AlltechELSD液相色谱检测器.pptx

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1、ELSD的原理:检测三部曲：n雾化n溶剂的蒸发n检测第1页/共35页第一部：雾化n 流动相及经色谱柱分离后的样品首先进入雾化器中,通过喷雾器针孔与雾化气体混合,形成均匀的雾状液滴第2页/共35页第二部：溶剂的蒸发n 液滴通过加热的漂移管后溶剂蒸发,保留下薄雾状的样品颗粒。第3页/共35页第三部：检测n 样品颗粒通过流动池，激光“撞击”颗粒被散射，形成散射光。光电二极管接收散射光形成信号。第4页/共35页ELSD的主要结构：按流路顺序由四部分组成：雾化器(Nebulizer)漂移管(Drift Tube)光路部分(Optics)出口(Exhaust)第5页/共35页两种操作模式：IMPACTOR

2、 ON&OFFn撞击器开(Impactor on):部分流动相及样品通过光路出口部分，剩余的雾化后形成的大液滴由右侧面的分流口排出；操作时需要较小的气流和温度；n 撞击器关(Impactor off)：100的流动相及样品通过光路出口部分，需要较高的气流和温度；第6页/共35页ELSD加热的控制：n加热温度范围：室温120(精度1)；nImpactor Off 模式下：漂移管和雾化器加热到设 定温度，光池和出口 加热到90%的设定温度值；nImpactor On模式下：除雾化器不加热外，其余部分加热到设定温度；第7页/共35页 加热部分的组成：n加热模块由三部分组成：温度过热保险丝/加热器电热

3、丝/温度热敏传感器n电源板上有四个指示灯：由左至右依次为：光池出口漂移管雾化器 颜色分别为：黄灯红灯绿灯桔黄灯第8页/共35页加热部分的组成：n 温度过热保险丝由两根桔黄色的线组成，从电源板插入加热部分内部；n正常的情况下是通路的，烧断的时候是开路的；n加热器电热丝电阻：出口 500X2,光池 380 X2,漂移管 243 X2，雾化器 270 X2 第9页/共35页手动控制加热开关：n可以通过Manual Control菜单来手动控制雾化器和漂移管的加热的开关；（Menu)-(3.Diagnostics)-(2.Manual Control)n通入流动相后雾化器温度有一个下降的过程是正常的，

4、在高温时会更明显；n600-020XXXX系列有两个温度显示；600-030XXXX系列有四个温度显示第10页/共35页主板和输入输出板：第11页/共35页对雾化气体的要求：nELSD要求的入口压力范围：0.45-0.56MPa(65-80PSI),不要超过规定的压力，气压过大容易损坏ELSD内部的气体入口过滤器（货号50135）n使用空气压缩机作为气源时要定期更换变色硅胶和放水，分子筛和活性炭等应每年更换一次；n常规使用的气流量在1.5-3.2升/分钟之间，气体分为两路：一路进入漂移管，另一路进入尾吹部分；第12页/共35页ELSD对流动相的要求：nELSD检测的是没有挥发的样品颗粒的散射光

5、，所以要求使用高纯的无颗粒的试剂，溶剂的蒸发残渣值应小于1ppm;n流动相应经过0.45um的滤膜过滤后使用，注意选择好滤膜的种类，以免带入更多的颗粒；n必要时需要对溶剂进行重新蒸馏的处理；n非挥发性缓冲液及离子对试剂必须用挥发性的试剂取代，不能使用H3PO4,KH2PO4等；nELSD检测跟溶剂的UV吸收没有关系，可以使用一些在紫外上不能用的试剂，如丙酮等；第13页/共35页 挥发性缓冲液和挥发性流动相改型剂挥发性缓冲液和挥发性流动相改型剂pKapKbpH RangeBPMP酸酸Trifluoroacetic Acid 三氟乙酸0.313.7072.4CFormic Acid 甲酸3.751

6、0.25100.7CAcetic Acid 乙酸4.75 9.25116.0CCarbonic Acid 碳酸6.37 7.63碱碱Ammonia 氨 9.254.75-33.35CMethylamine 甲胺10.813.1916.6CEthylamine 乙胺10.663.34-6.3CTriethylamine 三乙胺11.012.99 89.3C缓冲液缓冲液Ammonium Formate 甲酸胺3.0-5.0120CPyridinium Formate 甲酸吡啶翁3.0-5.0Ammonium Acetate 乙酸胺3.8-5.8111CPyridinium Acetate 乙酸吡啶

7、翁4.0-6.0Ammonium Carbonate(for reverse phase)碳酸胺（用于反相）8.0(adjusted)Ammonium Carbonate 碳酸胺5.5-7.5&9.3-11.3离子对试剂离子对试剂Pentafluoropropionic Acid 五氟丙酸0.696-97CHeptafluorobutyric Acid 七氟丁酸0.6120CNonafluoropentanoic Acid 九氟戊酸0.6140CPentadecafluoroocatanoic Acid 十五氟辛酸0.6189CTridecafluoroheptanoic Acid 十三氟庚酸

8、0.6175C第14页/共35页 ELSD参数的设定：第15页/共35页ELSD参数的设定：选择正确的操作条件-Impactor开关(根据含水或有机溶剂，样品的挥发性等)；Impactor关(优化温度及气流-参考操作手册内的部分，注意流速若超过1ml/min.需要按比例提高建议值，小于1ml/min可以适当减少温度和气流)；使用梯度洗脱时应参考水相最多的条件设定参数；Impactor开(按样品及溶剂分两种初始条件)，上限流速5ml/min；使用制备大流速超过5ml/min时，需要使用分流器(货号50194)；第16页/共35页ELSD开关机的顺序(IMPACTOR OFF 模式下)：开机：先用

9、流动相平衡色谱柱约30分钟，注意不要通入ELSD中；根据流动相的组成计算ELSD的温度和气流，将ELSD置于Run状态下通气升温；达到条件后接入流动相，约1520分钟后可以进样分析；关机：流动相中只含有有机相/水的情况：1.切断流动相,保持ELSD的条件不变约15分钟;2.将ELSD的温度降至70,气流量保持不变或适当降低,到达温度后停气关机;流动相中含有缓冲液或改型剂的情况:将色谱柱替换为两通,直接用输液泵将100%水以0.6ml/min左右的流速通入ELSD约30分钟,然后重复以上的两步;第17页/共35页两种模式的注意事项：n 撞击器开的模式下，随时注意废液缸中液体的高度。当液面接近废液

10、缸口时，必须倒掉部分液体。在倾倒液体时请记住需留有足够液体浸没管子。n 在撞击器关的模式下，无须查看液面高度，因为在此模式下无废液排出。n 无论在哪一种模式下工作，管子必须埋在液面下面，同时不能够有鼓气泡的现象。n 每天检查排气管和废液冷阱，经常倒掉废液。请勿让瓶子装满，这样会造成排出气体通过冷凝液返气泡，从而增加噪音。第18页/共35页排气冷阱及废液的示意图:第19页/共35页ELSD计算机控制软件的使用:n 尽量不要使用Temporary Method,有时会造成传送 的方法在ELSD上不执行;n当打开计算机控制软件后,ELSD面板的按钮将被锁定,不要长时间使用Unlock Keypad,

11、容易造成计算机与ELSD间的通讯故障;n 不要用中文名称来命名方法;nELSD具有1,2,4,8,16共5种增益(Gain),从1到16能够增加75%的信噪比(S/N),不过从8增长到16只能增加4%的S/N;第20页/共35页雾化器的结构及清洁程序:1.气体和液体在雾化器出口处瞬间混合,形成气溶胶;2.将O形圈取下后放入50:50的甲醇:水溶液中超声10-15分钟;3.ELSD 2000 诊断窗第二项雾化器气体压力测试，气压过高显示雾化器可能被堵塞,正常情况下在2.0L/min的气流量下应该在20-25PSI以下;4.雾化器污染会造成信号噪音上升,灵敏度下降,峰尖上分叉等;第21页/共35页

12、漂移管污染的清洁程序:n污染时会造成基线噪音,重复性差等,用手电筒从出口处照入就能看到漂移管的洁净程度;n用附件的长柄毛刷蘸水从出口伸入漂移管小心擦拭管壁,不要损坏撞击器开关;n将ELSD设定为110和2.8L/min的气量后用100%水1.0ml/min的流速冲洗ELSD一小时;n停止流动相保持ELSD温度和气量30分钟,将残余的液体带走;第22页/共35页光路部分的结构及清洁方法:n由光池,光阱,激光光源及前置放大器(包含光电二极管)四部分组成;n光池和光阱表面是完全涂黑的,光池和光阱可以用绸布蘸酒精或水擦拭.光阱中的固体杂质应该去处干净;n激光光源的使用寿命很长,且不会发生衰减,正常的功

13、率值在4.7MV左右;n在不通流动相的时候运行Optics Test,在3-20Mv之内能够通过测试;第23页/共35页ELSD分析结果的定量计算:1.ELSD的响应遵从散射光的原理,Y=aXn,在很多范围内是非线性的,采用UV常用的单点外标法计算会有很大误差;2.可使用两点对数线性法,在待测样品含量的左右各称取两份对照品,将对照品的峰面积与浓度同时取对数,得到Y=aX+b的直线,将待测样品的峰面积取对数后带入方程,得到的X值的反对数即为所求样品的含量;第24页/共35页ELSD分析结果的定量计算:3.三点随行二次曲线是指以待测样品为中心，采取高、中、低三个浓度（如80%,100%,120%）

14、的对照品随行实验，以三个浓度对照品进样量与峰面积进行二次曲线拟和，得到随行二次曲线方程，即：Y=ax2+bx+c （1）其中：Y为峰面积 X 为进样量 （当a=0时，三点成一条直线）再将供试品峰面积代入（1）式，计算供试品进样量。第25页/共35页ELSD使用的过程中的常见故障:1.雾化器或漂移管不加热:可能原因:A.温度过热保险断:a).完全不加温;b).低温能加上去,高温上不去,此情况处于似断非断之间 B.加热器电热丝烧坏(测量加热器电阻)C.温度热敏传感器坏(测量热敏电阻)D.使用控制软件的临时方法;2.通气加温基线有不规则噪声或脉冲:可能原因:A.气体不纯,可能含有颗粒;B.雾化器或漂

15、移管有微粒脱落;第26页/共35页ELSD使用的过程中的常见故障:3.通入流动相后基线有不规则的噪声或脉冲:可能原因:A.HPLC泵有脉动;B.流动相中有不挥发的物质;C.流动相脱气处理的不好,含有空气;D.色谱柱有固定相脱落;4.气体的流量上不去,达不到设定值:可能原因:A.N2钢瓶或压缩机的输出压力不够,应在0.45-0.56MPa之间;B.从气源到ELSD的气路管有堵塞,首先检查ELSD的入气口是 否正常;C.操作不当导致流动相进入气路管,比例电磁阀被溶液腐蚀;D.气体质量流量计需要重新校正或出现故障;第27页/共35页ELSD使用的过程中的常见故障:5.光学诊断(Optics Test

16、)不通过:可能原因:A.光池有污染;B.光阱有污染;C.光池的进出口连接间有污染;D.前置放大器透镜和激光镜片有污染;6.光池或光阱中有积水:可能原因:A.检查光池温度控制是否正常;B.使用高水份流动相时要用高温和气流清扫ELSD后才能 关机;C.停止流动相,用高温和气流清扫30分钟;第28页/共35页ELSD使用的过程中的常见故障:7.ELSD灵敏度降低:可能原因:A.激光光源的能量太低或激光头的位置不在正中央;B.漂移管和雾化器有污染需要清洗;C.光电二极管老化;D.前置放大器有受潮漏电的情况;8.ELSD的峰面积的重复性差:可能原因:A.检测整个HPLC系统是否正常,分流瓶中是否鼓气泡；B.漂移管和雾化器有污染需要清洗;C.各单元的温度及气流量是否正常;D.所使用用的色谱柱有问题;第29页/共35页IQ,OQ,PQ服务国际质量认证GMP，GLP要求仪器安装及使用需要通过严格管理，包括详细记录使用情况，定期校正IQ-安装认证OQ-操作认证，包括仪器操作参数用校正计量仪器测试PQ-性能认证，按出厂指标验证性能符合规格第30页/共35页OQ-温度的校准 第31页/共35页OQ-气流的校准 第32页/共35页OQ-激光的校正第33页/共35页PQ-ELSD性能指标验证:1.测试基线噪音和漂移的大小;2.测试标准样品的峰面积重复性;3.测试灵敏度信噪比的大小;第34页/共35页