细胞工程单克隆抗体课件.ppt
《细胞工程单克隆抗体课件.ppt》由会员分享,可在线阅读,更多相关《细胞工程单克隆抗体课件.ppt(34页珍藏版)》请在淘文阁 - 分享文档赚钱的网站上搜索。
1、细胞工程单克隆抗体细胞工程单克隆抗体第1页,此课件共34页哦一、何谓单克隆抗体?一、何谓单克隆抗体?第2页,此课件共34页哦第3页,此课件共34页哦第4页,此课件共34页哦第5页,此课件共34页哦只针对某一抗原决定簇的抗体分子称为单克隆抗体只针对某一抗原决定簇的抗体分子称为单克隆抗体。第6页,此课件共34页哦 单克隆抗体技术的核心是用骨髓瘤细胞单克隆抗体技术的核心是用骨髓瘤细胞(myeloma cell)与经特与经特定抗源免疫刺激的定抗源免疫刺激的B淋巴细胞淋巴细胞(antigen stimulated B lymphoblast)融合得到杂交瘤细胞融合得到杂交瘤细胞(hybridoma ce
2、ll),杂交瘤细胞既能象骨髓瘤,杂交瘤细胞既能象骨髓瘤细胞那样在体外无限增殖,又具有细胞那样在体外无限增殖,又具有B淋巴细胞产生特异性抗体的能淋巴细胞产生特异性抗体的能力。因此,单克隆抗体技术又称为杂交瘤技术力。因此,单克隆抗体技术又称为杂交瘤技术(hybridoma technology)。)。第7页,此课件共34页哦Niels K.Jerne G.Kohler C.Milstein 第8页,此课件共34页哦 1975年,英国剑桥大学学者Kohler 和Milstein将小鼠骨髓瘤细胞与经绵羊红细胞免疫后的小鼠脾细胞进行融合,形成既能产生抗绵羊红细胞抗体、又能进行分裂繁殖的杂交瘤细胞,创立了
3、杂交瘤抗体技术,获1984年Nobel奖。1984年通过基因工程技术,初次建立了人-鼠杂交瘤。1987年单抗制剂开始用于临床试验。单抗技术,解决了抗体不纯的问题,标志着抗体制备从机体水平进入了细胞水平。由此而建立的单链抗体库技术和噬菌体抗体库技术等,则使抗体制备技术迈进分子水平。一、原理与概念一、原理与概念第9页,此课件共34页哦杂交瘤技术基本原理哺乳动物的免疫系统包括体液免疫和细胞免疫,参与这两种免疫反应的细胞有:B淋巴细胞和T淋巴细胞。B淋巴细胞,进一步发育成浆细胞,浆细胞能产生抗体,抗体参与体液免疫。T淋巴细胞,进一步发育成吞噬细胞,直接参与细胞免疫。T细胞不能产生抗体,但可以帮助B细胞
4、产生抗体。正常的B淋巴细胞不能在体外培养条件下长期生存,因而不能在体外持续产生抗体。而骨髓瘤细胞可以在体外快速生长,但不能分泌抗体。第10页,此课件共34页哦克隆选择学说作为抗体生成理论的克隆选择学说是杂交瘤技术产生的理论依据,细胞融合技术和杂交细胞的选择方法是杂交瘤技术产生的技术基础。克隆选择学说1957年Burnet提出的克隆选择学说认为:每一个B淋巴细胞有一个独特的受体(现在认为一个B淋巴细胞有结构相同的10万个受体),抗原进入机体后只刺激具有相应受体的B淋巴细胞,产生与受体特异性相同的抗体分子。一个淋巴细胞只产生一种抗体分子。因此,根据克隆选择学说,一个B淋巴细胞克隆只能产生一种抗体分
5、子。这就是生产单克隆抗体的理论依据。第11页,此课件共34页哦单克隆抗体与多克隆抗体单克隆抗体与多克隆抗体的本质区别单克隆抗体是源于一个B淋巴细胞的杂交瘤细胞系所分泌的针对抗原的同一表位的抗体;而多克隆抗体(简称多抗)是由免疫动物的无数不同的B淋巴细胞分泌的针对抗原不同表位的性质各异的混合抗体。单抗是同质的,多抗是异质的。第12页,此课件共34页哦二、杂交瘤技术的基本原理二、杂交瘤技术的基本原理第13页,此课件共34页哦三、杂交瘤细胞的制备三、杂交瘤细胞的制备(一)骨髓瘤细胞选择及选择性培养基(一)骨髓瘤细胞选择及选择性培养基骨髓瘤细胞本身不能分泌抗体骨髓瘤细胞本身不能分泌抗体选择次黄嘌呤鸟嘌
6、呤转磷酸核糖激酶缺陷型(选择次黄嘌呤鸟嘌呤转磷酸核糖激酶缺陷型(HGPRT-)胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型(胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型(TK-)第14页,此课件共34页哦HAT培养基培养基次黄嘌呤(hypoxanthine,H)氨基喋呤(aminopterin,A)胸腺嘧啶脱氧核苷(thymidine,T)次黄嘌呤鸟嘌呤转磷酸核糖激酶缺陷型(次黄嘌呤鸟嘌呤转磷酸核糖激酶缺陷型(HGPRT-)胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型(胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型(TK-)第15页,此课件共34页哦(二)免疫小鼠(二)免疫小鼠 免疫程序是:取68周龄BalbC雌鼠,基础免疫2周,静脉再加强免疫一次,35天后用于融合。免疫时是否采用
7、佐剂和事先处理抗原,要依抗原性的强弱而定。一般来讲可溶性抗原用完全佐剂效果较好。抗原量同样与抗原强弱有关,以IgG为例,第一次为l00g,第二次为50g,免疫途径第一次可经腹腔注射。对于细胞性抗原不用佐剂,每次腹腔注射1l06一1107。第16页,此课件共34页哦(三)脾细胞的制备(三)脾细胞的制备(1)引颈处死小鼠,用酒精消毒体表;引颈处死小鼠,用酒精消毒体表;(2)无菌条件下取出脾脏,剃除结缔组织和脂肪,用无菌条件下取出脾脏,剃除结缔组织和脂肪,用5mL无血清培养液无血清培养液 冲洗一次;冲洗一次;(3)把脾脏置于已消毒的把脾脏置于已消毒的90100目不锈钢网或尼龙纱网中;目不锈钢网或尼龙
8、纱网中;(4)在脾中部切开一小口,用注射器芯从一端轻轻压挤,再用无血清培养在脾中部切开一小口,用注射器芯从一端轻轻压挤,再用无血清培养 液冲洗,令细胞通过纱网,收集入平皿中,或用注射器向脾脏内注入液冲洗,令细胞通过纱网,收集入平皿中,或用注射器向脾脏内注入 3mL无血清培养液,反复抽吸数次获取细胞,再制成细胞悬液亦可;无血清培养液,反复抽吸数次获取细胞,再制成细胞悬液亦可;(5)把细胞悬液注入把细胞悬液注入50mL离心管中,加离心管中,加l020mL培养液:轻轻吹打数次,培养液:轻轻吹打数次,室温中置室温中置5分钟;分钟;(6)离心离心(8001000转分转分)计数、备用。计数、备用。第17页
9、,此课件共34页哦(四)细胞准备(四)细胞准备(1)收集骨髓瘤细胞,用无血清培养液洗)收集骨髓瘤细胞,用无血清培养液洗3次(次(37),),计数活力细胞(不少于计数活力细胞(不少于90););(2)收集小鼠脾细胞,用无血清培养液洗)收集小鼠脾细胞,用无血清培养液洗3次(次(37),),并计细胞数和测定活力细胞;并计细胞数和测定活力细胞;(3)按)按1:5或或1:10混合脾细胞和骨髓瘤细胞后,离心混合脾细胞和骨髓瘤细胞后,离心 弃去上清,并以消毒滤纸吸净多余上清。弃去上清,并以消毒滤纸吸净多余上清。第18页,此课件共34页哦(五)细胞融合(五)细胞融合(1)将1mL40的PEG液一滴滴加入列细胞
10、团中,在60秒内加完,同时并不断轻微 转动离心管或用手指轻弹离心管;(2)在不断转动离心管中加1mL无血清培养液,60秒钟内加完;(3)于5分钟内慢慢加完20mL无血清培养液;此时细胞对机械损伤非常敏感,(4)离心(800转分,8分钟),去上清,用完全培养液10mL悬浮,轻轻混匀;(5)取96孔板,每孔加50L;(6)取等体积细胞悬液,向另一96孔板中加50P1;(7)送入5CO2,温箱中37培养,24小时后更换成HAT选择性培养掖。第19页,此课件共34页哦(六)融合后细胞培养(六)融合后细胞培养1、融合后710天用HAT培养液半量换液(留一半旧的加一半 新的)后每隔23天半量换液一次;2、
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 细胞 工程 单克隆抗体 课件
限制150内