ch基因工程工具酶.pptx

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1、3.1 3.1 3.1 3.1 限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶 3.2 DNA 3.2 DNA 3.2 DNA 3.2 DNA 聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶3.3 3.3 3.3 3.3 其他分子克隆工具其他分子克隆工具其他分子克隆工具其他分子克隆工具酶酶酶酶 第1页/共88页限制性内切酶限制性内切酶(Restriction(RestrictionEndonuclease)Endonuclease)3.1.13.1.1限制与修饰（限制与修饰（RestrictionandmodificationRestrictionandmodification）现象）现象限制：限制：指一定类型的

2、细菌可以通过限制酶的作用，破坏入侵的噬菌体指一定类型的细菌可以通过限制酶的作用，破坏入侵的噬菌体DNADNA，导致噬，导致噬菌体的寄主幅度受到限制。菌体的寄主幅度受到限制。修饰：修饰：指寄主本身的指寄主本身的DNADNA，由于在合成后通过甲基化酶的作用得以甲基化，使，由于在合成后通过甲基化酶的作用得以甲基化，使DNADNA得以修饰得以修饰,从而免遭自身限制性酶的破坏。从而免遭自身限制性酶的破坏。第2页/共88页3.1.23.1.2限制性核酸内切酶的概念限制性核酸内切酶的概念是一类能够识别双链是一类能够识别双链DNADNADNADNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割分子中的某种特定核苷酸序

3、列，并由此切割DNADNADNADNA双链结构双链结构的核酸水解酶。的核酸水解酶。至至20062006年年22月共发现月共发现37733773种限制性内切酶，种限制性内切酶，II、IIII、IIIIII型各有型各有6868、36923692、1010种，种，甲基化指导的甲基化指导的33种，商品化的种，商品化的609609种，种，IIII型中共有型中共有223223种特异性。种特异性。第3页/共88页第4页/共88页 第一个字母（大写，斜体）代表该酶的宿主菌属名第一个字母（大写，斜体）代表该酶的宿主菌属名(genus)(genus)(genus)(genus)第二、三个字母第二、三个字母(小写，

4、斜体小写，斜体)代表宿主菌种名代表宿主菌种名(species)(species)(species)(species)第四个字母代表宿主菌的株或型第四个字母代表宿主菌的株或型(strain)(strain)(strain)(strain)罗马字母表示发现和分离的先后顺序罗马字母表示发现和分离的先后顺序3.1.33.1.3限制性核酸内切酶的命名原则限制性核酸内切酶的命名原则第5页/共88页限制性核酸内切酶的命名原则：限制性核酸内切酶的命名原则：限制性核酸内切酶的命名原则：限制性核酸内切酶的命名原则：属名属名属名属名种名种名种名种名株名株名株名株名HHaemophilusaemophilusinin

5、fluenzaefluenzaedd流感嗜血杆菌流感嗜血杆菌流感嗜血杆菌流感嗜血杆菌dd株株株株HHininddHHinindd同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶第6页/共88页 型（型（typetype）：限制酶一般是同源二聚体，修饰酶是单体，限制酶一般是同源二聚体，修饰酶是单体，93%93%型（型（typetype）：限制酶、甲基化酶识别限制酶、甲基化酶识别DNADNA序列的序列的SS亚基亚基，1%1%型（型（typetype）：不到：不到1%1%3.1.4

6、3.1.4限制与修饰系统的种类限制与修饰系统的种类第7页/共88页3.1.53.1.5限制酶识别的序列限制酶识别的序列 3.1.5.13.1.5.1限制酶识别序列的长度及结构限制酶识别序列的长度及结构 限制酶识别序列的长度一般为限制酶识别序列的长度一般为4-84-8个碱基，最常见的为个碱基，最常见的为66个碱基个碱基44个碱基识别位点：个碱基识别位点：SauSau3A3A55个：个：EcoEcoRRNciNci66个：个：EcoEcoRRHinHindd77个：个：BbvBbvCCPpuPpuMM88个：个：NotNotSfiSfi第8页/共88页第9页/共88页限制酶识别序列的结构限制酶识别

7、序列的结构（11）限制酶识别的序列大多数为回文对称结构）限制酶识别的序列大多数为回文对称结构（22）识别序列不是对称的）识别序列不是对称的（33）可识别多种序列）可识别多种序列 第10页/共88页3.1.5.33.1.5.3酶切位点酶切位点（11）限制酶切割的位置）限制酶切割的位置限制酶对限制酶对DNADNA的切割位置大多数在内部的切割位置大多数在内部（22）位点偏爱（）位点偏爱（SitepreferenceSitepreference）位点偏爱：位点偏爱：对不同位置的同一个识别序列表现出不同的切割效率的现象。对不同位置的同一个识别序列表现出不同的切割效率的现象。（33）酶切位点在基因组中分布

8、的不均一性）酶切位点在基因组中分布的不均一性（44）酶切位点的引入酶切位点的引入第11页/共88页3.1.63.1.6限制酶产生的末端限制酶产生的末端（11）限制酶产生匹配粘端（）限制酶产生匹配粘端（matchedendsmatchedends）（22）限制酶产生平末端（限制酶产生平末端（BluntendBluntend）（33）限制酶产生非对称突出端限制酶产生非对称突出端（44）同裂酶同裂酶（55）同尾酶同尾酶 第12页/共88页第13页/共88页第14页/共88页第15页/共88页Tris-HClTris-HCl MgClMgCl2210mmol/L10mmol/L NaCl0-100mm

9、ol/LNaCl0-100mmol/L DTT1mmol/LDTT1mmol/L Volume20-100Volume20-100 LL Temperature37Temperature37 11个单位限制性核酸内切酶个单位限制性核酸内切酶3.1.73.1.7酶切反应条件酶切反应条件第16页/共88页3.1.7.13.1.7.1缓冲液缓冲液常规缓冲液一般包括提供稳定常规缓冲液一般包括提供稳定pHpH值（值（）的缓冲剂、）的缓冲剂、Mg+Mg+、DTTDTT（二硫苏糖（二硫苏糖醇）以及醇）以及BSABSA。3.1.7.23.1.7.2反应温度反应温度大多数为大多数为3737第17页/共88页3.

10、1.7.33.1.7.3反应时间反应时间反应时间通常为反应时间通常为11小时或更多，许多酶延长反应时间可减少酶的用量。小时或更多，许多酶延长反应时间可减少酶的用量。3.1.7.43.1.7.4终止酶切的方法终止酶切的方法EDTAEDTA加热加热第18页/共88页DNADNA样品的纯度样品的纯度DNADNA样品的甲基化程度样品的甲基化程度酶切反应的温度酶切反应的温度DNADNA分子结构（底物构象）分子结构（底物构象）核酸内切酶的缓冲液核酸内切酶的缓冲液3.1.7.53.1.7.5影响酶活性的因素影响酶活性的因素 第19页/共88页限制性核酸内切酶的星活性限制性核酸内切酶的星活性(star act

11、ivity)(star activity)在在在在极极极极端端端端非非非非标标标标准准准准反反反反应应应应条条条条件件件件下下下下，限限限限制制制制性性性性核核核核酸酸酸酸内内内内切切切切酶酶酶酶能能能能切切切切割割割割与与与与特特特特异异异异识识识识别别别别序序序序列列列列相相相相似似似似的的的的序序序序列列列列,降降降降低低低低酶酶酶酶切切切切反反反反应应应应的的的的特特特特异异异异性性性性,这这这这种种种种改改改改变变变变的的的的特特特特殊殊殊殊性性性性称称称称为为为为限限限限制制制制性性性性核核核核酸酸酸酸内内内内切切切切酶酶酶酶的的的的星活性星活性星活性星活性。3.1.83.1.8星

12、星活性（星星活性（staractivitystaractivity）第20页/共88页星星活性产生的原因如下：星星活性产生的原因如下：星星活性产生的原因如下：星星活性产生的原因如下：反应体系中甘油的浓度过高反应体系中甘油的浓度过高反应体系中甘油的浓度过高反应体系中甘油的浓度过高 酶用量过大酶用量过大酶用量过大酶用量过大 低离子强度低离子强度低离子强度低离子强度 高高高高pHpH 含有机溶剂含有机溶剂含有机溶剂含有机溶剂 非非非非MgMg2+2+的二价离子的存在的二价离子的存在的二价离子的存在的二价离子的存在。第21页/共88页 在特异位点上切割在特异位点上切割在特异位点上切割在特异位点上切割D

13、NADNADNADNA，产生特异的限制性酶片段，产生特异的限制性酶片段，产生特异的限制性酶片段，产生特异的限制性酶片段 建立建立建立建立DNADNADNADNA分子的限制酶图谱分子的限制酶图谱分子的限制酶图谱分子的限制酶图谱 构建基因文库构建基因文库构建基因文库构建基因文库 用限制酶切出的相同粘性末端，以便重组用限制酶切出的相同粘性末端，以便重组用限制酶切出的相同粘性末端，以便重组用限制酶切出的相同粘性末端，以便重组 改建质粒改建质粒改建质粒改建质粒3.1.93.1.9限制性核酸内切酶的主要用途限制性核酸内切酶的主要用途限制性核酸内切酶的主要用途限制性核酸内切酶的主要用途第22页/共88页 每

14、次操作时应使用新的吸头去取酶，加入酶的体积应不超过总体积的每次操作时应使用新的吸头去取酶，加入酶的体积应不超过总体积的每次操作时应使用新的吸头去取酶，加入酶的体积应不超过总体积的每次操作时应使用新的吸头去取酶，加入酶的体积应不超过总体积的10%10%10%10%整个操作应在整个操作应在整个操作应在整个操作应在0000进行，最后加入酶进行，最后加入酶进行，最后加入酶进行，最后加入酶 切割大量切割大量切割大量切割大量DNADNADNADNA时，延长反应时间，减少酶的用量时，延长反应时间，减少酶的用量时，延长反应时间，减少酶的用量时，延长反应时间，减少酶的用量 应用通用缓冲液应用通用缓冲液应用通用缓

15、冲液应用通用缓冲液 限制性核酸内切酶操作的限制性核酸内切酶操作的限制性核酸内切酶操作的限制性核酸内切酶操作的注意事项注意事项注意事项注意事项第23页/共88页3.2DNA3.2DNA聚合酶聚合酶(DNA(DNApolymerase)polymerase)3.2.13.2.1大肠杆菌大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶（DNApolymeraseDNApolymerase）3.2.1.1DNA3.2.1.1DNA聚合酶聚合酶的活性的活性5-3DNA5-3DNA聚合酶活性聚合酶活性5-35-3外切酶活性外切酶活性3-53-5外切酶活性外切酶活性第24页/共88页第25页/共88页3.2.1.2DNA3

16、.2.1.2DNA聚合酶聚合酶 的用途的用途切口平移法（切口平移法（nicktranslationnicktranslation）标记）标记DNADNA用于用于cDNAcDNA克隆中的第二链克隆中的第二链第26页/共88页第27页/共88页3.2.2 Klenow DNA 3.2.2 Klenow DNA 聚合酶聚合酶（11）KlenowKlenow酶的基本性质：酶的基本性质：大肠杆菌大肠杆菌DNADNADNADNA聚合酶聚合酶I I I I经枯草杆菌蛋白酶处理经枯草杆菌蛋白酶处理,获得获得N N N N端三分之二的大肽段端三分之二的大肽段,即即KlenowKlenowKlenowKlenow

17、酶。酶。53535353的的DNADNADNADNA聚合酶活性和聚合酶活性和35353535的核酸外切酶活的核酸外切酶活性性第28页/共88页（22）KlenowKlenow酶的基本用途：酶的基本用途：补平由核酸内切酶产生的补平由核酸内切酶产生的33 粘性凹出末端粘性凹出末端抹平抹平DNADNA的的33 粘性凸出末端粘性凸出末端DNADNA片段的同位素末端标记片段的同位素末端标记cDNAcDNA第二链的合成第二链的合成双脱氧末端终止法测定双脱氧末端终止法测定DNADNA序列序列第29页/共88页第30页/共88页第31页/共88页3.2.3T43.2.3T4噬菌体噬菌体 DNADNA聚合酶（聚

18、合酶（T4T4phageDNApolymerasephageDNApolymerase）源于源于T4T4噬菌体感染的噬菌体感染的分子量分子量114,000114,000，单一多肽具有，单一多肽具有1515个半胱氨酸残基个半胱氨酸残基(活性必需活性必需)有有3535的核酸外切酶活性和的核酸外切酶活性和5353的的DNADNA聚合酶活性聚合酶活性最适最适pHpH：889(Tris9(Tris或或Glycinebuffer)Glycinebuffer)第32页/共88页第33页/共88页第34页/共88页3.2.4T73.2.4T7噬菌体噬菌体 DNADNA聚合酶（聚合酶（T7T7phageDNAp

19、olymerasephageDNApolymerase）源于源于T7T7噬菌体感染的噬菌体感染的 为两种紧密结合的蛋白质复合体为两种紧密结合的蛋白质复合体是所有是所有DNADNA聚合酶中持续合成能力最强的一个聚合酶中持续合成能力最强的一个活性功能与活性功能与T4T4噬菌体噬菌体DNADNA聚合酶和聚合酶和KlenowDNAKlenowDNA聚合酶类似聚合酶类似第35页/共88页3.2.53.2.5耐热耐热DNADNA聚合酶聚合酶主要用于主要用于PCRPCR反应反应3.2.73.2.7末端转移酶（末端转移酶（terminaltransferaseterminaltransferase）来源于小牛

20、胸腺，催化来源于小牛胸腺，催化dNTPdNTP加于加于DNADNA分子的分子的33羟基端羟基端 第36页/共88页3.2.63.2.6反转录酶反转录酶(Reversetranscriptase)(Reversetranscriptase)具有具有具有5 5 5 5 5 5333333 的的的DNADNADNADNADNADNA聚合酶活性，聚合酶活性，聚合酶活性，3 3 3 3 3 3 555555 和和和5 5 5 5 5 5 333333 的的的RNARNARNARNARNARNA外切核酸酶活性外切核酸酶活性外切核酸酶活性第37页/共88页双向外切双向外切DNA-RNADNA-RNA杂合链中

21、的杂合链中的RNARNA链链第38页/共88页DNA聚合酶的特征第39页/共88页原核生物甲基化酶是作为限制与修饰系统中的一员，用于保护宿主原核生物甲基化酶是作为限制与修饰系统中的一员，用于保护宿主DNADNA不被相应不被相应的限制酶所切割。的限制酶所切割。常可使细菌常可使细菌DNADNA分子中的胞嘧啶和腺嘌呤发生甲基化，形成分子中的胞嘧啶和腺嘌呤发生甲基化，形成5-5-甲基胞嘧啶和甲基胞嘧啶和6-6-甲基腺嘌呤甲基腺嘌呤3.33.3甲基化酶（甲基化酶（MethylaseMethylase）第40页/共88页1.1.IIII型甲基化酶型甲基化酶它与相应的限制酶的识别顺序相同，其它与相应的限制酶

22、的识别顺序相同，其甲基化位点与限制酶作用位点可同可不同。甲基化位点与限制酶作用位点可同可不同。M.EcoRIM.EcoRIGAGAmmATTCCATTCCEcoEcoRIRIGAATTCGAATTC M.HpaIM.HpaI C CmmCGGCGGHpaHpaI ICCGGCCGG3.3.13.3.1甲基化酶的种类甲基化酶的种类甲基化酶的种类甲基化酶的种类第41页/共88页2.2.DamDam甲基化酶和甲基化酶和DcmDcm甲基化酶甲基化酶这类甲基化酶与限制酶无关，不构成相应的限制修饰系统这类甲基化酶与限制酶无关，不构成相应的限制修饰系统damdamGGmmATCATC，dcmdcmCCmmC

23、A/TGGCA/TGG3.3.哺乳动物和植物的甲基化酶哺乳动物和植物的甲基化酶哺乳动物哺乳动物m5CGm5CG、植物、植物m5CGm5CG和和m5CNGm5CNG 其甲基化反应与其甲基化反应与DNADNA复制、基因转录等过程有关复制、基因转录等过程有关第42页/共88页3.3.23.3.2甲基化对限制酶切的影响甲基化对限制酶切的影响1.1.修饰酶切位点修饰酶切位点2.2.产生新的酶切位点产生新的酶切位点3.3.对基因组作图的影响对基因组作图的影响第43页/共88页3.3.33.3.3甲基化酶活性对限制酶活性的影响甲基化酶活性对限制酶活性的影响1.dcm1.dcm和和damdam甲基化酶对限制酶

24、的影响甲基化酶对限制酶的影响1 1）抑制某些限制酶的活性，不管两种限制酶的识）抑制某些限制酶的活性，不管两种限制酶的识别顺序是完全重叠还是边界重叠别顺序是完全重叠还是边界重叠如：完全重叠如：完全重叠BclBclIdam(Idam(GATCGATC)；ScrScrFIFIdcm(dcm(CCA/TGGCCA/TGG)边界重叠边界重叠ClaClaI-damI-dam；SauSau96I-dcm96I-dcm22）不能抑制某些限制酶活性，不管两者的识别顺序）不能抑制某些限制酶活性，不管两者的识别顺序为何种重叠为何种重叠如：如：dam-dam-BamBamHIHI，SauSau3AI3AI，BglBg

25、lIIII，PvuPvuI I；dcm-dcm-BstBstNINI第44页/共88页对甲基化敏感的限制性内切酶对甲基化敏感的限制性内切酶限制酶限制酶 识别序列识别序列*甲基化酶甲基化酶AvaAvaAvaAva GG(A/T)GG(A/T)GG(A/T)GG(A/T)CCCCCCCC(A/T)GG(A/T)GG(A/T)GG(A/T)GG dcmdcmdcmdcmBclBclBclBcl T T T TGATCGATCGATCGATCA A A A dam dam dam dam ClaClaClaCla G G G GATCATCATCATCGATGATGATGAT dam dam dam

26、dam EcoEcoEcoEcoR R R R CC(A/T)GGCC(A/T)GGCC(A/T)GGCC(A/T)GG dcmdcmdcmdcmHphHphHphHph GGTGGTGGTGGTGAGAGAGATCTCTCTC dam dam dam damMboMboMboMbo GATCGATCGATCGATC dam dam dam damNruNruNruNru GAGAGAGATCTCTCTCGCGAGCGAGCGAGCGA dam dam dam damSauSauSauSau96 96 96 96 GGNGGNGGNGGNCCCCCCCC(A/T)GG(A/T)GG(A/T)G

27、G(A/T)GG dcmdcmdcmdcmSauSauSauSauF F F F CC(A/T)GGCC(A/T)GGCC(A/T)GGCC(A/T)GG dcmdcmdcmdcmStuStuStuStu AGGAGGAGGAGGCCTCCTCCTCCTGGGGGGGG dcmdcmdcmdcmTagTagTagTag GATCGATCGATCGATCGA damGA damGA damGA damXbaXbaXbaXba TCTATCTATCTATCTAGAGAGAGATCTCTCTC dam dam dam dam *下横线字母表示限制酶识别序列下横线字母表示限制酶识别序列,绿色字母表示绿

28、色字母表示damdamdamdam甲基甲基化酶识别序列化酶识别序列,红色字母表示红色字母表示dcmdcmdcmdcm甲基化酶识别序列甲基化酶识别序列第45页/共88页2.2.IIII型甲基化酶对限制酶活性的影响型甲基化酶对限制酶活性的影响）抑制同种限制酶的活性抑制同种限制酶的活性 GGATGGATmmCCCCBamBamHIHI(G(G GATCC)GATCC)GAGAmmATTCATTCEcoEcoRIRI(G(G AATTC)AATTC)）抑制不同种限制酶的活性抑制不同种限制酶的活性a.a.顺序完全重叠顺序完全重叠如：如：M.ClaIM.ClaI（AATCGTCGmmAAT T）-TaqT

29、aqI I（TCGTCGmmAA）b.b.顺序边界重叠顺序边界重叠 如：如：M.BamHIM.BamHI（GGATGGATmmCCCC）-MepMepI I（mmCCGGCCGG）抑制不同种限制酶的部分活性抑制不同种限制酶的部分活性MMTaqITaqI（TCGTCGmmAA）-HinHindIIdII（GTPyPuACGTPyPuAC）：）：GTCAACGTCAAC，GTTAACGTTAAC，GGTCGTCGmmAACC，GTTGACGTTGAC第46页/共88页3.3.43.3.4甲基化酶的用途甲基化酶的用途.改变某些限制酶识别顺序的特异性，以便重组体的形成改变某些限制酶识别顺序的特异性，以

30、便重组体的形成.在建立基因文库时，可先使在建立基因文库时，可先使DNADNA分子部分甲基化，然后再用限制酶切分子部分甲基化，然后再用限制酶切第47页/共88页3.43.4依赖于依赖于 DNADNA的的 RNARNA聚合酶聚合酶（DNADNAdependentRNApolymerasedependentRNApolymerase）(1)(1)活性活性无需引物，但需识别特异性位点无需引物，但需识别特异性位点(2)(2)用途用途体外合成体外合成RNARNA分子分子用于表达外源基因用于表达外源基因第48页/共88页3.53.5连接酶连接酶（LigaseLigase）3.5.13.5.1T4DNAT4D

31、NA连接酶（连接酶（T4DNAligaseT4DNAligase）特点：特点：T4DNAT4DNA连接酶的分子量为连接酶的分子量为68kDa68kDa，催化，催化形成磷酸二酯键形成磷酸二酯键反应底物为反应底物为RNARNA（但效率低）或（但效率低）或DNADNA 连接反应需要供给能量连接反应需要供给能量 采用采用WeissWeiss单位来衡量单位来衡量T4DNAT4DNA连接酶的活性连接酶的活性 第49页/共88页（2 22 2）T4 DNAT4 DNAT4 DNAT4 DNA连接酶的作用机制连接酶的作用机制连接酶的作用机制连接酶的作用机制ATP+DNAligase(E)E-AMP+PPiAT

32、P+DNAligase(E)E-AMP+PPiE-AMPE-AMP上的上的AMPAMP转移到转移到DNADNA的的55磷酸根上，使其活化，释放出酶磷酸根上，使其活化，释放出酶活化的活化的55磷酸根与相邻的磷酸根与相邻的33羟基形成羟基形成33，55磷酸二酯键，并释放出磷酸二酯键，并释放出AMPAMP第50页/共88页第51页/共88页修复双链修复双链DNADNADNADNA缺口处的磷酸二酯键缺口处的磷酸二酯键第52页/共88页修复与修复与RNARNA结合的结合的DNADNA链上缺口处的磷酸二链上缺口处的磷酸二酯键酯键第53页/共88页连接多个平头双链连接多个平头双链DNADNA分子：分子：第5

33、4页/共88页（33）DNADNA连接酶的反应条件连接酶的反应条件Tris-HClTris-HClMgClMgCl2210mmol/L10mmol/LDTT5mmol/LDTT5mmol/LVolume10-20Volume10-20 LLTemperature4-15Temperature4-15Time4-16hTime4-16h第55页/共88页3.5.23.5.2DNADNA连接酶连接酶需需NAD+NAD+参与，且其平端连接效率低，常用于置换合成法合成参与，且其平端连接效率低，常用于置换合成法合成cDNAcDNA3.5.33.5.3TaqTaqDNADNA连接酶连接酶TaqTaqDNA

34、DNA连接酶可在两个寡核苷酸之间进行连接反应，连接酶可在两个寡核苷酸之间进行连接反应，45456565，需，需NAD+NAD+第56页/共88页3.5.4T4RNA3.5.4T4RNA连接酶连接酶催化单链催化单链DNADNA或或RNARNA的的5-5-磷酸与另一单链磷酸与另一单链DNADNA或或RNARNA的的33羟基之间羟基之间形成共价连接形成共价连接可用于标记可用于标记RNARNA的的33末端、单链末端、单链DNADNA或或RNARNA的连接、增强的连接、增强T4DNAT4DNA连接连接酶的连接活性以及合成寡核苷酸酶的连接活性以及合成寡核苷酸 第57页/共88页平头双链平头双链DNADNA

35、DNADNA片段的连接操作片段的连接操作提高平头末端连接效率的方法包括：提高平头末端连接效率的方法包括：增加增加连接酶用量连接酶用量 提高平头末端底物的提高平头末端底物的浓度浓度 加入加入10%10%10%10%PEG 8000PEG 8000PEG 8000PEG 8000 加入加入单价阳离子单价阳离子第58页/共88页3.6T43.6T4多核苷酸激酶多核苷酸激酶（T4T4polynucleotidekinasepolynucleotidekinase）将将ATPATP的的 -磷酸基转移至磷酸基转移至DNADNA或或RNARNA的的55末端末端主要用于对缺乏主要用于对缺乏5-5-磷酸的磷酸的

36、DNADNA或合成接头进行磷酸化，同时可对末端进行标或合成接头进行磷酸化，同时可对末端进行标记记在高浓度在高浓度ATPATP时发挥最佳活性时发挥最佳活性第59页/共88页第60页/共88页3.73.7碱性磷酸酶（碱性磷酸酶（alkalinephosphatasealkalinephosphatase）主要来源于牛小肠碱性磷酸酶（主要来源于牛小肠碱性磷酸酶（CalfintestinalalkalinephosphataseCalfintestinalalkalinephosphatase），简称），简称CIPCIP或或CIAPCIAP催化除去催化除去DNADNA或或RNA5RNA5磷酸的反应磷酸

37、的反应 第61页/共88页第62页/共88页第63页/共88页第64页/共88页ds-DNAds-DNA结构结构:切口切口,缺口缺口,断口断口缺口缺口(gap)(gap)切口切口(nick)(nick)断口断口(cut)(cut)33HOP5HOP533HOP5HOP53.83.8核酸酶核酸酶核酸酶核酸酶（nucleasenuclease）第65页/共88页3.8.13.8.1外切酶外切酶IIIIII（ExoIIIExoIII）来自于，分子量来自于，分子量28,000kD28,000kD1.1.催化反应类型催化反应类型1)1)外切酶活性：外切酶活性：3535，产生，产生5-5-单磷酸核苷酸和单

38、磷酸核苷酸和具各种结构的具各种结构的 ds-DNAds-DNA，2)2)核酸酶核酸酶HH活性：除去活性：除去DNA-RNADNA-RNA杂交分子中的杂交分子中的RNARNA分子，分子，3)3)内切酶活性：在无嘌呤或无嘧啶处将内切酶活性：在无嘌呤或无嘧啶处将DNADNA键切键切开，开，pH7.6-8.5pH7.6-8.5第66页/共88页 2.2.外切酶活性特点外切酶活性特点1)1)反应底物：互补反应底物：互补ds-DNAds-DNA2)2)碱基释放速度：碱基释放速度：C CA-TA-TGG3)3)反应产物：反应产物：5-5-单磷酸核苷和具缺口或单磷酸核苷和具缺口或5-5-端突起端突起的的ds-

39、DNAds-DNA 3.3.用途用途 1)1)核酸（核酸（DNADNA）标记）标记2)2)基因突变基因突变-缺失缺失3)3)DNADNA序列测定时作顺序缺失序列测定时作顺序缺失 第67页/共88页55PP55PP55PP55PP55PP33HOHO33HOHO33HOHO33HOHO33HOHO33HOHO33HOHO33HOHOOH3OH3OH3OH3OH3OH3OH3OH3P5P5P5P5P5P5P5P5P5P5P5P5P5P533HOHOP5P5OH3OH3P5P5RNaseHRNaseHExoIIIExoIII的外切酶和的外切酶和RNaseHRNaseH的作用的作用第68页/共88页3

40、.8.23.8.2外切酶外切酶（ExoExo）1.1.反应特点反应特点1)1)作用底物作用底物:要求要求5-PO5-PO44基基;不作用含切口的不作用含切口的DNADNA分子分子2)2)作用方向与产物：作用方向与产物：53;53;产生产生5-P5-P核苷和核苷和3-3-突起的突起的ds-DNAds-DNA 2.2.用途：用途：DNADNA定序测定定序测定;除去除去5-5-端突起，产生端突起，产生3-3-端突端突起，便于加尾起，便于加尾3HO3HO 3HO3HO 3HO3HO OH3OH3 OH3OH3 OH3OH3 5P5P 5P5P 5P5P P5P5 P5P5 P5P5 AAAAAAAAA

41、AAAAAAAAAAAAAAATdT+dATPTdT+dATP第69页/共88页3.8.33.8.3核酸酶核酸酶Bal31Bal311.1.一般特点：一般特点：胞外酶；具胞外酶；具DNaseDNase和和 RNaseRNase活性；由活性；由“快快”和和“慢慢”两种成分构成两种成分构成2.2.催化反应特点催化反应特点1)1)底物：底物：ss-DNAss-DNA，ds-DNAds-DNA，RNA(RNA(外切与内切活性外切与内切活性)2)2)作用方向与产物：作用方向与产物：5353和和3535同时进行，但反同时进行，但反应速度不同；应速度不同；产生产生5-5-单磷酸核苷和缩短的单磷酸核苷和缩短的

42、ds-DNAds-DNA3.3.用途：用途：基因突变基因突变-缺失缺失;绘制限制酶谱绘制限制酶谱;DNA;DNA定序定序(与与ExoIIIExoIII相同相同)，其优点是，其优点是Bal31Bal31酶活依赖于酶活依赖于CaCa+和和MgMg+，CaCa+在反应完毕后可用在反应完毕后可用EGTAEGTA（乙二醇四乙酸）灭活而不（乙二醇四乙酸）灭活而不影响影响MgMg+浓度，后者是限制酶活性必需的浓度，后者是限制酶活性必需的 4.4.使用注意事项：使用注意事项：1)1)应作预备实验，因每批酶制品的应作预备实验，因每批酶制品的“快快”“”“慢慢”酶含量不酶含量不同同2)DNA2)DNA两条链碱基组

43、成不同，终止反应时存在单链突两条链碱基组成不同，终止反应时存在单链突起，需要补平起，需要补平第70页/共88页55PPP5P533HOHOOH3OH3核酸酶核酸酶Bal31Bal31的活性的活性第71页/共88页3.8.43.8.4核酸酶核酸酶S1S11.1.基本特征基本特征 来自米曲霉来自米曲霉(Aspergillus oryzaeAspergillus oryzae)，糖蛋白，糖蛋白(含糖量含糖量8%)8%)，对热稳定，抗变性剂，对热稳定，抗变性剂 降解单链降解单链DNADNA速度比降解双链速度比降解双链DNADNA快快7500075000倍，比倍，比降解单链降解单链RNARNA快快7 7

44、倍倍 必需必需Zn2+Zn2+，需要，需要NaCl10-300mmol/LNaCl10-300mmol/L 最适最适pHpH：2.2.催化反应类型催化反应类型:ss-DNA;ss-RNA;ss-DNA;ss-RNA;双螺旋变性区双螺旋变性区第72页/共88页第73页/共88页第74页/共88页ExoIIIExoIIIS1S1S1S1S1S1S1S1S1S1S1S1Poly(A)Poly(A)Poly(A)Poly(A)555555555555核酸酶核酸酶S1S1活性活性 第75页/共88页3.3.用途用途 1)1)基因突变基因突变-缺失，常与外切酶，如缺失，常与外切酶，如ExoIIIExoII

45、I、外切酶、外切酶、Bal31Bal31连用连用 2)DNA2)DNA定序分析定序分析 3)S13)S1作图法（图）作图法（图）4)4)基因结构分析基因结构分析 5)tRNA5)tRNA结构分析结构分析 4.4.使用注意事项使用注意事项 1)1)避免长时间反应，因最适酸性避免长时间反应，因最适酸性pHpH将导致将导致DNADNA断裂或降解断裂或降解 2)2)避免使用高浓度酶量，以免避免使用高浓度酶量，以免DNADNA被降解被降解(因产生切口因产生切口)第76页/共88页第77页/共88页 3.8.53.8.5绿豆核酸酶绿豆核酸酶1.1.与与S1S1酶相同点：酶相同点：作用于作用于ss-DNAs

46、s-DNA和和RNARNA，对，对5-5-端端的突起核苷酸作用速度为的突起核苷酸作用速度为GCATGCAT2.2.与与S1S1酶的不同点酶的不同点最适最适pHpH接近中性，不会产生切口接近中性，不会产生切口;不使具切不使具切口的口的ds-DNAds-DNA断裂断裂3.3.用途：用途：与与S1S1酶相同酶相同 3.8.63.8.6外切酶外切酶作用于作用于ss-DNAss-DNA的的3-3-与与5-5-端，产物为低聚核苷酸端，产物为低聚核苷酸除去单链除去单链DNADNA形成平整末端形成平整末端第78页/共88页3.8.73.8.7牛脾磷酸二酯酶牛脾磷酸二酯酶作用含作用含5-5-羟基端的羟基端的ss

47、-DNAss-DNA和和RNARNA，产生，产生3-3-单磷酸核苷单磷酸核苷用于短链用于短链RNARNA和和 DNADNA的定序分析的定序分析3.8.83.8.8蛇毒磷酸二酯酶蛇毒磷酸二酯酶作用作用3-3-羟基单、双链羟基单、双链DNADNA和和RNARNA，产生，产生5-5-单磷酸核苷单磷酸核苷用于用于RNARNA和和DNADNA的定序分析的定序分析第79页/共88页几种常用外切酶的特点几种常用外切酶的特点外切酶外切酶作用方向作用方向作用底物作用底物反应产物反应产物ExoIII35dsDNAExoIII35dsDNA单核苷酸单核苷酸 外切酶外切酶5 533ssss和和dsDNAdsDNA同上

48、同上Bal3135Bal3135和和5 533ssss和和dsDNA,RNAdsDNA,RNA同上同上S135S135和和5 533ssRNAssRNA和和ssDNAssDNA低、核苷酸低、核苷酸 绿豆核酸酶绿豆核酸酶 3535和和53ssRNA53ssRNA和和ssDNAssDNA同上同上ExoVII35ExoVII35和和53ssDNA53ssDNA低聚核苷酸低聚核苷酸 牛脾磷酸二酯酶牛脾磷酸二酯酶 53ssRNA53ssRNA，ssDNAssDNA同上同上 蛇毒磷酸二酯酶蛇毒磷酸二酯酶 35ss35ss，dsRNAdsRNA和和DNADNA同上同上第80页/共88页3.8.9.RNase

49、3.8.9.RNase大部分用于大部分用于RNARNA的核苷酸序列分析或除去的核苷酸序列分析或除去DNADNA样品或蛋白质合成系统中的样品或蛋白质合成系统中的RNARNA分子。分子。1.RNaseA1.RNaseA分离自牛胰脏，对热稳定，抗去污剂分离自牛胰脏，对热稳定，抗去污剂（100100加热加热15min15min仍具活性）仍具活性）,用于除去用于除去DNADNA样品中样品中的的RNARNA分子分子2.2.核酸酶核酸酶S7S7，亦称微球菌核酸酶，对亦称微球菌核酸酶，对RNARNA敏感，用敏感，用于除去蛋白质合成系统中的内源于除去蛋白质合成系统中的内源mRNAmRNA3.RNaseH3.RN

50、aseH作用于作用于DNA-RNADNA-RNA杂交分子中的杂交分子中的RNARNA链，用于链，用于cDNAcDNA文库建立时除去文库建立时除去RNARNA链以便第二条链链以便第二条链cDNAcDNA链的合成。链的合成。第81页/共88页3.8.10DNaseI3.8.10DNaseI1.1.特点：特点：具内切酶活性，作用于具内切酶活性，作用于ds-DNAds-DNA，但无核，但无核苷酸序列特异型，产生苷酸序列特异型，产生5-P5-P低聚核苷酸低聚核苷酸;Ca;Ca2+2+,Mg,Mg2+2+或或CaCa2+2+,Mn,Mn2+2+可使酶活达最大值可使酶活达最大值当酶浓度很低时，当酶浓度很低时