第八章电泳分离技术.ppt

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1、第八章电泳分离技术现在学习的是第1页，共78页主主 要要 内内 容容第一节第一节 概述概述第二节第二节 聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳第三节第三节 SDS SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳第四节第四节 等电聚焦电泳等电聚焦电泳第五节第五节 双向凝胶电泳双向凝胶电泳第六节第六节 毛细管电泳毛细管电泳现在学习的是第2页，共78页1.1 1.1 电泳的基本概念电泳的基本概念 电泳：带电物质在电场中向相反电极移动电泳：带电物质在电场中向相反电极移动的现象的现象。电泳迁移率：在单位电位梯度的作用下，电泳迁移率：在单位电位梯度的作用下，单位时间内质点所移动的距离。单位时间内质点所移动的距离

2、。电泳分离技术：利用带电物质在电场中泳动电泳分离技术：利用带电物质在电场中泳动速度的差别而进行分离的方法。速度的差别而进行分离的方法。现在学习的是第3页，共78页1.2 1.2 电泳的理论基础电泳的理论基础现在学习的是第4页，共78页1.2.1 1.2.1 影响电泳速度的因素影响电泳速度的因素电场强度：电场强度：泳动速度与电场强度成正比；泳动速度与电场强度成正比；溶液的溶液的pHpH值：值：pH pH距待分离物质的距待分离物质的pIpI越远，泳动速越远，泳动速度越大；度越大；溶液离子强度：溶液离子强度：离子强度越小离子强度越小,电动势越大电动势越大,泳动泳动速度越快；速度越快；溶液的黏度：溶液

3、的黏度：泳动速度与溶液的黏度成反比；泳动速度与溶液的黏度成反比；电渗现象：电渗现象：在电场中，液体对于固体支持物的相在电场中，液体对于固体支持物的相对移动。对移动。颗粒的性质：颗粒的性质：一般所带电荷量越大、直径越小或其形一般所带电荷量越大、直径越小或其形状越接近于球形，迁移率就越大。状越接近于球形，迁移率就越大。现在学习的是第5页，共78页1.2.2 1.2.2 两种离子型物质两种离子型物质A A和和B B的混合物的分离的混合物的分离和和现在学习的是第6页，共78页1.3 1.3 电泳技术分类电泳技术分类淀粉凝淀粉凝胶电泳胶电泳聚丙烯聚丙烯酰胺凝酰胺凝胶电泳胶电泳琼脂琼脂糖凝胶糖凝胶电泳电泳

4、纸电泳纸电泳 醋酸纤醋酸纤维薄维薄膜电泳膜电泳薄层薄层电泳电泳凝胶支凝胶支持物区持物区带电泳带电泳非凝胶非凝胶支持支持物电泳物电泳显微显微电泳电泳等电聚等电聚焦电泳焦电泳等速等速电泳电泳不用支持物电泳不用支持物电泳用支持物区带电泳用支持物区带电泳是否用支持物是否用支持物现在学习的是第7页，共78页薄层电泳薄层电泳板电泳板电泳柱电泳。柱电泳。根据支持介质形状不同根据支持介质形状不同电泳系统的连续性电泳系统的连续性 连续电泳连续电泳不连续电泳不连续电泳分析电泳分析电泳制备电泳制备电泳定量、免疫电泳。定量、免疫电泳。用途不同用途不同电泳的方向不同电泳的方向不同水平电泳水平电泳垂直电泳垂直电泳现在学习

5、的是第8页，共78页第二节第二节 聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳（聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel polyacrylamide gel electrophoresiselectrophoresis，PAGEPAGE）是以是以聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶作为支持作为支持介质的一种电泳方法。介质的一种电泳方法。聚丙烯酰胺凝胶具有机械强度好，有弹性，透明，聚丙烯酰胺凝胶具有机械强度好，有弹性，透明，化学性质稳定，对化学性质稳定，对pHpH和温度变化小，没有吸附和电渗和温度变化小，没有吸附和电渗作用小的特点，是一种很好的电泳支持介质。作用小的特点，是

6、一种很好的电泳支持介质。PAGE PAGE按凝胶的形状可分为：按凝胶的形状可分为：圆盘状电泳圆盘状电泳 垂直或平板状电泳垂直或平板状电泳 现在学习的是第9页，共78页CHCH2 2=CH=CHC=OC=ONHNH2 2CH2=CHCH2=CH C=OC=O NH NH CH CH2 2 NH NH C=O C=O CH CH2 2=CH=CH丙烯酰胺丙烯酰胺(Acr)Acr)N,N-N,N-甲叉双丙烯酰胺甲叉双丙烯酰胺(Bis)Bis)-CHCH2 2-CH-CH-CHCH2 2-CH-CH-n nCHCH2 2-CH-CH-C=O C=O C=O C=O NH NH2 2 NH NH CH

7、CH2 2 NH NH C=O C=O-CH-CH2 2-CH-CH-CHCH2 2-CH-CH-n nCHCH2 2-CH-CH-C=O C=O C=O C=O NH NH NH NH2 2聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺现在学习的是第10页，共78页2.1 2.1 基本原理基本原理2.1.12.1.1聚丙烯酰胺凝胶的聚合聚丙烯酰胺凝胶的聚合 1)1)化学聚合化学聚合 化学聚合的催化剂通常采用化学聚合的催化剂通常采用过硫酸铵过硫酸铵，此外还需要加速此外还需要加速剂剂TEMEDTEMED（N N，N N，NN，N-N-四甲基乙二胺），它能以四甲基乙二胺），它能以自由基的形式存在。微量自由基的形式存在。微量

8、TEMEDTEMED的加入，可使过硫酸铵的加入，可使过硫酸铵形成自由基：形成自由基：S S2 2OO8 82-2-2SO 2SO4 4-这些自由基的产生可引发丙烯酰胺与甲叉双丙烯酰胺的这些自由基的产生可引发丙烯酰胺与甲叉双丙烯酰胺的聚合、交联反应，形成有一定平均孔径的聚丙烯酰胺。聚合、交联反应，形成有一定平均孔径的聚丙烯酰胺。.现在学习的是第11页，共78页 2)2)光聚合光聚合 光聚合通常用光聚合通常用核黄素核黄素为催化剂，核黄素经光照形成无为催化剂，核黄素经光照形成无色基，再被痕量氧氧化形成自由基，引发聚合反应。色基，再被痕量氧氧化形成自由基，引发聚合反应。TEMEDTEMED的存在，可以

9、加速聚合。的存在，可以加速聚合。上述聚合反应受许多因素的影响：上述聚合反应受许多因素的影响：（1 1）大气氧能淬灭自由基，阻止多聚体链长的增加。在）大气氧能淬灭自由基，阻止多聚体链长的增加。在进行化学聚合前，一般用减压抽气的办法除去溶液中溶解进行化学聚合前，一般用减压抽气的办法除去溶液中溶解的空气。在胶液表面，往往覆盖一层水或溶液，隔绝空气，的空气。在胶液表面，往往覆盖一层水或溶液，隔绝空气，可加速聚合。可加速聚合。（2 2）低温、低）低温、低pHpH都会减慢聚合反应速度。都会减慢聚合反应速度。（3 3）有些材料如聚丙烯酸甲酯有机玻璃，一些金属等）有些材料如聚丙烯酸甲酯有机玻璃，一些金属等可抑

10、制聚合反应。可抑制聚合反应。现在学习的是第12页，共78页2.1.2 2.1.2 凝胶用量计算凝胶用量计算 聚丙烯酰胺凝胶孔径的大小取决于凝胶总浓度（聚丙烯酰胺凝胶孔径的大小取决于凝胶总浓度（T%T%）和交联度（和交联度（C%C%）。）。T%=T%=C%=C%=式中式中a a代表单体代表单体ArcArc的重量的重量(g)g)，b b代表交联剂代表交联剂BisBis的重量的重量(g)g)，mm代表溶液的体积代表溶液的体积(mL)mL)a+bm100%aa+b100%现在学习的是第13页，共78页分子量范围适宜凝胶浓度T%510525表表 分离蛋白质选择聚丙烯酰胺凝胶浓度参考值分离蛋白质选择聚丙烯

11、酰胺凝胶浓度参考值在浓度为在浓度为7.5%7.5%的凝胶中，大多数生物体内的蛋白质能得到满意的分离效果。的凝胶中，大多数生物体内的蛋白质能得到满意的分离效果。因此，把浓度为因此，把浓度为7.5%7.5%凝胶称为凝胶称为标准胶标准胶。对于一个未知样品，常用。对于一个未知样品，常用7.5%7.5%的标准的标准胶或胶或4%-10%4%-10%的凝胶梯度来测试，而后选出适宜的凝胶浓度。的凝胶梯度来测试，而后选出适宜的凝胶浓度。现在学习的是第14页，共78页2.1.3 2.1.3 分离效应分离效应聚丙烯酰胺凝胶电泳分为聚丙烯酰胺凝胶电泳分为:连续性电泳连续性电泳不连续性电泳不连续性电泳:凝胶层的不连续性

12、凝胶层的不连续性 缓冲液离子成分的不连续性缓冲液离子成分的不连续性 pH pH值的不连续性值的不连续性 电位梯度的不连续性电位梯度的不连续性电泳时产生的电泳时产生的 3 3种物理效应种物理效应:浓缩效应浓缩效应 电荷效应电荷效应 分子筛效应分子筛效应现在学习的是第15页，共78页A.样品的浓缩效应样品的浓缩效应缓冲液成分及缓冲液成分及pHpH的不连续性的不连续性浓缩胶浓缩胶pH6.7pH6.7缓冲液缓冲液 浓缩胶浓缩胶Tris-HCl,Tris-HCl,电极缓冲液电极缓冲液Tris-Tris-GlyGly缓冲液缓冲液样品样品浓缩胶浓缩胶分离胶分离胶现在学习的是第16页，共78页缓冲液成分及缓冲

13、液成分及pHpH的不连续性导致蛋白质样品浓缩的不连续性导致蛋白质样品浓缩效应示意图效应示意图快离子快离子慢离子慢离子蛋白质样品蛋白质样品 解离度解离度 ：ClCl 蛋蛋 GlyGlymmclcl clclmm蛋蛋 蛋蛋 m m GlyGly GlyGly凝胶中凝胶中ClCl为快离子，为快离子，GlyGly为慢离子，蛋白质样品被为慢离子，蛋白质样品被夹在中间。夹在中间。现在学习的是第17页，共78页凝胶层的不连续性凝胶层的不连续性 样品进入浓缩胶有一个堆积样品进入浓缩胶有一个堆积浓缩效应浓缩效应(缓冲液缓冲液pH8.3)pH8.3)蛋白质从蛋白质从“”极向极向“”极移动，从浓缩胶进入极移动，从浓

14、缩胶进入分离胶，速度变慢，堆积浓分离胶，速度变慢，堆积浓缩。缩。缓冲液缓冲液样品样品浓缩胶浓缩胶分离胶分离胶现在学习的是第18页，共78页E E：每厘米的电压降每厘米的电压降 E EI(I(电流强度电流强度)/)/(电导率电导率)E E与电泳速度成正比与电泳速度成正比电泳开始后，由于快离子泳动电泳开始后，由于快离子泳动率最大，在快离子后面形成一率最大，在快离子后面形成一个离子浓度低的低电导区，产个离子浓度低的低电导区，产生较高的电位梯度，使蛋白质生较高的电位梯度，使蛋白质和慢离子加速移动，蛋白质样和慢离子加速移动，蛋白质样品被进一步浓缩。品被进一步浓缩。电位梯度的不连续性电位梯度的不连续性现在

15、学习的是第19页，共78页B.电荷效应电荷效应蛋白质样品进入分离胶后，蛋白质样品进入分离胶后，pH pH增大增大(pH 8.9)pH 8.9)，GlyGly解离度增解离度增大，不存在快、慢离子之分，蛋大，不存在快、慢离子之分，蛋白质样品在均一电场强度和白质样品在均一电场强度和pHpH条条件下泳动。件下泳动。由于各种蛋白质由于各种蛋白质pIpI不同，所载有效不同，所载有效电荷不同，因此质点的有效迁移率电荷不同，因此质点的有效迁移率不同，形成不同区带。不同，形成不同区带。缓冲液缓冲液浓缩胶浓缩胶分离胶分离胶现在学习的是第20页，共78页C.分子筛效应分子筛效应 分离胶的孔径小，各分子分离胶的孔径小

16、，各分子由于大小和形状不同，所由于大小和形状不同，所受阻力不同，表现出不同受阻力不同，表现出不同的的 泳动速度，即分子筛泳动速度，即分子筛作用。分子量小，形状为作用。分子量小，形状为球形的泳动速度最快。球形的泳动速度最快。缓冲液缓冲液浓缩胶浓缩胶分离胶分离胶现在学习的是第21页，共78页2.2 2.2 PAGEPAGE的优点的优点1 1）聚丙烯酰胺凝胶电渗作用较小；）聚丙烯酰胺凝胶电渗作用较小；2 2）聚丙烯酰胺凝胶孔径可控制；）聚丙烯酰胺凝胶孔径可控制；3 3）聚丙烯酰胺凝胶对热稳定，无色透明；）聚丙烯酰胺凝胶对热稳定，无色透明；4 4）丙烯酰胺是比较纯的化合物。）丙烯酰胺是比较纯的化合物。

17、5 5）分辨率高，尤其在不连续凝胶电泳中。）分辨率高，尤其在不连续凝胶电泳中。现在学习的是第22页，共78页2.3 2.3 影响凝胶聚合的因素影响凝胶聚合的因素1 1）形成凝胶的试剂的纯度；）形成凝胶的试剂的纯度；2 2）凝胶浓度；）凝胶浓度；3 3）温度和氧气的影响。）温度和氧气的影响。现在学习的是第23页，共78页第三节第三节 SDSSDS聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 加入加入SDSSDS（十二烷基磺酸钠）和少量巯十二烷基磺酸钠）和少量巯基乙醇，则生物大分子的迁移率主要取决于基乙醇，则生物大分子的迁移率主要取决于它的分子量，而与原来所带电荷、分子形状它的分子量，而与原来所带电荷、分

18、子形状无关。无关。现在学习的是第24页，共78页3.1 3.1 基本原理：基本原理：1 1、由于、由于SDSSDS是阴离子，使多肽表面覆盖的负电荷远是阴离子，使多肽表面覆盖的负电荷远远超过蛋白质分子原有的电荷量，消除了原来的电荷差远超过蛋白质分子原有的电荷量，消除了原来的电荷差异。异。2 2、改变了蛋白质单体分子的构象，不同蛋白质的、改变了蛋白质单体分子的构象，不同蛋白质的SDSSDS复合物的短轴长度都相同，长轴长度随其分子量的大小成复合物的短轴长度都相同，长轴长度随其分子量的大小成正比变化。正比变化。3 3、由于不同蛋白质的、由于不同蛋白质的SDSSDS复合物具有相同的荷质比，复合物具有相同

19、的荷质比，并具有相似的构象，因而有如下公式：并具有相似的构象，因而有如下公式：lgM=KlgM=K1 1KK2 2 R R （K K1 1、K K2 2为常数，为常数，R R为相对迁移率）为相对迁移率）现在学习的是第25页，共78页 实际测定时，以几种标准单体蛋白质分子量实际测定时，以几种标准单体蛋白质分子量的对数值对其的对数值对其 R R作图，根据样品的作图，根据样品的 R R值，从标准值，从标准曲线上就可查出其分子量曲线上就可查出其分子量。标准蛋白分子量标准蛋白分子量未未知知蛋蛋白白在一定的凝胶浓度下，多肽在一定的凝胶浓度下，多肽链分子量的对数与多肽链的链分子量的对数与多肽链的相对迁移率成

20、线性关系，所相对迁移率成线性关系，所以可以通过标准曲线求未知以可以通过标准曲线求未知多肽链分子量多肽链分子量。相对迁移率相对迁移率现在学习的是第26页，共78页3.2 SDS-PAGE3.2 SDS-PAGE的的操作步骤操作步骤1.安装膜具（1）（2）现在学习的是第27页，共78页（3）（4）（5）现在学习的是第28页，共78页2.2.配制凝胶溶液配制凝胶溶液 3.3.灌胶灌胶 凝胶配方凝胶配方储存液储存液 凝胶终浓度凝胶终浓度T(C=3%)T(C=3%)3%5%10%15%20%3%5%10%15%20%单体储液单体储液ml 3.4 5 10 15 20ml 3.4 5 10 15 20浓缩

21、胶缓冲液浓缩胶缓冲液 2.4 2.4分离胶缓冲液分离胶缓冲液 7.5 7.5 7.5 7.5 7.5 7.5 7.5 7.510%10%SDS 0.2 0.3 0.3 0.3 0.3SDS 0.2 0.3 0.3 0.3 0.3双蒸水双蒸水 14 17.2 12.2 7.2 2.2 14 17.2 12.2 7.2 2.210%10%过硫酸铵过硫酸铵ul 10 10 10 10 10ul 10 10 10 10 10TEMED ul 10 10 10 10 10TEMED ul 10 10 10 10 10现在学习的是第29页，共78页插入梳子插入梳子现在学习的是第30页，共78页胶凝后用夹子

22、将玻璃夹出胶凝后用夹子将玻璃夹出将封胶条轻轻撕掉将封胶条轻轻撕掉现在学习的是第31页，共78页 旋转旋转180180度，度，凹玻璃向里凹玻璃向里加缓冲液加缓冲液现在学习的是第32页，共78页4.4.样品制备样品制备 将将0.50.5ml ml 样品液，样品液，0.25 0.25ml 10%SDSml 10%SDS和和0.250.25ml 1%ml 1%巯基乙醇于小试管中，置巯基乙醇于小试管中，置100100水浴中煮沸水浴中煮沸3 3分钟后，取出冷却，分钟后，取出冷却，然后，加入然后，加入0.250.25ml ml 上样缓冲液上样缓冲液(0.05%(0.05%溴溴酚兰酚兰+40%+40%蔗糖溶液

23、蔗糖溶液)，混合。取出混合样，混合。取出混合样品品4040微升加入样品槽，每个样品重复两个。微升加入样品槽，每个样品重复两个。现在学习的是第33页，共78页5.5.加加 样样现在学习的是第34页，共78页6.6.电泳电泳接通电源，电流恒定为接通电源，电流恒定为8080mAmA，待溴酚兰指示剂待溴酚兰指示剂移至离下端移至离下端0.50.5cmcm（约约3 3小时），切断电源，拔去小时），切断电源，拔去插头，倒出电极缓冲液。插头，倒出电极缓冲液。现在学习的是第35页，共78页7.7.剥剥 胶胶注意保持胶的完整性。注意保持胶的完整性。现在学习的是第36页，共78页8 8 染色染色 1.1.染色液：染

24、色液：考马思亮蓝考马思亮蓝G-250 1.0G-250 1.0克克 甲醇甲醇 450 450mlml 冰醋酸冰醋酸 100 100mlml 加加H H2 2O O 到到 1000 1000mlml9 9 脱色脱色 1.1.脱色液：脱色液：甲醇甲醇 100 100mlml 冰醋酸冰醋酸 100 100mlml 加加HH2 2O O 到到 1000 1000mlml现在学习的是第37页，共78页电泳后的凝胶经考马斯亮篮染色、脱色后的凝胶照片电泳后的凝胶经考马斯亮篮染色、脱色后的凝胶照片Mark:Myosin 200000w-galactosidase 116250Phosphorylase b 9

25、7400Serum albumin 66200Ovalbumin 45000Carbonic anhydrase 31000Trysin inhibitor 21500Lysozyme 14400Aprotinin 6500现在学习的是第38页，共78页10 10 凝胶（脱色凝胶（脱色之后）结果分析之后）结果分析 1 1、计算迁移率（、计算迁移率（R Rmm值）：值）：相对迁移率相对迁移率=2 2、绘制标准曲线：以标准蛋白亚基的、绘制标准曲线：以标准蛋白亚基的R Rmm值为横坐标，值为横坐标，以相应分子量的对数值为纵坐标，即可绘制出测定蛋以相应分子量的对数值为纵坐标，即可绘制出测定蛋白质分子量

26、的标准的线图。白质分子量的标准的线图。3 3、计算未知蛋白亚基样品的分子量：根据未知样品样的、计算未知蛋白亚基样品的分子量：根据未知样品样的R Rmm值，值，从上述标准曲线图中即可查出其分子量。从上述标准曲线图中即可查出其分子量。蛋白样品距加样端迁移距离蛋白样品距加样端迁移距离(cm)cm)溴酚蓝区带中心距加样端距离溴酚蓝区带中心距加样端距离(cm)cm)现在学习的是第39页，共78页3.3 3.3 注意事项注意事项 1 1丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺是神经毒性试剂，并对皮肤丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺是神经毒性试剂，并对皮肤有刺激作用，注意避免直接接触。大量操作时应在通风橱中进有刺激作用，注意避免直

27、接接触。大量操作时应在通风橱中进行。行。2 2丙稀酰胺和甲叉双丙烯酰胺溶液应装在棕色瓶中，丙稀酰胺和甲叉双丙烯酰胺溶液应装在棕色瓶中，置冰箱内（置冰箱内（44）保存。可贮存）保存。可贮存1 12 2个月。测定个月。测定pHpH（4.94.95.25.2）可检查其是否失效，失效不能聚合。可检查其是否失效，失效不能聚合。3 3TEMEDTEMED要密封保存，过硫酸铵溶液最好当天配制，要密封保存，过硫酸铵溶液最好当天配制，以防止氧化失效。以防止氧化失效。4 4凝胶的聚合速度与温度关系很大，温度低时，聚凝胶的聚合速度与温度关系很大，温度低时，聚合速度减慢，必须根据实验时的温度调整合速度减慢，必须根据实

28、验时的温度调整3 3号、号、4 4号试剂的号试剂的用量，以使凝胶在用量，以使凝胶在30 30 minmin内聚合内聚合。现在学习的是第40页，共78页 等电聚焦凝胶电泳是依据蛋白质分子的等电点进行分等电聚焦凝胶电泳是依据蛋白质分子的等电点进行分离的技术，等电聚焦中，蛋白质分子在含有载体两性电解离的技术，等电聚焦中，蛋白质分子在含有载体两性电解质形成的一个连续而稳定的线性质形成的一个连续而稳定的线性pHpH梯度中电泳。载体两梯度中电泳。载体两性电解质是脂肪族多氨基多羧酸，在电场中形成正极性电解质是脂肪族多氨基多羧酸，在电场中形成正极为酸性，负极为碱性的连续的为酸性，负极为碱性的连续的pHpH梯度

29、。蛋白质分子梯度。蛋白质分子在偏离其等电点的在偏离其等电点的pHpH条件下带有电荷，因此可以在电场条件下带有电荷，因此可以在电场中移动；当蛋白质迁移至其等电点位置时，其静电荷数为中移动；当蛋白质迁移至其等电点位置时，其静电荷数为零，在电场中不再移动，据此将蛋白质分离。零，在电场中不再移动，据此将蛋白质分离。第四节第四节 等电聚焦等电聚焦现在学习的是第41页，共78页两性电解质载体两性电解质载体(carrier ampholytes)carrier ampholytes)(1)(1)易易溶溶于于水水，在在pIpI处处应应有有足足够够的的缓缓冲冲能能力力，形形成成稳稳定定的的pHpH梯梯度度，不不

30、致致被被蛋蛋白白质质或或其其它它两两性性电电解解质质改改变变pHpH梯梯度。度。(2)(2)在在pIpI处处应应有有良良好好的的电电导导及及相相同同的的电电导导系系数数，以以保保持持均均匀匀的电场。的电场。(3)(3)分分子子量量小小，可可通通过过透透析析或或分分子子筛筛法法除除去去，便便于于与与生生物大分子分开。物大分子分开。(4)(4)化化学学性性能能稳稳定定，与与被被分分离离物物不不起起化化学学反反应应，也也无无变变性作用，其化学组成不同于蛋白质性作用，其化学组成不同于蛋白质。现在学习的是第42页，共78页 利用聚丙烯利用聚丙烯酰胺凝胶内的缓酰胺凝胶内的缓冲液在电场作用冲液在电场作用下沿

31、电场方向在下沿电场方向在凝胶内制造一个凝胶内制造一个pHpH梯度。梯度。每种蛋白质每种蛋白质都将迁移至与它都将迁移至与它的的pI pI 相一致的相一致的pHpH处。处。凝胶中加有凝胶中加有两性电解质两性电解质溶液溶液（pH9-3）加电场后加电场后在凝胶内形在凝胶内形成一个稳定成一个稳定pH梯度梯度 加样品，加样品，然后继续然后继续电泳电泳凝胶染色表明凝胶染色表明样品按照各自样品按照各自pI值沿着值沿着pH梯梯度分布度分布现在学习的是第43页，共78页等等电电聚聚焦焦电电泳泳进进行行过过程程中中等等电电聚聚焦焦电电泳泳结结束束后后（）（）（）（）（）（）（）（）低低pHpH低低pHpH高高pHp

32、H高高pHpH现在学习的是第44页，共78页试剂与器材试剂与器材试剂：两性电解质载体试剂：两性电解质载体pH 3-10 pH 3-10、10%10%四甲基四甲基乙二胺乙二胺 、10%10%过硫酸铵过硫酸铵 、5%5%HH3 3POPO4 4 、2%NaOH 2%NaOH、40%40%蔗糖蔗糖 、0.040.04考马斯亮考马斯亮兰兰R250 R250、7%7%醋酸醋酸器材：圆盘电泳槽器材：圆盘电泳槽 、稳压稳流电泳仪、稳压稳流电泳仪 、脱色、脱色摇床摇床现在学习的是第45页，共78页操作方法操作方法1.1.凝胶柱的制备凝胶柱的制备（1 1）玻璃管的一端插在橡皮帽中）玻璃管的一端插在橡皮帽中(与橡

33、皮接触的部分凝胶不易与橡皮接触的部分凝胶不易聚合，可在橡皮帽中先加一滴聚合，可在橡皮帽中先加一滴40%40%的蔗糖的蔗糖)（2 2）配胶）配胶表表 10 10mL 7.5%mL 7.5%凝胶的配制凝胶的配制试试 剂剂 名名 称称 体积体积(mL)mL)凝胶贮液凝胶贮液 2.5 2.5两性电解质载体两性电解质载体 0.5 0.510%10%TEMEDTEMED 0.1 0.1蛋白质混合样品蛋白质混合样品 0.1 0.1蒸馏水蒸馏水 6.75 6.75混匀后置真空干燥器中抽气混匀后置真空干燥器中抽气10 10 minmin10%10%过硫酸铵过硫酸铵 0.05 0.05现在学习的是第46页，共78

34、页（3 3）将配好的凝胶溶液用细长头滴管加到预先准备好）将配好的凝胶溶液用细长头滴管加到预先准备好的玻管中，的玻管中，至离上端至离上端1 1cmcm处处，再用注射器缓缓加水，再用注射器缓缓加水3-5 3-5 mmmm高。高。（4 4）待凝胶聚合）待凝胶聚合2.2.电泳电泳小心地拔出玻管，并用蒸馏水洗去蔗糖溶液，把小心地拔出玻管，并用蒸馏水洗去蔗糖溶液，把管固定到电泳槽上槽的洞中管固定到电泳槽上槽的洞中（安装时要保证凝胶管垂（安装时要保证凝胶管垂直且橡胶塞孔密封不漏）直且橡胶塞孔密封不漏）在上槽中加入在上槽中加入5%5%磷酸缓冲液，磷酸缓冲液，在下槽中装入在下槽中装入2%2%氢氧化钠溶液。氢氧化

35、钠溶液。避免管下有气泡避免管下有气泡。上槽。上槽接电泳仪的正极，下槽接负极，打开电源，先调电压接电泳仪的正极，下槽接负极，打开电源，先调电压至至100100V V，待电压稳定后再升到待电压稳定后再升到300300V V，电泳电泳2 2 h h以上至以上至电流降为电流降为0 0，将电压调至，将电压调至0 0，关闭电源。，关闭电源。现在学习的是第47页，共78页3 3剥胶剥胶 电电泳泳结结束束后后，取取下下凝凝胶胶管管，用用蒸蒸馏馏水水充充分分洗洗净净两两端端电电极极液液，在在凝凝胶胶条条的的正正极极端端插插一一铜铜丝丝为为标标记记。用用灌灌满满水水的的注注射射器器长长针针头头插插入入凝凝胶胶与与

36、玻玻管管管管壁壁之之间间，边边压压水水边边慢慢慢慢转转动动玻玻管管，推推针针前前进进，同同时时注注入入水水，靠靠水水流流压压力力和和润润滑滑力力将将玻玻璃璃管管内内壁壁与凝胶分开，凝胶条即可流出。与凝胶分开，凝胶条即可流出。4.4.固定染色固定染色取取其其中中一一条条凝凝胶胶条条放放在在一一块块洁洁净净的的玻玻板板上上，用用尺尺量量出出固固定定前前的的凝凝胶胶条条长长度度。放放入入染染色色液液中中同同时时进进行行固固定定染染色色1-21-2h h，用用蒸蒸馏馏水水漂漂洗洗数数次次后后用用脱脱色色液液脱脱色色，直直至至蛋蛋白白质质区区带带清清晰晰，量量出蛋白带距正极端的距离。出蛋白带距正极端的距

37、离。现在学习的是第48页，共78页5.5.pHpH梯度的制作梯度的制作取取另另一一条条凝凝胶胶条条放放在在玻玻板板上上，从从凝凝胶胶的的正正极极端端开开始始，每每隔隔0.50.5cmcm切切下下一一段段，依依次次放放入入已已编编好好号号并并装装有有1 1mLmL蒸蒸馏馏水水的的试试管管中中，浸浸泡泡过过夜夜。次次日日用用酸酸度度计计分分别别测测定定每每管管浸浸提提液液的的pHpH值值。以以凝凝胶胶长长度度为为横横坐坐标标，pHpH值值为为纵纵坐坐标标，绘制标准绘制标准pHpH梯度曲线。梯度曲线。6.6.蛋白质样品等电点的计算蛋白质样品等电点的计算 求出蛋白质聚焦部位距凝胶条正极端的实际长度为：

38、求出蛋白质聚焦部位距凝胶条正极端的实际长度为：固定后的蛋白区带中心距凝胶条正极端的距离固定后的蛋白区带中心距凝胶条正极端的距离 固定染色前凝胶条长度固定染色前凝胶条长度 固定染色后凝胶条长度固定染色后凝胶条长度计计算算出出蛋蛋白白质质聚聚焦焦部部位位距距凝凝胶胶条条正正极极端端的的实实际际长长度度后，直接从后，直接从pHpH梯度曲线上求出该蛋白质等电点。梯度曲线上求出该蛋白质等电点。现在学习的是第49页，共78页等电点聚焦的显著优点等电点聚焦的显著优点1.1.分辨率高分辨率高2.2.很稀的样品都可分离，且重现性好很稀的样品都可分离，且重现性好3.3.可用于测定蛋白质或多肽的等电点可用于测定蛋白

39、质或多肽的等电点等电点聚焦的缺点等电点聚焦的缺点1.1.要求使用无盐溶液，而某些蛋白质在无盐溶液中溶要求使用无盐溶液，而某些蛋白质在无盐溶液中溶解度低，可能产生沉淀；解度低，可能产生沉淀；2.2.样品中各组分都聚焦到其等电点，对一些在等电点不样品中各组分都聚焦到其等电点，对一些在等电点不溶解或发生变性的蛋白质不适用溶解或发生变性的蛋白质不适用。现在学习的是第50页，共78页注意事项注意事项(1)(1)盐离子可干扰盐离子可干扰pHpH梯度形成并使区带扭曲。为防止上述梯度形成并使区带扭曲。为防止上述影响，进行影响，进行IEF-PAGEIEF-PAGE时，样品应透析或用时，样品应透析或用Sephad

40、exG-25SephadexG-25脱盐，也可将样品溶解在水或低脱盐，也可将样品溶解在水或低盐缓冲液中使其充分溶解，以免不溶小颗粒引起盐缓冲液中使其充分溶解，以免不溶小颗粒引起拖尾。拖尾。(2)(2)加样量则取决于样品中蛋白质的种类、数目以及检加样量则取决于样品中蛋白质的种类、数目以及检测方法的灵敏度。如用考马斯亮蓝测方法的灵敏度。如用考马斯亮蓝R-250R-250染色，加染色，加样量可为样量可为50-150 50-150 g g；如用银染色，加样量可减如用银染色，加样量可减少到少到1 1 g g。一般样品浓度以一般样品浓度以0.5-3 0.5-3 mg/mLmg/mL为宜，为宜，最适当加样体

41、积为最适当加样体积为10-30 10-30 l l。现在学习的是第51页，共78页第五节第五节 双向凝胶电泳双向凝胶电泳 双向凝胶是一种由任意两个凝胶电泳组合而成的，双向凝胶是一种由任意两个凝胶电泳组合而成的，即在第一向电泳后再在与第一向垂直的方向上进行第即在第一向电泳后再在与第一向垂直的方向上进行第二向电泳。二向电泳。其基本原理一般与组成它的两个单向电其基本原理一般与组成它的两个单向电泳基本原理相同。泳基本原理相同。现在学习的是第52页，共78页第一向：第一向：等电聚焦电泳等电聚焦电泳第二向：第二向：SDS-PAGESDS-PAGE 双向电泳后的凝胶经双向电泳后的凝胶经染色后蛋白呈现二维分布

42、图：染色后蛋白呈现二维分布图：水平方向反映出蛋白水平方向反映出蛋白在在pIpI上的差异，上的差异，垂直方向反映出它们在垂直方向反映出它们在分子量上的差别。分子量上的差别。第一向电泳：第一向电泳：等电聚焦电等电聚焦电泳泳聚焦后凝聚焦后凝胶放置在胶放置在SDS凝胶上，凝胶上，进行第二向进行第二向电泳电泳第二向电泳：第二向电泳：SDS-PAGE分子量大分子量大分子分子量小量小pH9pH3pH9pH3现在学习的是第53页，共78页现在学习的是第54页，共78页操作步骤：操作步骤：蛋白样品的制备蛋白样品的制备 等电聚焦凝胶溶液的配制等电聚焦凝胶溶液的配制 灌注毛细管凝胶灌注毛细管凝胶 组装第一向电泳槽组

43、装第一向电泳槽 聚焦电泳聚焦电泳 停止电泳停止电泳 取出毛细管胶取出毛细管胶 毛细管胶置平衡液中平衡毛细管胶置平衡液中平衡现在学习的是第55页，共78页组装第二向电泳槽组装第二向电泳槽配制配制SDS-SDS-丙烯胺凝胶溶液丙烯胺凝胶溶液灌装灌装SDS-SDS-电泳胶电泳胶第一向凝胶与第二向凝胶拼接第一向凝胶与第二向凝胶拼接接通电源进行接通电源进行SDS-SDS-电泳电泳停止电泳取胶停止电泳取胶凝胶置固定液中固定凝胶置固定液中固定 银染法显色银染法显色 结果分析结果分析现在学习的是第56页，共78页大肠杆菌全蛋白提取液双向电泳凝胶染色后照片大肠杆菌全蛋白提取液双向电泳凝胶染色后照片现在学习的是第

44、57页，共78页样品的溶解样品的溶解是是2-2-DEDE成功分离蛋白质的最关键因素之一。成功分离蛋白质的最关键因素之一。溶解的目标：溶解的目标：1 1、样品中非共价结合的蛋白质复合物和聚积体完全破坏，从而、样品中非共价结合的蛋白质复合物和聚积体完全破坏，从而形成各个多肽的溶解液（否则样品中结合牢固的蛋白复合物可形成各个多肽的溶解液（否则样品中结合牢固的蛋白复合物可能使能使2-2-DEDE中出现新的蛋白点，相应的表示单个多肽的点的中出现新的蛋白点，相应的表示单个多肽的点的强度会下降）；强度会下降）；2 2、溶解方法必须允许可能干扰、溶解方法必须允许可能干扰2-2-DEDE分离的盐、脂类、多分离的

45、盐、脂类、多糖和核酸等物质的去除；糖和核酸等物质的去除；3 3、溶解方法要保证样品在电泳过程中保持溶解状态。、溶解方法要保证样品在电泳过程中保持溶解状态。现在学习的是第58页，共78页增加样品溶解性的手段增加样品溶解性的手段变性剂：变性剂：通过改变溶液中的氢键结构使蛋白质充分伸展，将其疏通过改变溶液中的氢键结构使蛋白质充分伸展，将其疏水中心完全暴露，降低接近疏水残基的能量域。其典型代表是尿水中心完全暴露，降低接近疏水残基的能量域。其典型代表是尿素和硫尿。素和硫尿。表面活性剂：表面活性剂：经过变性剂处理而暴露蛋白质的疏水基团后，还经过变性剂处理而暴露蛋白质的疏水基团后，还常需至少一种表面活性剂来

46、溶解疏水基团。常用的表面活性剂常需至少一种表面活性剂来溶解疏水基团。常用的表面活性剂有离子去污剂有离子去污剂SDSSDS、非离子去污剂非离子去污剂Triton X-100Triton X-100和和NP-40NP-40、两性两性离子去污剂离子去污剂CHAPSCHAPS、OBGOBG等。其中等。其中CHAPSCHAPS和和SB3-10SB3-10最好。最好。还原剂：还原剂：在变性剂和表面活性剂联用条件下，加用还原剂可在变性剂和表面活性剂联用条件下，加用还原剂可使已变性的蛋白质展开更完全，溶解更彻底。常用含自由巯使已变性的蛋白质展开更完全，溶解更彻底。常用含自由巯基的基的DTTDTT或或-巯基乙醇

47、，以及不带电荷的三丁基膦（巯基乙醇，以及不带电荷的三丁基膦（TBPTBP）进行还进行还原。原。现在学习的是第59页，共78页起载体作用的两性电解质：起载体作用的两性电解质：即便在变性剂和表面活性剂存即便在变性剂和表面活性剂存在的情况下，某些蛋白质也需要在盐离子的作用下才能在的情况下，某些蛋白质也需要在盐离子的作用下才能保持其处于溶解状态，否则这些蛋白质在其处于保持其处于溶解状态，否则这些蛋白质在其处于pIpI点时点时会发生沉淀。会发生沉淀。Carrier ampholytes Carrier ampholytes的作用在于捕获样品中的少量盐的作用在于捕获样品中的少量盐分，从而保证蛋白质的溶解性

48、。应用时，两性电解质的分，从而保证蛋白质的溶解性。应用时，两性电解质的浓度应小于浓度应小于0.20.2（w/v)w/v)。浓度过高会使浓度过高会使IEFIEF的速度降低。的速度降低。另外，为了保证实验的精确性，在选择不同另外，为了保证实验的精确性，在选择不同pHpH范围的范围的IPGIPG胶条时，也应使两性电解质的胶条时，也应使两性电解质的pHpH值与之相符合。值与之相符合。现在学习的是第60页，共78页非非变变性性2 2D-PAGED-PAGE：两两向向均均在在非非变变性性条条件件下下进进行行，这这样样分分离离的的蛋蛋白白质质点点的的等电点和表观分子量同生理条件下获得的这些蛋白的值是一样的；

49、等电点和表观分子量同生理条件下获得的这些蛋白的值是一样的；非非变变性性/SDS-2D-PAGESDS-2D-PAGE：第第一一向向采采用用非非变变性性IEFIEF，之之后后在在2%2%SDSSDS溶溶液液中中平平衡衡；第第二二向向也也在在SDSSDS存存在在的的条条件件下下进进行行。适适于于分分析析非非共共价价键键连连接接的的蛋蛋白白蛋白间的相互作用。蛋白间的相互作用。非非变变性性/还还原原/SDS-2D-PAGESDS-2D-PAGE：非非变变性性条条件件下下IEFIEF聚聚焦焦，之之后后用用8 8MM尿尿素素5%5%-ME-ME2%SDS2%SDS进进行行平平衡衡，再再进进行行第第二二向向

50、SDS-PAGSDS-PAG电电泳泳。此此时时分分离离的的蛋蛋白白质质点点可可进进行行点点的的切切取取、蛋蛋白白酶酶消消化化、MALDI-TOF-MSMALDI-TOF-MS分分析析鉴鉴定定，提供关于断裂二硫键连接的多肽的信息。提供关于断裂二硫键连接的多肽的信息。变变性性2 2D-PAGED-PAGE：样样品品先先用用2%2%SDSSDS5%-ME5%-ME9595变变性性5 5minmin，IEFIEF在在8 8MM尿尿素素1%1%NP-40NP-40条条件件下下进进行行，之之后后胶胶条条用用2%2%SDSSDS5%-ME5%-ME平平衡衡，然然后后进进行行SDS-PAGESDS-PAGE。