12_基因工程的基本操作程序edp.pptx

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1、1.2 基因工程的基本操作程序基因工程基本操作的四个基因工程基本操作的四个步步步步骤骤1 1、目的基因的获取、目的基因的获取2 2、基因表达载体的构建、基因表达载体的构建3 3、目的基因导入受体细胞、目的基因导入受体细胞4 4、目的基因的检测与鉴定、目的基因的检测与鉴定有了目的基因，我们才能赋予有了目的基因，我们才能赋予一种生物以另一种生物的遗传一种生物以另一种生物的遗传特性。特性。使目的基因在受体细胞中稳使目的基因在受体细胞中稳定存在，并可进行遗传、表定存在，并可进行遗传、表达和发挥作用达和发挥作用 载体进入受体细胞稳定表达，载体进入受体细胞稳定表达，才能实现一种生物的基因在才能实现一种生物

2、的基因在另一种生物中的转化。另一种生物中的转化。才能确定目的基因是否真正才能确定目的基因是否真正在受体细胞中稳定遗传和正在受体细胞中稳定遗传和正确表达。确表达。一、目的基因的获取1 1目的基因主要是目的基因主要是编码蛋白质的基因编码蛋白质的基因：如：与生物抗性相关的基因、与优良品质相关的基因、与生物药物和保健品相关的基因、与毒物降解相关的基因、与工业用酶相关的基因、具调控作用的因子等。2 2获取目的基因的常用方法：获取目的基因的常用方法：1 1、从基因文库中获取、从基因文库中获取2 2、利用、利用PCRPCR技术扩增技术扩增3 3、人工合成、人工合成1.从基因文库中获取目的基因1.基因文库的概

3、念基因文库的概念:将含有某种生物不同基因的许多将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受体菌的片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因。群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因。2.基因文库的种类基因文库的种类:基因组文库：基因组文库：含有一种生物的含有一种生物的全部全部基因基因部分基因文库：部分基因文库：只包含了一种生物的只包含了一种生物的部分部分基因，基因，如：如：cDNA文库文库基因组DNA文库与cDNA文库某生物体内全部某生物体内全部DNADNA 许多许多DNADNA片段片段受体菌群体受体菌群体限制酶限制酶与运载体连接导入与运载体连接导入基因组文库基因

4、组文库cDNAcDNA反转录反转录受体菌群体受体菌群体与运载体连接导入与运载体连接导入cDNA文库文库某种生物某个时期的某种生物某个时期的mRNAmRNA基因的结构非编码区非编码区非编码区非编码区编码区编码区RNA聚合酶聚合酶结合位点结合位点外显子外显子内含子内含子终止子终止子启动子启动子原核原核真核真核原核细胞的基因结构非编码区非编码区非编码区非编码区编码区编码区编码区上游编码区上游 编码区下游编码区下游 与与RNARNA聚合酶结合位点聚合酶结合位点启动子启动子终止子终止子不编码蛋白质。不编码蛋白质。：编码蛋白质：编码蛋白质 ,连续不间断连续不间断编码区编码区非编码区非编码区调控遗传信息表达

5、调控遗传信息表达,上上 游的游的RNARNA聚合酶结合位点聚合酶结合位点:基因结构基因结构真核细胞的基因结构编码区编码区非编码区非编码区非编码区非编码区内含子内含子 外显子外显子 启动子启动子终止子终止子编码区上游编码区上游 编码区下游编码区下游 编码区编码区非编码区非编码区外显子：能编码蛋白质的序列外显子：能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列：有调控作用：有调控作用,上游有上游有RNARNA聚合聚合 酶结合位点酶结合位点(启动子启动子)。与与RNARNA聚合酶聚合酶结合位点结合位点基因结构基因结构原核细胞与真核细胞的基因结构比较原核细胞原核细胞真核细胞真

6、核细胞不同点不同点编码区是编码区是_的，边的，边_边边_编码区是间隔的、编码区是间隔的、_的，先的，先_后后_相同点相同点都由能够编码蛋白质的都由能够编码蛋白质的_和具有和具有调控作用的调控作用的_区组成的区组成的连续连续不连续不连续编码区编码区非编码非编码转录转录翻译翻译转录转录翻译翻译基因文库的构建方法 基因组文库的构建基因组文库的构建提取某种生物的提取某种生物的全部全部DNADNA用适当的限制酶酶切用适当的限制酶酶切一定大小的一定大小的DNADNA片段片段将将DNADNA片段与载体连接片段与载体连接重组载体重组载体基因组文库基因组文库导入受体菌中储存导入受体菌中储存 cDNA文库的构建文

7、库的构建-逆转录法：逆转录法：提取某种生物的某器官提取某种生物的某器官或或特定特定发育时期的发育时期的mRNAmRNA单链单链DNADNA双链双链cDNAcDNA片段片段重组载体重组载体与载体连接与载体连接cDNAcDNA文库文库反（逆）转录酶反（逆）转录酶DNADNA聚合酶聚合酶导入受体菌中储存导入受体菌中储存思考？思考？真核生物的基因用逆转录法得到的真核生物的基因用逆转录法得到的cDNAcDNA与原基因相同吗？与原基因相同吗？真核细胞的cDNA的获取编码区编码区编码区编码区非编码区非编码区非编码区非编码区非编码区非编码区非编码区非编码区DNA聚合酶聚合酶剪接有关的酶剪接有关的酶RNA聚合酶

8、聚合酶mRNA前体前体mRNA单链单链DNAcDNA逆转录酶逆转录酶转录转录剪接剪接逆转录逆转录复制复制启动子启动子启动子启动子终止子终止子基因基因不含不含非编码非编码序列序列。即不。即不含含非编码区非编码区和和内含子内含子基因组DNA文库与cDNA文库的比较 文库类型文库类型 cDNA文库文库 基因组文库基因组文库 文库大小文库大小基因中启动子（具有启基因中启动子（具有启动作用的动作用的DNA片段）片段）基因中内含子基因中内含子(位于编位于编码蛋白质序列的非编码码蛋白质序列的非编码DNA片段）片段）基因多少基因多少 物种间的基因交流物种间的基因交流小小大大无无有有无无有有某种生物的部分基因某

9、种生物的部分基因 某种生物的全部基因某种生物的全部基因可以可以部分基因可以部分基因可以怎样从基因文库中得怎样从基因文库中得到我们所需的目的基到我们所需的目的基因呢因呢?依据：目的基因的有关信息。依据：目的基因的有关信息。如：根据基因的核苷酸序列如：根据基因的核苷酸序列 基因的功能基因的功能 基因在染色体上的位置基因在染色体上的位置 基因的转录产物基因的转录产物mRNAmRNA 基因翻译产物蛋白质等特性基因翻译产物蛋白质等特性从基因文库中得到目的基因的方法从基因文库中得到目的基因的方法2.利用PCR技术扩增目的基因1 1概念：概念：PCRPCR全称为全称为_，是一项，是一项 在生物在生物_复制复

10、制_的核酸合成技术。的核酸合成技术。2 2原理：原理：DNADNA复制复制原料：原料：模板模板DNADNA；DNADNA引物；四种脱氧核苷引物；四种脱氧核苷酸；热稳定酸；热稳定DNADNA聚合酶聚合酶多聚酶链式反应多聚酶链式反应体外体外特定特定DNADNA片段片段3 3前提：前提：已知目的基因的一段核苷酸序列已知目的基因的一段核苷酸序列PCR技术的操作过程aDNAaDNA变性变性（90-9590-95）：双）：双链链DNADNA模板在热作用下，模板在热作用下，_断裂，形成断裂，形成_b b、退火、退火（复性复性55-6555-65）：）：系统温度降低，系统温度降低，引物引物与与DNADNA模模

11、板结合，形成局部板结合，形成局部_。c c、延伸、延伸（70-7570-75）：在）：在TaqTaq酶酶的作用下，合成与模板的作用下，合成与模板互补的互补的_。氢键氢键单链单链DNADNA双链双链DNADNA链链d.重复重复a.b.ca.b.c步骤：每重复一步骤：每重复一次，目的基因增加次，目的基因增加_倍倍一一2 2、利用、利用PCRPCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因PCR技术的操作过程PCRPCR反应体系中目的基因成反应体系中目的基因成反应体系中目的基因成反应体系中目的基因成指数指数指数指数(2(2n n)形式扩增形式扩增形式扩增形式扩增PCR技术扩增与技术扩增与DNA复制的比较复制的

12、比较DNA复制复制PCR技术技术场所场所原理原理条件条件解旋方式解旋方式酶酶特点特点结果结果碱基互补配对原则碱基互补配对原则碱基互补配对原则碱基互补配对原则四种脱氧核苷酸、模四种脱氧核苷酸、模板、酶、板、酶、ATP四种脱氧核苷酸、四种脱氧核苷酸、模板、酶、模板、酶、引物引物DNA在高温下变性解旋在高温下变性解旋解旋酶催化解旋解旋酶催化解旋半保留复制、半保留复制、边解旋边复制边解旋边复制半保留复制、半保留复制、全解旋再复制全解旋再复制体外复制体外复制主要在细胞核内主要在细胞核内大量的大量的DNA片段片段形成整个形成整个DNA分子分子热稳定的热稳定的DNA聚合酶聚合酶细胞内的细胞内的DNA聚合酶、

13、聚合酶、解旋酶等解旋酶等PCR技术的操作过程aDNAaDNA变性变性（90-9590-95）：双）：双链链DNADNA模板在热作用下，模板在热作用下，_断裂，形成断裂，形成_b b、退火、退火（复性复性55-6555-65）：）：系统温度降低，系统温度降低，引物引物与与DNADNA模模板结合，形成局部板结合，形成局部_。c c、延伸、延伸（70-7570-75）：在）：在TaqTaq酶酶的作用下，合成与模板的作用下，合成与模板互补的互补的_。氢键氢键单链单链DNADNA双链双链DNADNA链链d.重复重复a.b.ca.b.c步骤：每重复一步骤：每重复一次，目的基因增加次，目的基因增加_倍倍一一

14、人工合成法反转录法反转录法目的基因的信使目的基因的信使RNARNA目的基因目的基因化学合成法化学合成法肽链氨基酸序列肽链氨基酸序列信使信使RNARNA序列序列基因的核苷酸序列基因的核苷酸序列目的基因目的基因合成合成推测推测推测推测单链单链DNADNA合成合成 在基因较小，核苷酸序列已知的情况下，可在基因较小，核苷酸序列已知的情况下，可以利用以利用DNADNA合成仪人工合成合成仪人工合成蛋白质的氨基酸序列蛋白质的氨基酸序列mRNAmRNA的核苷酸序列的核苷酸序列基因的核苷酸序列基因的核苷酸序列目的基因目的基因化学合成化学合成推测推测推测推测思考：思考：化学法合化学法合成的目的基因含成的目的基因含

15、内含内含子、启动子和终止子子、启动子和终止子吗？吗？目的基因的获取目的基因的获取1 1、从基因文库中获取、从基因文库中获取2 2、利用、利用PCRPCR技术扩增技术扩增3 3、人工合成、人工合成种种类类基因组文库：基因组文库：含有一种生物的含有一种生物的全部全部基因基因部分基因文库：部分基因文库：只包含了一种生物的只包含了一种生物的部分部分基因，基因，如：如：cDNA文库文库二、基因表达载体的构建 基因工程的核心基因工程的核心1 1目的：目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。2 2基因基因表达载体表达载体的组成：的组成：复制原点复制原点+

16、目的基因目的基因+启动子启动子+终止子终止子+标记基因标记基因表达载体启动子：启动子：位于基因的首端的一段位于基因的首端的一段特殊的特殊的DNADNA片断，它是片断，它是RNARNA聚合酶聚合酶识别和结合的部位识别和结合的部位，有了它才能，有了它才能驱动基因转录出驱动基因转录出mRNAmRNA，最终获得最终获得蛋白质蛋白质终止子：终止子：位于基因的尾端的一段位于基因的尾端的一段特殊的特殊的DNADNA片断，片断，能终止能终止mRNAmRNA的的转录转录标记基因标记基因的作用是的作用是为了为了鉴别鉴别受体受体细胞中是否含有目的基因，从而细胞中是否含有目的基因，从而将有目的基因的细胞筛选出来将有目

17、的基因的细胞筛选出来基因表达载体的构建过程质粒质粒DNADNA分子分子限制酶处理限制酶处理两个切口两个切口获得目的基因获得目的基因DNADNA连接酶连接酶重组重组DNADNA分子（重组质粒）分子（重组质粒）同一种同一种一个切口一个切口两个黏性末端两个黏性末端注意：载体载体与与表达载体表达载体的区别：二者都有标记基因和复制的区别：二者都有标记基因和复制原点两部分原点两部分DNADNA片段。表达载体在载体基础上增加了片段。表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子目的基因、启动子、终止子三部分结构三部分结构用到的工具酶：用到的工具酶：既用到限制酶切割载体，又用到既用到限制酶切割载体，又用到

18、DNADNA连接酶将目的基因和载体拼接，两种酶作用的化连接酶将目的基因和载体拼接，两种酶作用的化学键都是磷酸二酯键学键都是磷酸二酯键启动子、终止子启动子、终止子对于目的基因表达必不可少对于目的基因表达必不可少目的基因不能单独进入受体细胞，目的基因不能单独进入受体细胞，必需以表达载体必需以表达载体的方式携带进去。的方式携带进去。三、将目的基因导入受体细胞1 1转化：转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。2 2常用的受体细胞：常用的受体细胞：大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。和动植物细胞等。3 3目的基因导入受

19、体细胞的原理：目的基因导入受体细胞的原理：借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。1、目的基因导入植物细胞的方法（1 1）农杆菌转化法）农杆菌转化法 农杆菌特点：易感染双子叶植物和裸子植农杆菌特点：易感染双子叶植物和裸子植 物，对大多数单子叶植物没有感染能力。物，对大多数单子叶植物没有感染能力。原理：原理：TiTi质粒上的质粒上的T-DNAT-DNA可以转移到受可以转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的体细胞，并整合到受体细胞染色体的DNADNA上。上。三、目的基因导入受体细胞三、目的基因导入受体细胞构建基因表达载体构建基因表达载体转入转入农杆菌农杆菌植物细胞植物细胞导入

20、导入稳定维持和表达稳定维持和表达过程：过程：1、目的基因导入植物细胞的方法（2 2）基因枪法：）基因枪法：目的基因导入单子叶植物细胞目的基因导入单子叶植物细胞 操作方法：利用压缩气体产生的动力操作方法：利用压缩气体产生的动力，将，将包裹在金属粒表面的表达载体包裹在金属粒表面的表达载体DNA打入受体打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法。钨粉粒子和金粉粒子，粒子的直径一般在钨粉粒子和金粉粒子，粒子的直径一般在0.64um。适用：通常是适用：通常是单子叶植物单子叶植物1、目的基因导入植物细胞的方法（3 3）花粉管通道法：）花粉管通道法：将目的基因导入植

21、物细胞将目的基因导入植物细胞 操作方法：在植物花受粉后，花粉形成花操作方法：在植物花受粉后，花粉形成花粉管还末愈合前期，剪去柱头，然后，滴入粉管还末愈合前期，剪去柱头，然后，滴入DNA（含的基因）使目的基因借助花粉管通（含的基因）使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞道进入受体细胞 特点特点:十分简便经济。十分简便经济。例：转基因抗虫棉例：转基因抗虫棉2、将目的基因导入动物细胞方法：显微注射法方法：显微注射法程序程序目的基因表达载体提纯目的基因表达载体提纯 取卵（受精卵）取卵（受精卵）显微注射显微注射 受精卵受精卵 新性状动物新性状动物3、将目的基因导入微生物细胞微生物作受体细胞原因微生物作受体

22、细胞原因：繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少常用菌：大肠杆菌常用菌：大肠杆菌常用法：常用法：CaCa2+2+处理处理获得感受态细胞获得感受态细胞过程：过程：CaCaCaCa2+2+2+2+处理处理处理处理大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌感受态感受态感受态感受态 细胞细胞细胞细胞感受态细胞感受态细胞感受态细胞感受态细胞 吸收吸收吸收吸收DNADNA表达载体表达载体表达载体表达载体与感受态与感受态与感受态与感受态细胞混合细胞混合细胞混合细胞混合小结：将目的基因导入受体细胞生物种类生物种类植物细胞植物细胞动物细胞动物细胞微生物细胞微生物细胞常用方法常用方法农杆菌转化

23、法农杆菌转化法显微注射技术显微注射技术CaCa2+2+处理法处理法受体细胞受体细胞体细胞体细胞受精卵受精卵原核细胞原核细胞转化过程转化过程将目的基因插入到将目的基因插入到TiTi质粒的质粒的T-DNAT-DNA上上农杆菌农杆菌导入植导入植物细胞物细胞整合到受整合到受体细胞的体细胞的DNADNA表表达达将含有目的基因将含有目的基因的表达载体提纯的表达载体提纯取卵（受精卵）取卵（受精卵）显微注射显微注射受受精卵发育精卵发育获得获得具有新性状的动具有新性状的动物物CaCa2+2+处理细胞处理细胞感受态细胞感受态细胞重组表达载重组表达载体与感受态细体与感受态细胞混合胞混合感受感受态细胞吸收态细胞吸收D

24、NADNA分子分子 四、目的基因的检测与鉴定导入过程完成后，全部受体细胞都能摄导入过程完成后，全部受体细胞都能摄 入重组入重组DNADNA分子吗？分子吗？1 1真正能摄入重组真正能摄入重组真正能摄入重组真正能摄入重组DNADNADNADNA分子的受体细胞很少。分子的受体细胞很少。分子的受体细胞很少。分子的受体细胞很少。2 2目的基因进入受体细胞后，是否都能稳定目的基因进入受体细胞后，是否都能稳定维持和表达？维持和表达？不一定，需要检测不一定，需要检测不一定，需要检测不一定，需要检测1、鉴定分子水平的鉴定转基因生转基因生物的物的DNA探针探针15N N15N N14N N14N N（1 1）检测

25、转基因生物染色体的）检测转基因生物染色体的DNADNA上是否插入了上是否插入了目的基因目的基因基因探针：基因探针：放射性同位素等标记的放射性同位素等标记的DNA分子分子方法方法 DNA分子杂交技术分子杂交技术变性变性变性变性变性变性变性变性1、鉴定分子水平的鉴定变性变性变性变性方法方法 分子杂交技术分子杂交技术（2）检测目的基因是否转录出了）检测目的基因是否转录出了mRNA探针探针15N N15N N转基因生物转基因生物的的mRNA14N N14N N1、鉴定分子水平的鉴定提取提取（3）检测目的基因是否翻译成蛋白质）检测目的基因是否翻译成蛋白质方法方法抗原抗原-抗体杂交抗体杂交苏云金杆菌苏云金

26、杆菌Bt毒素蛋白毒素蛋白将将Bt毒蛋白注毒蛋白注射小鼠体内射小鼠体内从小鼠血管抽出从小鼠血管抽出血液分离出抗血液分离出抗Bt毒素的抗体毒素的抗体抗体抗体蛋白质蛋白质 出现出现杂交带杂交带脱分化脱分化组织培养组织培养2、鉴定个体水平的鉴定抗虫、抗病接种实验，活性比较实验抗虫、抗病接种实验，活性比较实验例：用棉铃饲喂棉例：用棉铃饲喂棉铃虫，如虫吃后不出现铃虫，如虫吃后不出现中毒症状，说明未摄入中毒症状，说明未摄入目的基因或摄入目的基目的基因或摄入目的基因未表达。如虫吃后中因未表达。如虫吃后中毒死亡，则说明摄入了毒死亡，则说明摄入了抗虫基因并得到表达。抗虫基因并得到表达。思考？思考？不能，受体细胞必

27、须表现出特定的性不能，受体细胞必须表现出特定的性状，才能说明目的基因完成了状，才能说明目的基因完成了表达表达。受体细胞摄入受体细胞摄入DNA分子后就说明目的基分子后就说明目的基因完成了表达吗？因完成了表达吗？课堂练习1 1、有关基因工程的叙述中，错误的是有关基因工程的叙述中，错误的是()()A A、DNADNA连接酶将黏性末端的碱基对连接起来连接酶将黏性末端的碱基对连接起来 B B、限制性内切酶用于目的基因的获得、限制性内切酶用于目的基因的获得 C C、目的基因须由运载体导入受体细胞、目的基因须由运载体导入受体细胞 D D、人工合成目的基因不用限制性内切酶、人工合成目的基因不用限制性内切酶A课

28、堂练习2 2、下列属于获取目的基因的方法的是下列属于获取目的基因的方法的是()()利用利用mRNAmRNA反转录形成反转录形成 从基因组文库中提取从基因组文库中提取 从受体细胞中提取从受体细胞中提取 利用利用PCRPCR技术技术 利用利用DNADNA转录转录 人工合成人工合成 A.B.A.B.C.D.C.D.D课堂练习3 3、有关基因工程的叙述正确的是、有关基因工程的叙述正确的是 （）A A、限制酶只在获得目的基因时才用、限制酶只在获得目的基因时才用 B B、重组质粒的形成在细胞内完成、重组质粒的形成在细胞内完成 C C、质粒都可作为运载体、质粒都可作为运载体 D D、蛋白质的结构可为合成目的

29、基因提供、蛋白质的结构可为合成目的基因提供资料资料D【拓展深化拓展深化】工具酶只有两种：限制酶在操作程序工具酶只有两种：限制酶在操作程序1 1、2 2中用到且中用到且要求用同一种，目的是产生相同的黏性末端；要求用同一种，目的是产生相同的黏性末端；DNADNA连接酶只在操作程序连接酶只在操作程序2 2中用到。中用到。课堂练习4 4、基因工程是在、基因工程是在DNADNA分子水平上进行设计施工分子水平上进行设计施工的。在基因操作的基本步骤中，不进行碱基互的。在基因操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对的步骤是补配对的步骤是 （）A A、人工合成目的基因、人工合成目的基因 B B、目的基因与运载体结合

30、、目的基因与运载体结合 C C、将目的基因导入受体细胞、将目的基因导入受体细胞 D D、目的基因的检测和表达、目的基因的检测和表达C【拓展深化拓展深化】只有第三步将目的基因导入受只有第三步将目的基因导入受体细胞不需碱基互补配对，其余三个步骤都涉体细胞不需碱基互补配对，其余三个步骤都涉及碱基互补配对及碱基互补配对课堂练习即时应用即时应用(随学随练，轻松夺冠随学随练，轻松夺冠)5(2009年高考浙江卷年高考浙江卷)下列关于基因工程的叙述，下列关于基因工程的叙述，错误的是错误的是()A目的基因和受体细胞均可来自动、植物或微生目的基因和受体细胞均可来自动、植物或微生物物B限制性核酸内切酶和限制性核酸内切酶和DNA连接酶是两类常用的连接酶是两类常用的工具酶工具酶C人胰岛素原基因在大肠杆菌中表达的胰岛素原人胰岛素原基因在大肠杆菌中表达的胰岛素原无生物活性无生物活性D载体上的抗性基因有利于筛选含重组载体上的抗性基因有利于筛选含重组DNA的细的细胞和促进目的基因的表达胞和促进目的基因的表达D D演讲完毕，谢谢观看！