细胞内稳定维持和表达的过程。细胞，并在受体细胞内稳定维持和表达的过程。第十四张，PPT共四十页，创作于2022年6月格里菲斯的肺炎双球菌转化实验（Diplococcus pneumoniae）,1928 爱弗莱证实转化物质是 DNA第十五张，PPT共四十页，创作于2022年6月1.目的目的增加受体菌增加受体菌细胞膜的通细胞膜的通透性。透性。一、感受态大肠杆菌的制备一、感受态大肠杆菌的制备第十七张，P

10、PT共四十页，创作于2022年6月2.菌种的选择菌种的选择野生型的大肠杆菌并不是理想的受体细胞野生型的大肠杆菌并不是理想的受体细胞1）、）、hsdR-2）、）、recA-recB-recC-3）、易于转化或转导）、易于转化或转导4）、有明显的选择性差异）、有明显的选择性差异5）、感染寄生缺陷型）、感染寄生缺陷型实验室常用菌株实验室常用菌株JM109，DH5，Top10，DH10BHB101 第十八张，PPT共四十页，创作于2022年6月用用CaCl2处理大肠杆菌，能增加膜的通透性。处理大肠杆菌，能增加膜的通透性。3.制备原理制备原理第十九张，PPT共四十页，创作于2022年6月4.制备过程制备

11、过程培养大培养大肠杆菌肠杆菌OD600至至0.3-0.4On ice 5-10 min4离心离心收集菌收集菌用冰冷的用冰冷的60mMCaCl2重悬重悬4离心离心收集菌收集菌4离心离心收集菌收集菌分装、分装、-70 冻冻存存用冰冷的用冰冷的60mMCaCl2重悬重悬On ice 30 min用冰冷的用冰冷的60mMCaCl2重悬重悬第二十张，PPT共四十页，创作于2022年6月（1）转化（）转化（transformation)大肠杆菌捕获大肠杆菌捕获质粒质粒DNA的过程。的过程。（2）转染（）转染（transfection)大肠杆菌捕获大肠杆菌捕获噬菌体噬菌体DNA的过程。的过程。（3）转导（）

12、转导（transduction)借助借助噬菌体噬菌体把外源把外源DNA导入细菌的过程。导入细菌的过程。第二十一张，PPT共四十页，创作于2022年6月每每 gDNA转化成功的细菌克隆数。转化成功的细菌克隆数。3.转化方法转化方法 2.转化率转化率简单简单，但转化效率不高（，但转化效率不高（106-108/gDNA）。（1）热休克法（）热休克法（heat shock）转化效率高（高于转化效率高（高于109/gDNA）。（2）电转化法）电转化法第二十二张，PPT共四十页，创作于2022年6月10ng载体载体DNA100 L感受感受态菌态菌On ice混混合，静置合，静置10分钟分钟42C 1分钟分

13、钟加入加入1mL LB培养基培养基37摇摇1小时小时10-100 L转化转化液涂含抗菌素的液涂含抗菌素的平板平板吸附吸附DNA摄入摄入DNA（1）热休克法）热休克法第二十三张，PPT共四十页，创作于2022年6月LB培养受体菌至培养受体菌至OD600=0.5-0.6冰浴冰浴15分钟，分钟，2 离心集菌离心集菌冰冷的水重冰冷的水重悬菌体悬菌体2 离心离心集菌集菌冰冷的水重冰冷的水重悬菌体悬菌体2 离心离心收集菌体收集菌体少量冰冷的少量冰冷的水重悬水重悬分装成分装成50-300 L电转仪调为电转仪调为2.5kV,25 F脉冲控制器脉冲控制器200-400 0.5 g质粒质粒DNAOn ice混合混

14、合加入加入1mLSOC培养液培养液37 中速震中速震荡荡60分钟分钟10-100 L转化液涂转化液涂含抗菌素的平板含抗菌素的平板转化转化（2）电转化法）电转化法第二十四张，PPT共四十页，创作于2022年6月4.平板培养平板培养基培养细菌基培养细菌10-100 L转化转化液液涂于含抗菌涂于含抗菌素的平板素的平板37过夜过夜第二十五张，PPT共四十页，创作于2022年6月环形重组质粒环形重组质粒质粒自我连接质粒自我连接线性载体或线性载体或DNADNA片段进入细菌会被降解。片段进入细菌会被降解。环形质粒数环形质粒数（1）重组质粒）重组质粒 5.影响转化率的因素影响转化率的因素第二十六张，PPT共四

15、十页，创作于2022年6月生长状态生长状态制备感受态菌必须使用对数生长期的菌。制备感受态菌必须使用对数生长期的菌。必须在冰冷的条件下制备。必须在冰冷的条件下制备。要充分，使细菌细胞膜失去一些蛋白。要充分，使细菌细胞膜失去一些蛋白。储存感受态菌要在储存感受态菌要在-70以下以下CaCl2处理处理使用感受态菌时必须迅速融化使用感受态菌时必须迅速融化融化后一般不能再次冻存使用。融化后一般不能再次冻存使用。（2）感受态细胞）感受态细胞 （competent cells)第二十七张，PPT共四十页，创作于2022年6月把重组的噬菌体把重组的噬菌体 DNA或或Cosmid质粒质粒DNA包装包装成具有感染能

16、力的成具有感染能力的 噬菌体颗粒。噬菌体颗粒。6.体外包装的噬菌体的转导体外包装的噬菌体的转导（1）体外包装（）体外包装（in vitro packaging）（2）转导（）转导（transduction）通过受体菌细胞表面的通过受体菌细胞表面的 DNA接受器位点接受器位点（receptor site)，使带有外源基因的重组体，使带有外源基因的重组体DNA注入受体大肠杆菌进行扩增。注入受体大肠杆菌进行扩增。第二十八张，PPT共四十页，创作于2022年6月转化率高的菌株；转化率高的菌株；有突变的菌株（与导入的载体基因互补）；有突变的菌株（与导入的载体基因互补）；不育的菌株（不会与其他酵母接合）。

17、不育的菌株（不会与其他酵母接合）。第三节第三节 外源基因导入真核细胞外源基因导入真核细胞一、导入酵母细胞一、导入酵母细胞1.菌株选择菌株选择如：如：ura3-52,trp1-289,leu2-3,leu2-112,his31第二十九张，PPT共四十页，创作于2022年6月（1）利用原生质球进行转化）利用原生质球进行转化2.酵母的转化方法酵母的转化方法 酵母酵母原生质体原生质体感受态感受态酶去壁酶去壁CaCl2、PEG插入外源基因插入外源基因的酵母载体的酵母载体PEG（聚乙二醇）使（聚乙二醇）使细胞壁细胞壁具有通透性，允许具有通透性，允许DNA进入。进入。CaCl2使使细胞膜细胞膜具有通透性，允

18、许具有通透性，允许DNA进入。进入。转化转化第三十张，PPT共四十页，创作于2022年6月 酵母酵母0.1mol/L LiCl处理处理插入外源基因的酵母载体插入外源基因的酵母载体感受态感受态40%PEG 4000（2）利用）利用Li+盐进行转化盐进行转化第三十一张，PPT共四十页，创作于2022年6月叶盘叶盘消毒消毒切取切取土壤农杆土壤农杆菌浸泡菌浸泡看护培养基看护培养基愈伤组织愈伤组织分化幼苗分化幼苗二、导入植物细胞二、导入植物细胞1.叶盘法（叶盘法（leaf disk）第三十二张，PPT共四十页，创作于2022年6月植物细胞植物细胞原生质体原生质体纤维素酶和纤维素酶和果胶酶果胶酶DNA混合

19、入电混合入电击缓冲液击缓冲液1-2kV,3-25 F电击电击愈伤组织愈伤组织幼苗幼苗分化分化2.电击法（电击法（electroporation)第三十三张，PPT共四十页，创作于2022年6月又称又称高速微型子弹射击法（高速微型子弹射击法（High-velocity microprojectiles)DNA1.2 m钨弹头钨弹头吸附吸附特制手枪特制手枪射击植物射击植物装入装入3.基因枪法（基因枪法（gene gun）4.农杆菌（农杆菌（agrobacterium）介导）介导第三十四张，PPT共四十页，创作于2022年6月（1）原理：）原理：三、导入哺乳动物细胞三、导入哺乳动物细胞1.磷酸钙沉淀

20、法磷酸钙沉淀法HEPES缓冲盐水与含有氯化钙和缓冲盐水与含有氯化钙和DNA的的溶液缓慢混合，会形成含磷酸钙和溶液缓慢混合，会形成含磷酸钙和DNA的沉淀。的沉淀。依据不同的细胞类型，平皿上最多能有依据不同的细胞类型，平皿上最多能有10%的细胞能吸收的细胞能吸收DNA沉淀。沉淀。第三十五张，PPT共四十页，创作于2022年6月不需要载体。不需要载体。（2）特点：）特点：第三十六张，PPT共四十页，创作于2022年6月脂质体有商业试剂盒（如脂质体有商业试剂盒（如Life Technologies）。）。2.脂质体（脂质体（lipofectin）载体法）载体法脂类包埋脂类包埋DNA，通过细胞膜进入细胞

21、。，通过细胞膜进入细胞。第三十七张，PPT共四十页，创作于2022年6月直接把外源直接把外源DNA注射到宿主细胞核里，使其注射到宿主细胞核里，使其整合到染色体上。整合到染色体上。3.显微注射法显微注射法(microinjection)第三十八张，PPT共四十页，创作于2022年6月二乙氨乙基（二乙氨乙基（diethyl-aminoehtyl，DEAE）葡萄）葡萄糖能促进哺乳动物细胞摄入外源糖能促进哺乳动物细胞摄入外源DNA。4.DEAE-葡萄糖传染法葡萄糖传染法葡聚糖葡聚糖葡聚糖葡聚糖+DNA吸附到细胞表面后被细胞吞入，部分吸附到细胞表面后被细胞吞入，部分DNADNA可以可以进入到细胞核里。进入到细胞核里。第三十九张，PPT共四十页，创作于2022年6月感谢大家观看第四十张，PPT共四十页，创作于2022年6月