第二节蛋白质一级结构的测定方法课件.ppt

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1、第二节蛋白质一级结构的测定方法第1页，此课件共86页哦蛋白蛋白质序列序列测定的基本定的基本战略和步略和步骤l l一一一一 蛋白蛋白蛋白蛋白质质序列序列序列序列测测序的基本序的基本序的基本序的基本战战略略略略l l1 1、直接法（、直接法（、直接法（、直接法（测测蛋白蛋白蛋白蛋白质质的序列）的序列）的序列）的序列）l对于一个于一个纯蛋白蛋白质，理想方法是从，理想方法是从N端直接端直接测至至C端，但目前端，但目前只能只能测60个个N端氨基酸。端氨基酸。l2 2、间间接法（接法（接法（接法（测测核酸序列推断氨基酸序列）核酸序列推断氨基酸序列）核酸序列推断氨基酸序列）核酸序列推断氨基酸序列）l蛋白蛋白

2、质化学家收集的一个蛋白化学家收集的一个蛋白质资料料库（databaseordatabank）可以在）可以在AltasofProteinSequenceandStructure(Dayhoff,M.O.ed.1972-1978,Vols1-5,Washington,DC:NationalBiomedicalResearshFoundation)中找到。然而中找到。然而现在大多数蛋白在大多数蛋白质序列序列信息都是从基因信息都是从基因核苷酸序列（核苷酸序列（经过密密码子）翻子）翻译成氨基酸序列的。成氨基酸序列的。第2页，此课件共86页哦l由于克隆核苷酸序列比由于克隆核苷酸序列比测定核苷酸序列更快、更

3、有定核苷酸序列更快、更有效、信息更多，因此有不少效、信息更多，因此有不少电子数据子数据库问世，世，储存的存的序列序列资料以惊人的速度不断料以惊人的速度不断扩充，并且个人充，并且个人电脑可以可以方便利用。如果方便利用。如果现在需要确定一个新蛋白在需要确定一个新蛋白质的序列，的序列，研究者所做的第一件事就是将新蛋白研究者所做的第一件事就是将新蛋白质的序列与数据的序列与数据库中的其它已知序列中的其它已知序列进行比行比较，确定其中是否存在同，确定其中是否存在同源性。源性。这些数据些数据库中比中比较有名的就是美国有名的就是美国NationalBiomedicalResearshFoundation（国家

4、生物医学研究（国家生物医学研究基金会）主持的基金会）主持的PIR（ProteinInformationResource，蛋白，蛋白质信息信息库或或ProteinIdentificationResouece蛋白蛋白质鉴定定库）,美国政府支持的美国政府支持的GeneBankGeneSequenceDataBank（基因序列数据（基因序列数据库），还有欧洲的有欧洲的EMBL（EuropeanMolecularBiologyLaboratory,欧洲分子生物学欧洲分子生物学实验室数据室数据库）。l第3页，此课件共86页哦lPDB(ProteinDataBank):蛋白蛋白质结构数据构数据库lPDB原来

5、有由美国原来有由美国Brookhaven国家国家实验室室负责维护和管理，和管理，为适适应结构基因构基因组和生物信息学研究和生物信息学研究的需要，的需要，1998年由美国国家科学基金委年由美国国家科学基金委员会、能源部会、能源部和和卫生研究院生研究院资助，成立助，成立结构生物学合作研究构生物学合作研究协会会（ResearchCollaboratoryforStructureBioinformatics,RCSB）PDB由由RCSB管理。管理。lPDB是目前最主要的蛋白是目前最主要的蛋白质分子分子结构数据构数据库第4页，此课件共86页哦二、蛋白二、蛋白质一一级结构的构的测定方法定方法l研究蛋白研究

6、蛋白质的一的一级结构从确定构从确定组成蛋白成蛋白质的的单元元结构从构从氨基酸氨基酸算起，已有算起，已有150年的悠久年的悠久历史，直到史，直到1955年，年，Sanger首次首次阐明胰明胰岛素的氨基酸排列素的氨基酸排列顺序，序，为研究蛋白研究蛋白质的一的一级结构开辟了道路。构开辟了道路。这在分子生物在分子生物学的学的发展展进程中是一个重要突破。程中是一个重要突破。l目前关于核酸的一目前关于核酸的一级结构研究，由于构研究，由于Sanger等等发明了明了加减法，可以得到了突加减法，可以得到了突飞猛猛进的的发展。展。对比之下，比之下，关于蛋白关于蛋白质的一的一级结构研究构研究进展不如核酸迅速。展不如

7、核酸迅速。第5页，此课件共86页哦l但随着但随着Edman液相自液相自动顺序分析序分析仪和固相和固相顺序分析序分析仪以及气相色以及气相色谱、质谱(GCMS)等方法的相等方法的相继出出现。使。使结构分析的速度也构分析的速度也显著加快。至今已完成近千种蛋白著加快。至今已完成近千种蛋白质的一的一级结构分析。目前不构分析。目前不仅样品用量减少，而且工作人品用量减少，而且工作人员也大大减少。也大大减少。l当年当年Sanger分析胰分析胰岛素用了整整十年的素用了整整十年的时间，今天运用自，今天运用自动化化仪器，分析一个分子量在器，分析一个分子量在10万左右的蛋白万左右的蛋白质只需要几天，只需要几天，可可见

8、新技新技术的的应用和用和发展展对科学科学发展起的促展起的促进作用，蛋作用，蛋白白质一一级结构构测定方法的定方法的综述及述及专著文献著文献较多。多。第6页，此课件共86页哦三三 测定前的准定前的准备工作工作测测序前的准序前的准序前的准序前的准备备工作工作工作工作：蛋白蛋白蛋白蛋白质质的的的的纯纯度度度度鉴鉴定定定定要求：要求：纯纯度度度度97%97%以上，均一。以上，均一。以上，均一。以上，均一。鉴定方法：定方法：聚聚聚聚 丙丙丙丙 烯烯 酰酰 胺胺胺胺 凝凝凝凝 胶胶胶胶 电电 泳泳泳泳(PAGE)(PAGE)要求一条要求一条要求一条要求一条带带，双向，双向，双向，双向电电泳。泳。泳。泳。DN

9、SDNSClCl（二二二二甲甲甲甲氨氨氨氨基基基基萘萘磺磺磺磺酰氯酰氯）法）法）法）法测测N N端氨基酸。端氨基酸。端氨基酸。端氨基酸。(3)(3)亲亲和和和和层层析析析析(4)western(4)western印迹法等印迹法等印迹法等印迹法等测测定蛋白定蛋白定蛋白定蛋白质质的分子量的分子量的分子量的分子量估算氨基酸残基数，确定估算氨基酸残基数，确定肽链数数方法：方法：SDS-PAGE，凝胶，凝胶过滤法，沉降系数法法，沉降系数法第7页，此课件共86页哦及及测定的一般步定的一般步骤蛋白蛋白质分子的一分子的一级结构构测定，概括起来包含多定，概括起来包含多肽链的的分离、降解、分离、降解、肽段的分离和

10、段的分离和顺序分析以及序分析以及SS定位等。定位等。第8页，此课件共86页哦l l蛋白蛋白蛋白蛋白质测质测序的一般步序的一般步序的一般步序的一般步骤骤l（1）测定蛋白定蛋白质分子中多分子中多肽链的数目。的数目。l（2）拆分蛋白拆分蛋白质分子中的多分子中的多肽链。l（3）断裂断裂链内二硫内二硫键。l（4）分析多分析多肽链的的N末端和末端和C末端。末端。l（5）测定多定多肽链的氨基酸的氨基酸组成。成。l（6）多多肽链部分裂解成部分裂解成肽段。段。l（7）测定各个定各个肽段的氨基酸段的氨基酸顺序序l（8）确定确定肽段在多段在多肽链中的中的顺序。序。l（9）确定多确定多肽链中二硫中二硫键的位置。的位置

11、。第9页，此课件共86页哦一一级结构的构的测定方法定方法1.多多肽链的分离的分离1）肽链的拆开的拆开蛋白蛋白质分子多分子多肽链的的连接有共价接有共价结合和非共价合和非共价结合两种。要拆开以共价合两种。要拆开以共价结合的合的-S-S-连接的多接的多肽链，采用的化学采用的化学处理方法有：理方法有：第10页，此课件共86页哦过甲酸氧化甲酸氧化 第11页，此课件共86页哦巯基乙醇基乙醇还原原 第12页，此课件共86页哦Clelands试剂的的还原作用原作用 第13页，此课件共86页哦稳定定SH基的方法：基的方法：（A）烷基化基化试剂使使SH基基转变为稳定的硫定的硫醚衍生物衍生物第14页，此课件共86页

12、哦稳定定SH基的方法：基的方法：（B）氨乙基化）氨乙基化第15页，此课件共86页哦l非共价非共价结合合l尿素，尿素，SDS-PAGE，盐酸胍，酸胍，高高浓度的度的盐第16页，此课件共86页哦2）末端分析）末端分析（1）N-末端末端测定定A.二硝基氟苯法二硝基氟苯法(FDNB，DNFB)第17页，此课件共86页哦第18页，此课件共86页哦（1）N-末端末端测定定 B.氰酸酸盐法法异硫异硫氰酸苯酸苯酯（PTC或或PITC）与）与N末端的末端的氨基氨基发生的反生的反应，生成，生成PTC钛,在弱酸中自在弱酸中自发环化化转变成成PTH衍生物。衍生物。该试剂称称为Edman试剂。由于由于PTH衍生物从多衍

13、生物从多肽链上脱落下来上脱落下来对其余部分没有影响，所以常用来其余部分没有影响，所以常用来测定蛋白定蛋白质的一的一级结构。构。第19页，此课件共86页哦第20页，此课件共86页哦（1）N-末端末端测定定 C.二甲基氨基二甲基氨基萘磺磺酰氯法法 在碱性条件下，丹磺在碱性条件下，丹磺酰氯（二甲氨基（二甲氨基萘磺磺酰氯DNS-Cl）可以与）可以与N-端氨基酸的游离氨基作用，得端氨基酸的游离氨基作用，得到丹磺到丹磺酰-肽。此法的此法的优点是丹磺点是丹磺酰-氨基酸有很氨基酸有很强的的荧光性光性质，检测灵敏度可以达到灵敏度可以达到1 10-9mol。第21页，此课件共86页哦第22页，此课件共86页哦氨氨

14、肽酶法法l氨氨肽酶是一种是一种肽链外切外切酶，它能从多，它能从多肽链的的N-端逐个的向里水解。根据不同的反端逐个的向里水解。根据不同的反应时间测出出酶水解所水解所释放出的氨基酸种放出的氨基酸种类和和数量，按反数量，按反应时间和氨基酸残基和氨基酸残基释放量作放量作动力学曲力学曲线，从而知道蛋白，从而知道蛋白质的的N-末端残末端残基基顺序。序。l最常用的氨最常用的氨肽酶是亮氨酸氨是亮氨酸氨肽酶，水解以，水解以亮氨酸残基亮氨酸残基为N-末端的末端的肽键速度最大。速度最大。第23页，此课件共86页哦2）末端分析）末端分析（2）C-末端分析末端分析A.肼解法解法 无水无水肼NH2NH21005-10h。

15、苯甲苯甲醛沉淀氨基酸的沉淀氨基酸的酰肼，C端游离氨基酸留在端游离氨基酸留在上清中。上清中。Gln（谷氨（谷氨酰胺）、胺）、Asn（天冬（天冬酰胺）、胺）、Cys（半胱氨酸）、（半胱氨酸）、Arg（精氨酸）不能（精氨酸）不能产生游生游离的离的羧基末端基末端aa。第24页，此课件共86页哦第25页，此课件共86页哦（2）C-末端分析末端分析B.羧肽酶水解法水解法 羧肽酶可以可以专一性地水解一性地水解羧基末端氨基酸。根据基末端氨基酸。根据酶解解的的专一性不同，可区分一性不同，可区分为羧肽酶A、B和和C。应用用羧肽酶测定末端定末端时，需要事先，需要事先进行行酶的的动力学力学实验，以便，以便选择合合适的

16、适的酶浓度及反度及反应时间，使，使释放出的氨基酸主要是放出的氨基酸主要是C末末端氨基酸。端氨基酸。第26页，此课件共86页哦羧肽酶法法测C末端末端羧肽酶羧肽酶法法法法羧肽酶A：除除Pro、Arg（精氨酸）、（精氨酸）、Lys（赖氨酸）外的所有氨酸）外的所有C端氨基酸端氨基酸羧肽酶B：只水解：只水解Arg、Lys第27页，此课件共86页哦C-末端分析末端分析C.C-端氨基酸端氨基酸选择性性氚标记法：法：使用使用氚标记是是测定定C-端氨基酸最好的端氨基酸最好的办法，法，专一一性性强，灵敏度高，但是，灵敏度高，但是这种方法不能用于种方法不能用于C-端脯氨酸端脯氨酸（Pro）和天冬氨酸（）和天冬氨酸（

17、Asp）还原法：利用硼氢化锂将还原法：利用硼氢化锂将C-端氨基酸端氨基酸还原成原成氨氨基醇。然后碱多基醇。然后碱多肽水解，用色水解，用色谱法法鉴定定氨基醇的氨基醇的类别。第28页，此课件共86页哦酸水解酸水解酸水解酸水解常用常用6mol/L的的盐酸或酸或4mol/L的硫酸（磺酸）在的硫酸（磺酸）在105-110条件条件下下进行水解，反行水解，反应时间约20小小时。近年来用。近年来用4mol/L的甲基磺酸代的甲基磺酸代替替盐酸，效果比酸，效果比较好，被广泛好，被广泛应用。用。此法的此法的优点是不容易引起水解点是不容易引起水解产物的消旋化。物的消旋化。缺点是缺点是色氨酸色氨酸被沸酸完全破坏，被沸酸

18、完全破坏，含有含有羟基的氨基酸如基的氨基酸如丝氨酸或氨酸或苏氨酸氨酸有一小部分被分解；有一小部分被分解；天天门冬冬酰胺和谷氨胺和谷氨酰胺胺侧链的的酰胺基被水解胺基被水解成了成了羧基。基。-COO+3）氨基酸）氨基酸组成分析成分析第29页，此课件共86页哦碱水解碱水解碱水解碱水解一般用一般用5mol/L氢氧化氧化钠于真空或充氮条件下于真空或充氮条件下进行，行，1100C煮沸煮沸10-20小小时。由于水解由于水解过程中程中许多氨基酸都受到不同程度的多氨基酸都受到不同程度的破坏，破坏，产率不高。部分的水解率不高。部分的水解产物物发生消旋化生消旋化。该法的法的优点是点是色氨酸色氨酸在水解中不受破坏。在

19、水解中不受破坏。第30页，此课件共86页哦 酶酶法裂解法裂解法裂解法裂解胰蛋白胰蛋白酶（赖氨酸）氨酸）LysX（精氨酸）（精氨酸）ArgX(XPro)胰凝乳蛋白胰凝乳蛋白酶（糜蛋白（糜蛋白酶）（酪氨酸）（酪氨酸）TyrX（色氨酸）（色氨酸）TrpX（苯丙氨酸）（苯丙氨酸）PheX(XPro)嗜嗜热菌蛋白菌蛋白酶 X-Leu（亮氨酸）（亮氨酸）,Ile（异亮氨酸）（异亮氨酸）,Phe（苯丙氨酸）（苯丙氨酸）,Trp（色氨（色氨酸），酸），Val（缬氨酸）氨酸）,Tyr（酪氨酸），（酪氨酸），Met（甲硫氨酸）（甲硫氨酸）胃蛋白胃蛋白酶Phe（苯丙氨酸）（苯丙氨酸），Trp（色氨酸）（色氨酸）Ty

20、r（酪氨酸），（酪氨酸），Leu（亮氨酸）（亮氨酸）X不能水解不能水解Pro羧基参与形成的基参与形成的肽键。Glu蛋白蛋白酶Glu（谷氨酸）（谷氨酸）XArg蛋白蛋白酶Arg（精氨酸）（精氨酸）XLys蛋白蛋白酶XLys（赖氨酸）氨酸）Pro蛋白蛋白酶ProX第31页，此课件共86页哦 氨基酸的分离和含量氨基酸的分离和含量测定定氨基酸的颜色反应：紫色在570nm比色茚三酮与Pro生成黄色产物，在440nm比色第32页，此课件共86页哦层析析l基于不同物基于不同物质在流在流动相和固定相之相和固定相之间的分的分配系数不同而将混合配系数不同而将混合组分分离的技分分离的技术。当。当流流动相相(液体或气

21、体液体或气体)流流经固定相固定相(多孔的固多孔的固体或覆盖在固体支持物上的液体体或覆盖在固体支持物上的液体)时，各，各组分沿固定相移分沿固定相移动的速度不同而分离。能用的速度不同而分离。能用于微量于微量样品的分析和大量品的分析和大量样品的品的纯化制化制备。第33页，此课件共86页哦氨基酸的分离l色色谱法利用不同物法利用不同物质在不同相在不同相态的的选择性分配，以流性分配，以流动相相对固定相中的混合物固定相中的混合物进行洗脱，混合物中不同的物行洗脱，混合物中不同的物质会会以不同的速度沿固定相移以不同的速度沿固定相移动，最，最终达到分离的效果。达到分离的效果。l色色谱过程的本程的本质是待分离物是待

22、分离物质分子在固定相和流分子在固定相和流动相之相之间分配平衡的分配平衡的过程，不同的物程，不同的物质在两相之在两相之间的的分配会不同，分配会不同，这使其随流使其随流动相运相运动速度各不相同，速度各不相同，随着流随着流动相的运相的运动，混合物中的不同，混合物中的不同组分在固定相分在固定相上相互分离。根据物上相互分离。根据物质的分离机制，又可以分的分离机制，又可以分为吸吸附色附色谱、分配色、分配色谱、离子交、离子交换色色谱、凝胶色、凝胶色谱、亲和色和色谱等等类别。l 第34页，此课件共86页哦薄膜薄膜层析析 将多将多肽链完全酸水解成游离氨基酸，然完全酸水解成游离氨基酸，然后后进行行Dansyl标记

23、，聚，聚酰胺薄膜胺薄膜层析，此析，此方法在蛋白方法在蛋白质结构分析中是一种超微量的构分析中是一种超微量的分析分析术，但此方法用于定量分析尚不，但此方法用于定量分析尚不够准准确。确。第35页，此课件共86页哦氨基酸自氨基酸自动分析分析仪就是利用就是利用离子交离子交换的方的方法法l离子交离子交换色色谱法：利用离子交法：利用离子交换原理和液原理和液相色相色谱技技术的的结合来合来测定溶液中阳离子和定溶液中阳离子和阴离子的一种分离分析方法，利用被分离阴离子的一种分离分析方法，利用被分离组分与固定相之分与固定相之间发生离子交生离子交换的能力差的能力差异来异来实现分离。离子交分离。离子交换色色谱主要是用来主

24、要是用来分离离子或可离解的化合物。它不分离离子或可离解的化合物。它不仅广泛广泛地地应用于无机离子的分离，而且广泛地用于无机离子的分离，而且广泛地应用于有机和生物物用于有机和生物物质，如氨基酸、核酸、，如氨基酸、核酸、蛋白蛋白质等的分离。等的分离。第36页，此课件共86页哦氨基酸自氨基酸自动分析分析仪就是利用就是利用离子交离子交换的方法的方法若要若要测定某蛋白定某蛋白质样品的氨基酸品的氨基酸组成，事先把成，事先把样品品经酸水解，酸水解，调节水解液的水解液的pH为3，使所有的氨基酸都，使所有的氨基酸都带负电荷，由于各种氨基酸荷，由于各种氨基酸侧链基基团的复的复杂性，各种性，各种氨基氨基酸所酸所带的

25、的电荷荷强度差异比度差异比较大大，pH3时,对于酸性氨于酸性氨基酸来基酸来说虽然也然也带正正电荷，但由于谷氨酸荷，但由于谷氨酸-羧基和天冬基和天冬氨酸的氨酸的-羧基，都有不同程度的离解，基，都有不同程度的离解，导致整个分子致整个分子偏中性，偏中性，对于碱性氨基酸来于碱性氨基酸来说，本来，本来结合合质子的能力子的能力就很就很强，此，此时，它所，它所带的正点荷的正点荷强度就更大。度就更大。酸水解破坏了色氨酸、使谷酸水解破坏了色氨酸、使谷酰胺和天冬胺和天冬酰胺胺转变为相相应的谷氨酸和天冬氨酸。的谷氨酸和天冬氨酸。为了分离效果好，了分离效果好，在洗脱在洗脱过程中，使用不同程中，使用不同pH和离子和离子

26、强度的洗脱液。度的洗脱液。经氨基酸自氨基酸自动分析分析仪洗脱下来的氨基酸，按洗脱下来的氨基酸，按顺序序进行染色，行染色，由由记录仪自自动描描绘出各种氨基酸的光吸收出各种氨基酸的光吸收图谱。第37页，此课件共86页哦3）氨基酸）氨基酸组成分析成分析离子交离子交换层析法析法 第38页，此课件共86页哦l离子交离子交换色色谱利用被分离利用被分离组分与固定相之分与固定相之间发生离子交生离子交换的能力差异来的能力差异来实现分离。离子交分离。离子交换色色谱的固定相一般的固定相一般为离子交离子交换树脂，脂，树脂分子脂分子结构中存在构中存在许多可以多可以电离的离的活性中心，待分离活性中心，待分离组分中的离子会

27、与分中的离子会与这些活性中心些活性中心发生生离子交离子交换，形成离子交，形成离子交换平衡，从而在流平衡，从而在流动相与固定相相与固定相之之间形成分配。固定相的固有离子与待分离形成分配。固定相的固有离子与待分离组分中的离分中的离子之子之间相互争相互争夺固定相中的离子交固定相中的离子交换中心，并随着流中心，并随着流动相的运相的运动而运而运动，最，最终实现分离。分离。第39页，此课件共86页哦第40页，此课件共86页哦各种氨基酸各种氨基酸侧链基基团的性的性质对于氨基酸与离子交于氨基酸与离子交换树脂，脂，结合的情况有相当复合的情况有相当复杂的影响。在氨基酸自的影响。在氨基酸自动分分析析仪的的记录上可以

28、看出：天冬氨酸（上可以看出：天冬氨酸（pI为2.98）最先随）最先随洗脱液下来，洗脱液下来，赖氨酸（氨酸（pI为9.74）最后下来，三个中性氨）最后下来，三个中性氨基酸如基酸如:甘氨酸（甘氨酸（pI为5.97）、）、苏氨酸（氨酸（pI为6.53）和亮氨）和亮氨酸（酸（pI为5.98）洗脱的）洗脱的顺序又如何呢序又如何呢?苏氨酸氨酸应当当带有有较多的正多的正电荷，与荷，与树脂脂结合比合比较紧，不易被洗脱下来，但，不易被洗脱下来，但是由于是由于羟基具有极性，减弱了基具有极性，减弱了树脂脂对氨基酸的吸引力。氨基酸的吸引力。所以反而比甘氨酸和亮氨酸后被洗脱下来。甘氨酸和亮所以反而比甘氨酸和亮氨酸后被洗

29、脱下来。甘氨酸和亮氨酸相比，亮氨酸氨酸相比，亮氨酸侧链疏水性疏水性强，与，与树脂脂结合合紧，后甘，后甘氨酸被洗脱下来。氨酸被洗脱下来。综上所述：影响离子交上所述：影响离子交换树脂分离氨基酸的因素：脂分离氨基酸的因素：（1）氨基酸分子所）氨基酸分子所带的的电荷；荷；（2）氨基酸分子的极性；）氨基酸分子的极性；（3）氨基酸分子的形状和大小。）氨基酸分子的形状和大小。第41页，此课件共86页哦3特殊氨基酸的特殊氨基酸的测定定巯基：基：SH,Cys（半胱氨酸）（半胱氨酸）特性：弱酸性特性：弱酸性 pKa=10.28；具有极；具有极强的的还原性，两个半胱氨原性，两个半胱氨酸的酸的巯基靠近脱基靠近脱氢形成

30、二硫形成二硫键。pKa(电离程度离程度)反反应：与与卤代代烃，如：，如：苄氧、碘乙氧、碘乙酰胺，反胺，反应生成生成稳定的定的烃基衍基衍生物。生物。该反反应常用于常用于对巯基的保基的保护。与各种金属形成与各种金属形成稳定性不同的定性不同的络合物，合物，该反反应在研究蛋在研究蛋白白质结构，制构，制备蛋白蛋白质晶体晶体过程中具有重要作用。程中具有重要作用。与某些重金属生成不溶性的硫酸与某些重金属生成不溶性的硫酸盐，导致蛋白致蛋白质失活。失活。与硝基苯甲酸二硫化合物（与硝基苯甲酸二硫化合物（DTNB）反）反应，生成的，生成的产物在物在412nm处有有强烈的光吸收，烈的光吸收，应用用该反反应可以用比色法

31、可以用比色法测定半胱定半胱氨酸的含量。氨酸的含量。在在强氧化氧化剂，如，如过氧甲酸的作用下，半胱氨酸的氧甲酸的作用下，半胱氨酸的巯基和胱氨酸的二硫基和胱氨酸的二硫键都可被氧化生成磺基丙氨酸。都可被氧化生成磺基丙氨酸。第42页，此课件共86页哦羟基：基：Ser（丝氨酸），氨酸），Thr（苏氨酸），氨酸），OH特性：在一般条件下，特性：在一般条件下，丝氨酸和氨酸和苏氨酸分子中的氨酸分子中的羟基都不解离。基都不解离。反反应：与酸作用生成与酸作用生成酯，如，如丝氨酸磷氨酸磷酯，蛋白，蛋白质的磷酸的磷酸化化绝大多数都大多数都发生在生在丝氨酸残基上。氨酸残基上。许多种多种酰化化剂能能够与与酶活性中心的活性

32、中心的丝氨酸氨酸羟基作用，基作用，导致致酶失活。失活。酪氨酸的酚基可与酪氨酸的酚基可与Folin反反应的基的基础，可作，可作为蛋蛋白白质定量。定量。为Millon反反应的基的基础。第43页，此课件共86页哦咪咪唑基：基：His（组氨酸）氨酸）,特性：在生理条件（特性：在生理条件（pH7）下，）下，组氨酸的咪氨酸的咪唑基具有基具有缓冲作冲作用。用。这是因是因为咪咪唑基一基一侧的去的去质子化和另一子化和另一侧的的质子化作用同步子化作用同步进行。行。pH6时，50质子化，子化，pH7时，90去去质子化。也就是子化。也就是说，在生理条件（在生理条件（pH7）下，）下，组氨酸的咪氨酸的咪唑基既可以作基既

33、可以作为质子的受子的受体，也可以作体，也可以作为质子的供体。因此子的供体。因此组氨酸在氨酸在酶催化作用中，起催化作用中，起非常重要的作用。非常重要的作用。反应：反应：Pauly反应（反应（对氨基苯磺酸的重氮氨基苯磺酸的重氮盐，红色产物）胍基：胍基：Arg（精氨酸）（精氨酸）特性特性:具有很具有很强的碱性。的碱性。反反应：与板口：与板口试剂（萘酚、次溴酸酚、次溴酸盐）反）反应生成生成红色，色，该反反应是是鉴定精氨酸存在的定性反定精氨酸存在的定性反应。也可用于定量。也可用于定量测定定第44页，此课件共86页哦甲硫基：甲硫基：Met（甲硫氨酸）（甲硫氨酸）,SCH3特性：甲硫氨基酸特性：甲硫氨基酸侧

34、链上的甲硫基是一个上的甲硫基是一个强的的亲核中心，容核中心，容易与易与卤代代烷发生生亲核反核反应，生成，生成烷基化基化产物。物。该种种产物用物用巯基基试剂处理可以除去理可以除去烷基和原有的甲基，因此与基和原有的甲基，因此与带有有14C标记的碘的碘甲甲烷反反应，再用，再用巯基基试剂处理能理能够得到含有同位素得到含有同位素14C标记的甲硫氨的甲硫氨酸。酸。第45页，此课件共86页哦2.多多肽链的降解的降解1）化学法）化学法l溴化氢法 溴化溴化氰lMet（甲硫氨酸）（甲硫氨酸）X 第46页，此课件共86页哦溴化溴化氢化学降解法其化学降解法其优点：点：一般蛋白一般蛋白质含甲硫氨酸含甲硫氨酸较少，由此可

35、少，由此可获得大片段得大片段专一性一性强产率高达率高达80%以上以上作用条件温和，在室温中用几到十几小作用条件温和，在室温中用几到十几小时即可即可第47页，此课件共86页哦1）化学法）化学法羟胺法 这种方法近十年来开始受人注意，种方法近十年来开始受人注意，羟胺能胺能专一性地裂解一性地裂解Asn（天冬（天冬酰胺）胺）-Glu（谷氨酸）的（谷氨酸）的肽键，酸性条件下裂解，酸性条件下裂解Asn-Pro肽键。已用于某些蛋白。已用于某些蛋白质的分析。的分析。lAsn（天冬（天冬酰胺）胺）Leu（亮氨酸）（亮氨酸）Asn（天冬（天冬酰胺）胺）Ala（丙氨酸）（丙氨酸）N-溴代琥珀溴代琥珀酰亚胺法胺法主要裂

36、解主要裂解Tyr（酪氨酸）（酪氨酸）处的的肽键，五十年代研究，五十年代研究较多。多。但由于它也能断裂但由于它也能断裂Tyr（酪氨酸）（酪氨酸）His(组氨酸氨酸)肽键，因此，因此应用不广。用不广。第48页，此课件共86页哦lNTCB（2-硝基硝基-5-硫硫氰苯甲酸）苯甲酸）lXCys（半胱氨酸）（半胱氨酸）XCys（半胱氨酸）（半胱氨酸）键的裂解：的裂解：l2硝基硝基5硫硫氰苯甲酸（苯甲酸（NTCB）和）和2甲基甲基N1苯磺苯磺酰N4（溴乙（溴乙酰）醌二二亚酰胺（也称胺（也称Cyssor，专切半胱切半胱氨酸）氨酸）l亚碘碘酰基苯甲酸基苯甲酸Trp（色氨酸）（色氨酸）X产率率70-100%第49

37、页，此课件共86页哦1）化学法）化学法（2）部分酸水解法）部分酸水解法Sanger在分析胰在分析胰岛素的一素的一级结构中采用了此法，即构中采用了此法，即用用0.1N盐酸在酸在110或用或用6N盐酸在酸在37水解。水解。这种部分种部分酸水解的方法特异性不酸水解的方法特异性不强，因此，因此对大片段的蛋白大片段的蛋白质和和肽均均不合适。不合适。第50页，此课件共86页哦优点：点：专一性高，降解后的多一性高，降解后的多肽容易容易纯化，化，产率高，副作用小率高，副作用小。注意事注意事项：适合适合酶作用的温度和酸碱度（作用的温度和酸碱度（pH），反），反应时间。酶的用量，待裂解蛋白的用量，待裂解蛋白质的物

38、理状的物理状态。缓冲溶液的离子冲溶液的离子强度等度等酶裂解前需要作裂解前需要作预备实验，掌握好各种条件。，掌握好各种条件。2.多多肽链的降解的降解 2）酶解法解法第51页，此课件共86页哦胰胰蛋蛋白白酶Trypsin：R1=赖氨酸氨酸Lys和精氨酸和精氨酸Arg侧链（专一性一性较强，水解速度，水解速度快）。快）。第52页，此课件共86页哦糜糜蛋蛋白白酶或或胰胰凝凝乳乳蛋蛋白白酶Chymotrypsin：（：（糜蛋白糜蛋白酶）对疏水性氨基酸水解速疏水性氨基酸水解速度比度比较快。快。R1=苯丙氨酸苯丙氨酸Phe,色氨酸色氨酸Trp,酪氨酸酪氨酸Tyr;亮氨酸亮氨酸Leu，蛋氨酸蛋氨酸Met和和组氨

39、酸氨酸His水水解稍慢。解稍慢。第53页，此课件共86页哦胃胃蛋蛋白白酶水解水解专一性比一性比较广。广。Pepsin：R1和和/或或R2=苯丙苯丙氨酸氨酸Phe,色氨酸色氨酸Trp,酪氨酪氨酸酸Tyr;亮氨酸亮氨酸Leu以及其以及其它疏水性氨基酸水解速度它疏水性氨基酸水解速度较快快第54页，此课件共86页哦嗜嗜热菌菌蛋蛋白白酶中性金属中性金属酶它的它的专一性取决于氨基参与形成的一性取决于氨基参与形成的肽键。thermolysin：R2=苯丙氨酸苯丙氨酸Phe,色氨酸色氨酸Trp,酪氨酸酪氨酸Tyr;亮氨酸亮氨酸Leu，异亮氨酸，异亮氨酸Ileu,甲硫氨酸甲硫氨酸Met以及其它以及其它疏水性疏水

40、性强的氨基酸水解速度的氨基酸水解速度较快。快。第55页，此课件共86页哦l金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌Glu蛋白蛋白酶lGluXl谷氨酸谷氨酸羧基端参与形成的基端参与形成的肽键。l梭菌梭菌Arg蛋白蛋白酶(clostripain)lArgXl精氨酸精氨酸羧基端参与形成的基端参与形成的肽键。lLys蛋白蛋白酶lXLysl赖氨酸氨基端参与形成的氨酸氨基端参与形成的肽键。l小羊小羊肾Pro蛋白蛋白酶ProX第56页，此课件共86页哦胰蛋白胰蛋白酶（赖氨酸）氨酸）LysX，（精氨酸），（精氨酸）ArgX(XPro)胰凝乳蛋白胰凝乳蛋白酶（糜蛋白（糜蛋白酶）（酪氨酸）（酪氨酸）TyrX，（色氨酸），（色

41、氨酸）TrpX（苯丙氨酸）（苯丙氨酸）PheX(XPro)嗜嗜热菌蛋白菌蛋白酶X-Leu（亮氨酸）（亮氨酸）,Ile（异亮氨酸）（异亮氨酸）,Phe（苯丙氨酸）（苯丙氨酸）,Trp（色氨酸），（色氨酸），Val（缬氨酸）氨酸）,Tyr（酪氨酸），（酪氨酸），Met（甲硫氨酸）（甲硫氨酸）2）酶解法解法第57页，此课件共86页哦 酶酶法裂解法裂解法裂解法裂解胃蛋白胃蛋白酶Phe（苯丙氨酸）（苯丙氨酸），Trp（色氨酸）（色氨酸）Tyr（酪氨酸），（酪氨酸），Leu（亮氨酸）（亮氨酸）X不能水解不能水解Pro羧基参与形成的基参与形成的肽键。Glu蛋白蛋白酶Glu（谷氨酸）（谷氨酸）XArg蛋白蛋白

42、酶Arg（精氨酸）（精氨酸）XLys蛋白蛋白酶XLys（赖氨酸）氨酸）Pro蛋白蛋白酶ProX第58页，此课件共86页哦氨基酸的修氨基酸的修饰与保与保护（1）赖氨酸的修氨酸的修饰胰蛋白胰蛋白酶第59页，此课件共86页哦2）酶解法解法（1）赖氨酸的修氨酸的修饰蛋白蛋白质中的中的赖氨酸，氨酸，经顺丁丁烯酰化作用后，被胰蛋白化作用后，被胰蛋白酶水水解解 第60页，此课件共86页哦2）氨基酸的修氨基酸的修饰与保与保护（2）精氨酸的修饰胰蛋白胰蛋白酶第61页，此课件共86页哦2）酶解法解法（3）半胱氨酸的修饰 第62页，此课件共86页哦l肽链的裂解和重的裂解和重组大致有三种情况：一种大致有三种情况：一种

43、是非特异性裂解，如酸水解。由于裂解的是非特异性裂解，如酸水解。由于裂解的片段片段较小，造成分离的困小，造成分离的困难。因此。因此这种非种非特异性裂解特异性裂解对大分子大分子肽链是不适用的。第是不适用的。第二种是特异性裂解，采用两种以上的二种是特异性裂解，采用两种以上的专一一裂解，然后裂解，然后进行行组合，合，这种方法一般也适种方法一般也适用于分子量小于用于分子量小于5万的蛋白万的蛋白质。第三种是逐。第三种是逐步的步的专一裂解，首先将某种氨基酸一裂解，首先将某种氨基酸进行化行化学修学修饰，使水解，使水解酶专一断裂某一种氨基酸，一断裂某一种氨基酸，分成若干片段，然后解除化学封分成若干片段，然后解除

44、化学封闭，再用，再用此此酶裂解，使曾被封裂解，使曾被封闭过的氨基酸断裂。的氨基酸断裂。目前目前倾向于采用向于采用这种裂解方式。种裂解方式。第63页，此课件共86页哦大部分大部分肽段的分离主要通段的分离主要通过凝胶凝胶过滤法法，由于大分子，由于大分子肽溶解溶解度小。往往采用甲酸、醋酸、丙酸等有机溶度小。往往采用甲酸、醋酸、丙酸等有机溶剂使之溶解。使之溶解。单用凝胶用凝胶过滤法分离法分离肽段一般段一般纯度不高，常需度不高，常需辅以以离子交离子交换层析法析法，大片段，大片段肽可用离子交可用离子交换葡聚糖作葡聚糖作载体，小体，小肽则多用多用Dowex-50等等树脂。脂。小小肽分离分离还常采用高常采用高

45、压电泳与泳与层析相析相结合的指合的指纹图谱法，得到法，得到纯净肽 3肽段的分离和段的分离和纯度度鉴定定第64页，此课件共86页哦凝胶凝胶过滤法法l凝胶凝胶过滤法又称分子排阻法，法又称分子排阻法，这是一种高效分离是一种高效分离纯化化蛋白蛋白质的方法。原理是不同的蛋白的方法。原理是不同的蛋白质分子分子对固定化在固定化在载体上的特殊配基具有不同的体上的特殊配基具有不同的识别和和结合能力。合能力。选择与待与待纯化蛋白化蛋白质具有特殊具有特殊识别和和结合作用的配基，然后合作用的配基，然后应用用化学方法将化学方法将该配基与配基与载体共价体共价链接。将接。将这种有配基的种有配基的载体装入体装入层析柱中，当含

46、有待析柱中，当含有待纯化的蛋白化的蛋白质溶液通溶液通过层析析柱柱时，该蛋白蛋白质即与配基即与配基发生特异性生特异性结合而被吸附在合而被吸附在层析柱上，而其他蛋白析柱上，而其他蛋白质则流出柱外。被特异性流出柱外。被特异性结合在合在层析柱上的蛋白析柱上的蛋白质，可以用适当的配体洗脱液洗脱，可以用适当的配体洗脱液洗脱第65页，此课件共86页哦离子交离子交换层析析l固定相是离子交固定相是离子交换剂的的层析分离技析分离技术。样品中待分离的溶品中待分离的溶质离子，与固定相上所离子，与固定相上所结合的离子交合的离子交换，不同的溶，不同的溶质离子与离子交离子与离子交换剂上离子化的基上离子化的基团的的亲和力和和

47、力和结合条件合条件不同，洗脱液流不同，洗脱液流过时，样品中的离子按品中的离子按结合力的弱合力的弱强先后洗脱。在生物化学和分子先后洗脱。在生物化学和分子生物学生物学领域此法常用于分离蛋白域此法常用于分离蛋白质、核酸、核酸等生物大分子。等生物大分子。第66页，此课件共86页哦l支持物是人工交支持物是人工交联的的带有能解离基有能解离基团的有机高分子，的有机高分子，如离子交如离子交换树脂、离子交脂、离子交换纤维素、离子交素、离子交换凝胶凝胶等。等。带阳离子基阳离子基团的，如磺酸基（的，如磺酸基（SO3H）、）、羧甲甲基（基（CH2COOH）和磷酸基等）和磷酸基等为阳离子交阳离子交换剂。带阴离子基阴离子

48、基团的，如的，如DEAE（二乙基胺乙基）和（二乙基胺乙基）和QAE（四（四级胺乙基）等胺乙基）等为阴离子交阴离子交换剂。离子交。离子交换层析只适用于能在水中解离的化合物，包括有机物和无析只适用于能在水中解离的化合物，包括有机物和无机物。机物。对于蛋白于蛋白质、核酸、氨基酸及核苷酸的分离分析、核酸、氨基酸及核苷酸的分离分析有极好的分辨力。离子交有极好的分辨力。离子交换基基团在水溶液中解离后，能在水溶液中解离后，能吸引水中被分离物的离子，各种物吸引水中被分离物的离子，各种物质在离子交在离子交换剂上的上的离子离子浓度与周度与周围溶液的离子溶液的离子浓度保持平衡状度保持平衡状态，各种离，各种离子有不同

49、的交子有不同的交换常数，常数，K值愈高，被吸附愈牢。洗脱愈高，被吸附愈牢。洗脱时，增加溶液的离子，增加溶液的离子强度，如改度，如改变pH，增加，增加盐浓度，度，离子被取代而解吸下来。洗脱离子被取代而解吸下来。洗脱过程中，按程中，按K值不同，不同，分成不同的区分成不同的区带。第67页，此课件共86页哦蛋白蛋白质分离分离纯化（化（细分分级）的方法都可以用。）的方法都可以用。对角角线法：双向法：双向电泳和双向泳和双向层析，第一相析，第一相电泳后不作泳后不作任何任何处理理进行第二相行第二相电泳，得到泳，得到对角角线图谱说明明肽段段纯度高。改良度高。改良对角角线技技术可以确定二硫可以确定二硫键的存在。的

50、存在。高效液相色高效液相色谱：目前已：目前已经成成为纯化蛋白化蛋白质和多和多肽的有力工具。的有力工具。层析和析和电泳泳游离末端游离末端鉴定定纯度度鉴定：定：第68页，此课件共86页哦4.肽的的顺序分析序分析 1）化学法）化学法Edman降解法降解法（一）（一）Edman化学降解法：分析短化学降解法：分析短肽最基本、最有效的方法最基本、最有效的方法Edman试剂：异硫：异硫氰酸苯酸苯酯（PITC或或PTC）降解降解过程：程：（1）耦）耦联反反应：PITC与与肽段段N末端氨基酸的末端氨基酸的氨基氨基（游离）在碱性条件下（游离）在碱性条件下发生耦生耦联反反应，生成，生成PTC肽。（2）断裂反）断裂反