乙型肝炎的病原学诊断bctd.pptx

《乙型肝炎的病原学诊断bctd.pptx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《乙型肝炎的病原学诊断bctd.pptx（49页珍藏版）》请在淘文阁 - 分享文档赚钱的网站上搜索。

1、分子生物学实验HBV-DNA检测检测1一、实验目的z1 1、熟悉乙肝病毒、熟悉乙肝病毒DNADNA提取方法提取方法z2 2、掌握乙肝病毒、掌握乙肝病毒DNAPCRDNAPCR检测方法检测方法2二、实验原理z聚聚合合酶酶链链反反应应（PCRPCR）技技术术是是在在体体外外模模拟拟体体内内DNADNA复复制制，利利用用两两段段特特异异的的寡寡核核酸酸引引物物，由由DNADNA聚合酶催化产生目的基因的扩增技术。聚合酶催化产生目的基因的扩增技术。3PCRPCR技术基本原理技术基本原理4目的基因扩增循环数.扩增子数 (靶序列拷贝数)122438416532664201,048,576301,073,74

2、1,824(10亿)1 循环=2 扩增子2 循环=4 扩增子3 循环=8 扩增子4 循环=16 扩增子5 循环=32 扩增子6 循环=64 扩增子7 循环=128 扩增子5三、实验准备z（一）试剂（一）试剂z1 1、DNADNA提取液提取液z2 2、PCRPCR反应液反应液z3 3、石蜡油、双蒸水、石蜡油、双蒸水z4 4、电泳缓冲液（、电泳缓冲液（TAETAE）z5 5、2 2琼酯糖琼酯糖z6 6、溴化乙锭（、溴化乙锭（EBEB）z7 7、TaqTaq聚合酶聚合酶10XPCR缓冲液dNTP引物6三、实验准备z（一）器材和仪器（一）器材和仪器z1 1、离心机、离心机z2 2、水浴锅、水浴锅z3

3、3、PCRPCR扩增仪扩增仪z4 4、电泳槽、电泳仪、电泳槽、电泳仪z5 5、紫外灯、紫外灯z6 6、移液器、移液器7移液器移液器加样枪头加样枪头8高速离心机高速离心机旋涡振荡器旋涡振荡器9PCR扩增仪扩增仪10荧光定量荧光定量PCRPCR扩增仪扩增仪11电泳仪电泳仪电泳槽电泳槽12暗室中紫外灯观察结果暗室中紫外灯观察结果13z（一）（一）乙肝病毒乙肝病毒DNADNA提取（热裂解法）提取（热裂解法）z1 1、分离血清、分离血清z2 2、50ul50ul血清加入血清加入50 ul50 ul裂解液混匀。裂解液混匀。z3 3、沸水浴煮、沸水浴煮1010分钟。分钟。z4 4、1500015000转离心

4、转离心1515分钟。分钟。z5 5、取上清到另一离心管中备用。、取上清到另一离心管中备用。三、实验步骤14分离血清15加入裂解液提取加入裂解液提取DNADNA16热 裂 解17高高 速速 离离 心心18三、实验步骤z（二）（二）HBVHBVDNADNA扩增扩增z1 1、配制反应液配制反应液（15ul10TAE15ul10TAE，1ulTaq1ulTaq酶，酶，13ul13ul双蒸水，双蒸水，1ul1ul模板）模板）,振荡混匀振荡混匀.z2 2、扩增仪中：、扩增仪中：94309430秒，秒，55305530秒，秒，72 172 1分钟，共分钟，共3030循环。循环。z3 3、72 72 延伸延伸

5、5 5分钟。分钟。19三、实验步骤z（三）扩增产物检测（三）扩增产物检测z1 1、配制配制2 2琼酯糖的凝胶琼酯糖的凝胶z2 2、取扩增产物取扩增产物10ul10ul加入凝胶小孔中加入凝胶小孔中z3 3、电泳电泳3030分钟分钟z4 4、紫外灯下观察结果紫外灯下观察结果。21扩增产物分析22z1 1分分区区操操作作：PCRPCR具具有有超超敏敏感感性性，因因此此在在检检测测过过程程中中应应分分区区操操作作，即即分分为为样样品品处处理理区，区，PCRPCR扩增区，产物分析区。扩增区，产物分析区。z2 2、试试验验前前实实验验室室应应使使用用紫紫外外消消毒毒至至少少3030分分钟，实验器械应用钟，

6、实验器械应用7070乙醇擦拭。乙醇擦拭。z3 3操操作作时时戴戴一一次次性性手手套套，加加样样头头要要求求及及时时更换，吸液时避免飞溅。更换，吸液时避免飞溅。四、注意事项23z4 4每每天天实实验验前前，在在废废物物缸缸内内套套上上塑塑料料袋袋，加加入入半半缸缸含含有有效效氯氯1%1%次次氯氯酸酸钠钠液液，实实验验时时将吸头、离心管丢入废液缸中浸泡。将吸头、离心管丢入废液缸中浸泡。z5 5、EPEP管在开盖前应离心片刻。管在开盖前应离心片刻。z6 6、所所有有试试剂剂试试验验前前充充分分融融化化，避避免免反反复复冻冻融。融。z7 7、每次、每次PCRPCR反应均应设立阴阳性对照。反应均应设立阴

7、阳性对照。四、注意事项24试验实设置与管理25PCRPCR室的管理与防污染室的管理与防污染zPCRPCR室建立严格规章制度室建立严格规章制度zPCRPCR室严格分区室严格分区zPCRPCR室各区器械专区使用室各区器械专区使用zPCRPCR室各区单向流动室各区单向流动zPCRPCR检测前后要用检测前后要用1 1次氯酸钠液或次氯酸钠液或7575乙醇擦拭乙醇擦拭zPCRPCR反应液中使用反应液中使用dUTPdUTP防污染防污染2627试剂准备室管理制度 1.实实验验室室人人员员进进入入该该室室须须穿穿专专用用白白色色工工作作服服，实实验验中中应应需需戴手套。戴手套。2.每天实验开始前，清洁台面并应打

8、开紫外灯消毒每天实验开始前，清洁台面并应打开紫外灯消毒30分钟。分钟。3.取取出出当当天天试试验验需需配配置置和和使使用用试试剂剂，其其余余试试剂剂要要立立即即收收好好，并放回冰箱内。并放回冰箱内。4.实实验验中中使使用用的的离离心心管管、吸吸头头等等应应经经过过灭灭活活无无菌菌处处理理（应应在消毒的有效期内）。在消毒的有效期内）。5.PCR其他室的用品不得带入本室。其他室的用品不得带入本室。6.每每次次实实验验记记录录，应应使使用用本本室室专专用用的的、带带有有本本室室标标志志的的记记录本、纸和笔。录本、纸和笔。7.实验开始后，当天不得再返回本室。实验开始后，当天不得再返回本室。2829样品

9、制备室管理制度1.实实验验人人员员进进入入该该室室须须穿穿专专用用兰兰色色工工作作服服，实实验验中中应应需需戴戴手套，手套须常更换。手套，手套须常更换。2.样品的接受、登记、保存和提取按试剂盒要求进行。样品的接受、登记、保存和提取按试剂盒要求进行。3.使用本室专用的经灭菌处理的加样器和带滤芯的吸头。使用本室专用的经灭菌处理的加样器和带滤芯的吸头。4.实验记录使用本室专用记录本和笔。实验记录使用本室专用记录本和笔。5.使使用用过过的的离离心心管管、吸吸头头须须置置于于1次次氯氯酸酸钠钠溶溶液液中中浸浸泡泡，消毒后方可丢弃。消毒后方可丢弃。6.患者样品按有生物传染危险品对待，应高压灭活后弃之。患者

10、样品按有生物传染危险品对待，应高压灭活后弃之。7.PCR扩增后区的物品不得带入本室。扩增后区的物品不得带入本室。8.实验完毕后要打开紫外灯消毒。实验完毕后要打开紫外灯消毒。30产物分析区管理制度 1.实实验验人人员员进进入入该该室室须须穿穿专专用用红红色色工工作作服服，实实验验中中应应需需戴戴手手套，手套须常更换。套，手套须常更换。2.使用本室专用的经灭菌处理的加样器和带滤芯的吸头。使用本室专用的经灭菌处理的加样器和带滤芯的吸头。3.实验记录使用本室专用记录本和笔。实验记录使用本室专用记录本和笔。4.使使用用过过的的离离心心管管、吸吸头头须须置置于于1次次氯氯酸酸钠钠溶溶液液中中浸浸泡泡，消毒

11、后方可丢弃。消毒后方可丢弃。5.PCR产产物物分分析析区区的的物物品品不不得得带带出出本本室室，严严防防污污染染携携带带至至前前区。区。6.实验完毕后要打开紫外灯消毒，最好通夜消毒。实验完毕后要打开紫外灯消毒，最好通夜消毒。31定量定量PCRPCR概念概念z以外参或内参为标准，通过对以外参或内参为标准，通过对PCRPCR终产物的分析或终产物的分析或PCRPCR过程的过程的监测，对监测，对PCRPCR起始模板量的定量起始模板量的定量32常规常规PCRPCR与定量与定量PCRPCR的比较的比较33实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR原理原理z指在指在PCR反应体系中加入荧光基团反应体系中加入荧光基

12、团,利用荧光信号利用荧光信号的积累实时监测的积累实时监测PCR进程，最后通过标准曲线对进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析未知模板进行定量分析。zCt（cycle threshold)值定义：每个反应管的荧值定义：每个反应管的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数。光信号到达设定的阈值时所经历的循环数。z荧光阈值（荧光阈值（threshold)的缺省设置是的缺省设置是3-15个循个循环的荧光信号的标准偏差的环的荧光信号的标准偏差的10倍，即：倍，即：threshold=10SD cycle0-1534CtCt值与起始模板的关系值与起始模板的关系z每个模板的每个模板的CtCt值与该模板的

13、起始拷贝数的值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始模板数越多，对数存在线性关系，起始模板数越多，CtCt值越小，利用已知起始拷贝数的标准品作值越小，利用已知起始拷贝数的标准品作出标准曲线，只要获得未知样品的出标准曲线，只要获得未知样品的CtCt值，值，及可从标准曲线上计算出该样品的起始拷及可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。贝数。35荧光定量的标准曲线荧光定量的标准曲线 标准曲线未知标本Crossing Point(Cycles)log(copy number)nlog(F2/F1)nlog(F2/F1)Target38 3836除常规的一对引物以外，除常规的一对引物以外，PCR反

14、应体系中另加有一个反应体系中另加有一个能与能与PCR产物杂交的荧光双产物杂交的荧光双标记探针。该探针的标记探针。该探针的5端标端标记一个荧光基团，记一个荧光基团，3标记另标记另一个荧光基团。此时一个荧光基团。此时5端荧端荧光基团吸收能量后将能量转光基团吸收能量后将能量转移给临近的移给临近的3端荧光淬灭基端荧光淬灭基团（发生团（发生FRET），因此正），因此正常情况下检测不到该探针常情况下检测不到该探针5端荧光基团发出的荧光信号。端荧光基团发出的荧光信号。Taqman探针原理37但但当当溶溶液液中中有有模模板板时时，模模板板变变性性后后低低温温退退火火时时，引引物物与与探探针针同同时时与与模模板

15、板结结合合。在在引引物物的的介介导导下下，沿沿模模板板向向前前延延伸伸至至探探针针结结合合处处，发生链的置换；发生链的置换；Taqman探针原理38Taqman探针原理Taq酶酶的的53外外切切酶酶活活性性将将探探针针5端端连连接接的的荧荧光光基基团团从从探探针针上上切切割割下下来来，游游离离于于反反应应体体系系中中，从从而而脱脱离离3端端荧荧光光淬淬灭灭基基团团的的屏屏蔽蔽，接接受受光光刺刺激激发发出出荧荧光光，切切割割的的荧荧光光基基团团数数与与PCR产产物物的的数数量量成成比比例例。因因此此根根据据PCR反反应应液液的的荧荧光光强强度度即即可可计算出初始模板的数量。计算出初始模板的数量。

16、39实时荧光定量PCR无需内标zCt值的重现性值的重现性:同一模板同一模板Ct值恒定值恒定.zCt值与起始模板的线性关系决定值与起始模板的线性关系决定.z内标对实时荧光定量内标对实时荧光定量PCR有影响有影响:加入内标后加入内标后PCR反应变成双重反应变成双重PCR,存在竞争。无法加入合适存在竞争。无法加入合适的起始拷贝的内标。的起始拷贝的内标。40定量PCR在临床诊断治疗上的意义z对致病微生物核酸含量进行定量检测对致病微生物核酸含量进行定量检测z弥补免疫检测的缺陷（如弥补免疫检测的缺陷（如HCVHCV）z缩短诊断的窗口期（如缩短诊断的窗口期（如HBV,HIVHBV,HIV）z对治疗过程进行药

17、物疗效监测指导用药对治疗过程进行药物疗效监测指导用药z加快疾病的诊断，病情判断预后加快疾病的诊断，病情判断预后z对染色体突变导致的遗传病进行检测对染色体突变导致的遗传病进行检测41定量定量PCR在乙肝检测中意义在乙肝检测中意义z1.1.判断疾病的严重程度和传染性判断疾病的严重程度和传染性z2.PCR2.PCR结果与血清免疫学结果的综合评价结果与血清免疫学结果的综合评价z3.3.观察抗病毒药物疗效，指导药物用量观察抗病毒药物疗效，指导药物用量z4.4.献血员窗口期病毒核酸的筛查及早期诊断献血员窗口期病毒核酸的筛查及早期诊断z5.5.预测病情、判断预后预测病情、判断预后z6.6.器官移植、母婴垂直传播器官移植、母婴垂直传播4243444546HBV DNA 定量检测能提前做出预后判断定量检测能提前做出预后判断目前指标：目前指标：z1.e1.e抗原阴转抗原阴转z2.2.HBV HBV 病病毒毒载载量量小小于于10104 4拷拷贝贝/ml/mlz3.ALT3.ALT正常正常z4.e4.e抗体由阴转阳抗体由阴转阳47LightCycler7 74849