第九讲凝胶电泳技术课件.ppt

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1、第九讲凝胶电泳技术第1页，此课件共46页哦 凝胶电泳凝胶电泳(gel electrophoresis)技术技术第2页，此课件共46页哦 核酸分子杂交技术核酸分子杂交技术第3页，此课件共46页哦 蛋白分子杂交技术蛋白分子杂交技术第4页，此课件共46页哦 细胞转化（原核）细胞转化（原核）/转染（真核）转染（真核）第5页，此课件共46页哦 PCR PCR扩增扩增第6页，此课件共46页哦 DNA DNA测序测序DNA测序仪第7页，此课件共46页哦 蛋白测序蛋白测序第8页，此课件共46页哦 文库构建文库构建第9页，此课件共46页哦 酵母双杂交酵母双杂交第10页，此课件共46页哦RNARNA干扰干扰(RN

2、Ai):):转录后基因沉默技术转录后基因沉默技术第11页，此课件共46页哦 第一节第一节 凝胶电泳技术凝胶电泳技术凝胶电泳（凝胶电泳（Gelelectrophoresis）是以凝胶为载体，以电流为驱动，用于分离不同大小、形状、等电是以凝胶为载体，以电流为驱动，用于分离不同大小、形状、等电点等分子的技术。凝胶电泳通常用于分析用途。但也可以作为制备技术，点等分子的技术。凝胶电泳通常用于分析用途。但也可以作为制备技术，如在使用质谱如在使用质谱(MS)、PCR、克隆、克隆、DNA测序、免疫印迹等检测之前用测序、免疫印迹等检测之前用于提纯分子。于提纯分子。第12页，此课件共46页哦一、核酸的凝胶电泳一、

3、核酸的凝胶电泳 基本原理基本原理 在在buffer为为PH8.0时，带有时，带有负电荷的负电荷的DNA或或RNA核苷酸链，核苷酸链，依靠无反应活性的稳定介质（依靠无反应活性的稳定介质（琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶或或聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺凝胶凝胶）和缓冲液，和缓冲液，在电场中以一定的迁移率在电场中以一定的迁移率从负极移向正极从负极移向正极。根据核酸。根据核酸分子大小不同、构型或形状的差异，以及所带电荷的不同，分子大小不同、构型或形状的差异，以及所带电荷的不同，可以通过电泳将其混合物中的不同成分彼此分开。可以通过电泳将其混合物中的不同成分彼此分开。第13页，此课件共46页哦电泳槽电泳槽电泳仪电泳仪梳子梳子

4、电泳槽电泳槽制胶板制胶板正极电源正极电源插孔插孔负极电负极电源插孔源插孔电源线电源线电泳槽电泳槽第14页，此课件共46页哦第15页，此课件共46页哦第16页，此课件共46页哦电泳的迁移率取决于核酸分子本身的电泳的迁移率取决于核酸分子本身的大小大小和和构型构型分子量较小的分子量较小的DNA分子比分子量较大的分子比分子量较大的DNA分子迁移率分子迁移率要快要快；同等分子量的不同构型的核酸分子，同等分子量的不同构型的核酸分子，构型紧密的比线构型紧密的比线性性DNA分子要快分子要快，线性线性DNA分子比开环分子比开环DNA分子要快。分子要快。第17页，此课件共46页哦图2 线性DNA电泳图第18页，此

5、课件共46页哦 凝胶电泳的分辨力：凝胶电泳的分辨力：与凝胶的类型类型和密度密度相关 琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶的分辨力在0.250Kb之间;聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺的分辨力在11000bp之间第19页，此课件共46页哦聚丙烯酰胺凝胶电泳图（高聚丙烯酰胺凝胶电泳图（高分辨率，分辨率，1bp1bp差异可区分）差异可区分）琼脂糖凝胶电泳图琼脂糖凝胶电泳图第20页，此课件共46页哦（一）琼脂糖凝胶电泳（一）琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖是一种从红色海藻中提取出的线性多糖聚合物。分为常熔点的琼脂糖常熔点的琼脂糖和低熔点（低熔点（LMP）琼脂糖琼脂糖。第21页，此课件共46页哦LMP琼脂糖琼脂糖 熔点：熔点：6265 熔解

6、后，在熔解后，在37 可保持液态数小时；可保持液态数小时；在在25 可保持液态约可保持液态约10min 应用：应用：直接酶切，回收直接酶切，回收DNA分子；分子；在在65 下将下将LMP琼脂糖凝胶熔化；琼脂糖凝胶熔化；加入过量的酚抽提加入过量的酚抽提DNA；离心获得含离心获得含DNA分子的上清液。分子的上清液。第22页，此课件共46页哦琼脂糖凝胶电泳图琼脂糖凝胶电泳图第23页，此课件共46页哦琼脂糖凝胶电泳的参数：琼脂糖凝胶电泳的参数：缓冲液：缓冲液：1 TAE或或TBE 凝胶的含量：根据检测的凝胶的含量：根据检测的DNA大小大小 加加DNA样品：样品：1g，指示剂，指示剂 电泳条件：大片断低

7、电压长时间，小片段高电压短时间电泳条件：大片断低电压长时间，小片段高电压短时间 染色和观察：染色和观察：溴化乙锭（溴化乙锭（ethidium bromide，EB）染色）染色，在在300nm波长的紫外下观察（波长的紫外下观察（凝胶成像仪凝胶成像仪）。能看到）。能看到0.05 g的微量的微量DNA DNA的片断大小与荧光强度成正比的片断大小与荧光强度成正比 第24页，此课件共46页哦TAE:电泳大于电泳大于13kb的片段时用的片段时用TAE缓冲液将取得更好的分离效果。缓冲液将取得更好的分离效果。TAE的缺点是缓冲容量小，长时间电泳（如过夜）不可选用，除非有的缺点是缓冲容量小，长时间电泳（如过夜）

8、不可选用，除非有循环装置使两极的缓冲液得到交换。循环装置使两极的缓冲液得到交换。TBE:缓冲能力强，长时间电泳时可选用缓冲能力强，长时间电泳时可选用TBE，并且当用于电泳，并且当用于电泳小于小于1kb的片段时分离效果更好的片段时分离效果更好（常用）（常用）。TPE的缓冲能力也较强，但由于磷酸盐易在乙醇沉淀过程中析出，所以的缓冲能力也较强，但由于磷酸盐易在乙醇沉淀过程中析出，所以也不宜在回收也不宜在回收DNA片段的电泳中使用。片段的电泳中使用。电泳反冲液电泳反冲液第25页，此课件共46页哦Separation Range Vs.%AgaroseLowGelingAgarose4-60.02-0.

9、4第26页，此课件共46页哦注意：注意：EB（Ethidiumbromide，溴化乙锭）为强致癌物！，溴化乙锭）为强致癌物！第27页，此课件共46页哦Agarose gel electrophoresis第28页，此课件共46页哦第29页，此课件共46页哦第30页，此课件共46页哦第31页，此课件共46页哦凝胶成像仪凝胶成像仪第32页，此课件共46页哦 用已知分子量的标准用已知分子量的标准DNA对对DNA片断大小的估算片断大小的估算 第33页，此课件共46页哦二、琼脂糖凝胶电泳的的影响因素二、琼脂糖凝胶电泳的的影响因素琼脂糖主要在琼脂糖主要在DNA制备电泳中作为一种固体支持基质制备电泳中作为一

10、种固体支持基质,其其密度取决于琼脂糖的浓度。在电场中密度取决于琼脂糖的浓度。在电场中,在中性在中性pH值下带负电值下带负电荷的荷的DNA向阳极迁移向阳极迁移,其迁移速率由下列多种因素决定其迁移速率由下列多种因素决定:1、DNA的分子大小的分子大小:线状双链线状双链DNA分子在一定浓度琼脂糖凝胶中的迁移速率与分子在一定浓度琼脂糖凝胶中的迁移速率与DNA分子量对数成反比，分子越大则所受阻力越大，也分子量对数成反比，分子越大则所受阻力越大，也越难于在凝胶孔隙中蠕行，因而迁移得越慢。越难于在凝胶孔隙中蠕行，因而迁移得越慢。第34页，此课件共46页哦2、琼脂糖浓度琼脂糖浓度一个给定大小的线状一个给定大小

11、的线状DNA分子分子,其迁移速度在不同浓度的琼其迁移速度在不同浓度的琼脂糖凝胶中各不相同。脂糖凝胶中各不相同。DNA电泳迁移率的对数与凝胶浓度成线性电泳迁移率的对数与凝胶浓度成线性关系。凝胶浓度的选择取决于关系。凝胶浓度的选择取决于DNA分子的大小。分离小于分子的大小。分离小于0.5kb的的DNA片段所需胶浓度是片段所需胶浓度是1.2-1.5%,分离大于分离大于10kb的的DNA分子分子所需胶浓度为所需胶浓度为0.3-0.7%,DNA片段大小间于两者之间则所需胶浓片段大小间于两者之间则所需胶浓度为度为0.8-1.0%。第35页，此课件共46页哦3、DNA分子的构象分子的构象当当DNA分子处于不

12、同构象时分子处于不同构象时,它在电场中移动距离不仅和分它在电场中移动距离不仅和分子量有关子量有关,还和它本身构象有关。相同分子量的线状、开环和超还和它本身构象有关。相同分子量的线状、开环和超螺旋螺旋DNA在琼脂糖凝胶中移动速度是不一样的在琼脂糖凝胶中移动速度是不一样的,超螺旋超螺旋DNA移移动快动快,而线状双链而线状双链DNA移动要慢。如在电泳鉴定质粒纯度时移动要慢。如在电泳鉴定质粒纯度时发现凝胶上有数条发现凝胶上有数条DNA带难以确定是质粒带难以确定是质粒DNA不同构象引起不同构象引起还是因为含有其他还是因为含有其他DNA引起时引起时,可从琼脂糖凝胶上将可从琼脂糖凝胶上将DNA带逐带逐个回收

13、个回收,用同一种限制性内切酶分别水解用同一种限制性内切酶分别水解,然后电泳然后电泳,如在凝胶上如在凝胶上出现相同的出现相同的DNA图谱图谱,则为同一种则为同一种DNA。第36页，此课件共46页哦4、电源电压电源电压在低电压时在低电压时,线状线状DNA片段的迁移速率与所加电压成正片段的迁移速率与所加电压成正比。比。但是随着电场强度的增加，不同分子量的但是随着电场强度的增加，不同分子量的DNA片段的片段的迁移率将以不同的幅度增长迁移率将以不同的幅度增长,片段越大片段越大,因场强升高引起的因场强升高引起的迁移率升高幅度也越大迁移率升高幅度也越大,因此电压增加，琼脂糖凝胶的有因此电压增加，琼脂糖凝胶的

14、有效分离范围将缩小。要使大于效分离范围将缩小。要使大于2kb的的DNA片段的分辨率达片段的分辨率达到最大到最大,所加电压不得超过所加电压不得超过5v/cm。第37页，此课件共46页哦5、嵌入染料的存在、嵌入染料的存在荧光染料荧光染料溴化乙啶溴化乙啶用于检测琼脂糖凝胶中的用于检测琼脂糖凝胶中的DNA,染料会嵌染料会嵌入到堆积的碱基对之间并拉长线状和带缺口的环状入到堆积的碱基对之间并拉长线状和带缺口的环状DNA，使，使其刚性更强其刚性更强,还会还会使线状使线状DNA迁移率降低迁移率降低15。第38页，此课件共46页哦6、离子强度影响离子强度影响电泳缓冲液的组成及其离子强度影响电泳缓冲液的组成及其离

15、子强度影响DNA的电泳迁移率。的电泳迁移率。在在没有离子存在时没有离子存在时(如误用蒸馏水配制凝胶如误用蒸馏水配制凝胶),电导率最小，电导率最小，DNA几乎不移动几乎不移动，在，在高离子强度的缓冲液中高离子强度的缓冲液中(如误加如误加10电电泳缓冲液泳缓冲液),则则电导很高并明显产热电导很高并明显产热,严重时会引起凝胶熔化或严重时会引起凝胶熔化或DNA变性变性。第39页，此课件共46页哦第二节第二节 分子杂交分子杂交 一一Southern杂交杂交二二Northern杂交杂交三三菌落原位杂交菌落原位杂交四四Western杂交杂交第40页，此课件共46页哦分子杂交分子杂交(moleculehybr

16、idization)【分子杂交分子杂交】是指在分子克隆中的一类核酸和蛋白质分析方法，是指在分子克隆中的一类核酸和蛋白质分析方法，用用已知标记的已知标记的核酸分子核酸分子或或蛋白质分子蛋白质分子检测混合样品中未知核酸分子或检测混合样品中未知核酸分子或蛋白质分子，以及其相对分子量大小蛋白质分子，以及其相对分子量大小。根据其检测对象的不同可分为根据其检测对象的不同可分为Southern杂交、杂交、Northern杂交和杂交和Western杂交杂交，及由此演化的及由此演化的斑点杂交和菌落杂交等。斑点杂交和菌落杂交等。第41页，此课件共46页哦分子杂交可在分子杂交可在DNA与与DNA、RNA与与RNA或

17、或RNA与与DNA的二条单的二条单链之间进行，也可能在蛋白质与蛋白质之间进行。链之间进行，也可能在蛋白质与蛋白质之间进行。【核酸分子杂交核酸分子杂交】是指核酸分子是指核酸分子(DNA或或RNA)在变性以后，在复在变性以后，在复性的过程中两个不同来源的且同源的核酸分子形成杂合双链的过程。性的过程中两个不同来源的且同源的核酸分子形成杂合双链的过程。通过各种方法将核酸分子固定在固相支持物上，然后用放射性标通过各种方法将核酸分子固定在固相支持物上，然后用放射性标记的探针与被固定的分子杂交，经显影后显示出目的记的探针与被固定的分子杂交，经显影后显示出目的DNA或或RNA分子所处的位置。分子所处的位置。第

18、42页，此课件共46页哦第43页，此课件共46页哦探针标记方法探针标记方法体内体内(invivo)标记标记是将放射性标记的化合物作为代谢底物加到活细胞培是将放射性标记的化合物作为代谢底物加到活细胞培养体系中去，经细胞的合成代谢而使核素掺入到新合成的核酸分子中去。养体系中去，经细胞的合成代谢而使核素掺入到新合成的核酸分子中去。体外标记法体外标记法分为化学法和酶法：分为化学法和酶法：化学法化学法。最常用的是。最常用的是125I标记和光敏生物素标记和光敏生物素(photobiotin)标记。标记。酶法酶法也叫酶促标记法，将标记物预先标记到核苷酸也叫酶促标记法，将标记物预先标记到核苷酸(NTP或或dN

19、TP)分分子上，然后利用酶促反应将标记的核苷酸分子掺人到探针分子中去，或子上，然后利用酶促反应将标记的核苷酸分子掺人到探针分子中去，或将核苷酸分子上的标记基因交换到探针分子上。将核苷酸分子上的标记基因交换到探针分子上。第44页，此课件共46页哦(1)缺口平移法：缺口平移法：DNaseI是在两条链的不同部位随机打开缺口，从而使两条链都被核素均匀地标记，是在两条链的不同部位随机打开缺口，从而使两条链都被核素均匀地标记，使得标记的使得标记的DNA具有较高的放射比活性。具有较高的放射比活性。3种三磷酸脱氧核糖核苷酸如种三磷酸脱氧核糖核苷酸如dATP、dTTP、dGTP，一种核素标记的核苷酸一种核素标记

20、的核苷酸32PdCTP，待标记，待标记DNA片段。片段。在极微量在极微量DNA聚合酶的作用下，在双链聚合酶的作用下，在双链DNA分子的一条链上随机切开若干个缺口分子的一条链上随机切开若干个缺口而不是切断而不是切断DNA或将其降解，然后，大肠杆菌或将其降解，然后，大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶I在切口的在切口的3OH端逐个端逐个加入新的核苷酸，同时由于该酶具有加入新的核苷酸，同时由于该酶具有5，3外切酶的活性，它同时切除外切酶的活性，它同时切除5，端游离的，端游离的核苷酸，核苷酸，3端核苷酸的加入和端核苷酸的加入和5，端核苷酸的切除同时进行导致切口沿着，端核苷酸的切除同时进行导致切口沿着DNA链移动。链移动。第45页，此课件共46页哦第46页，此课件共46页哦