荧光定量实验设计及优化.ppt

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1、荧光定量光定量实验设计及及优化化现在学习的是第1页，共29页PCR的建立与优化的建立与优化核酸纯化与逆转录核酸纯化与逆转录PCR试剂体系引物、探针的设计引物、探针的设计2现在学习的是第2页，共29页3长度 16-24 bases（引物）序列 不能有以下情况：任意2个引物或探针之间的序列互补引物或探针本身有二级结构连续的 GGG，引物的5端有G引物3端最后5个碱基有2个以上的G或C引物3端最后1个碱基为A GC含量 40-60%GC GC/AT分布大致均衡,C含量G探针复性温度 6570C 引物复性温度 6065C PCR引物与探针3现在学习的是第3页，共29页标记 淬灭基团采用无荧光背景的如B

2、HQ,不要用tamraPCR产物长度 50150bpDesign primer design software，选择序列保守区域 如果保守区域太短，可以在引物中考虑引入LNA提高Tm 探针可以考虑引入LNA或改用MGB或自淬灭taqman探针 简并引物或探针需要同时考虑多种情况下的Tm高低纯化与否 PAGE/HPLC PCR引物与探针4现在学习的是第4页，共29页SNP的Taqman双色检测中，突变探针一般Fam标记相对定量分析中内参基因一般Hex标记 (例如Roche的UPL相对定量解决方案)对检测要求更高的建议Fam标记(灵敏度或者 定量 vs 定性)扩增效率较差的建议Fam标记 PCR引

3、物与探针5现在学习的是第5页，共29页Reaction ConditionsPrimers and ProbesConcentration Range(final con.)Primers:0.1 M 1.0 M eachProbes:0.1 M 0.5 MStandard Concentrations(final conc.)Primers:0.5 M eachProbes:0.2 MExample:Universal ProbeLibrary assayHigher primers/probe concentrations give better signal to noise ratio

4、(higher fluorescence signal intensitiy)Only minor influence on Cp when used in medium concentration ranges6现在学习的是第6页，共29页PCR的建立与优化的建立与优化核酸纯化与逆转录核酸纯化与逆转录PCR试剂体系引物、探针的设计引物、探针的设计7现在学习的是第7页，共29页建立新的建立新的PCR体系体系:General Hints模板-DNA或 cDNA 为模板对照 -NTC(no template control)每个探针引物组合-阳性对照(如果可能)分析-扩增:sensitivity

5、and efficiency of PCR(crossing points)-熔解曲线分析(SYBR Green I format):检测引物二聚体或其它非特异性扩增凝胶电泳:验证非特异性扩增 melting curve(杂交探针等模式):突变检测或亚型分析8现在学习的是第8页，共29页Standard Conditions in PCRMgCl2 Concentration:2-5 mM9现在学习的是第9页，共29页Basic Optimization in PCRUse any template nucleic acid(NA)suitable for PCR,sufficiently p

6、urified andfree of PCR inhibitors lTemplate Concentration:建议测试多个稀释度(最少2个梯度,102)genomic DNA50 ng-5 pg plasmid DNAapprox.106 copies RNA 500 ng total RNA or 100 ng mRNA cDNA 50 ng equivalent of total RNA，RT product undiluted,1:10 and 1:100 dilutionslNA StorageStore nucleic acids in high concentrations

7、and aliquotsFor low template concentrations,use siliconized tubes and addcarrier NA(10 ng/l),e.g.MS2 RNA 10现在学习的是第10页，共29页Basic Optimization:MgCl2 Titration MgCl2 Titration:2-5 mM Format:SYBR Green I LC FastStart DNA Master11现在学习的是第11页，共29页Basic Optimization:Template Concentration 模板浓度过高会抑制PCR Templ

8、ate DNA undiluted and 1:10 dilution Format SYBR Green I LIghtCycler DNA Master NTCsample 1 originalsample 1 1:1 0 sample 2 originalsample 2 1:1012现在学习的是第12页，共29页SYBR Green I FormatPCR Analysis Example 模板拷贝数越低，越容易出现引物二聚体模板拷贝数越低，越容易出现引物二聚体QuantificationMelting Curve Analysis13现在学习的是第13页，共29页Optimizati

9、on:Influence of PCR InhibitorsPCR抑制物可通过适当稀释样品降低对其对抑制物可通过适当稀释样品降低对其对PCR的影响的影响NTCcDNA originalcDNA 1:2 cDNA 1:4cDNA 1:20 Template cDNA undiluted,1:2,1:4,1:20 dilutions Format SYBR Green I LightCycler DNA Master14现在学习的是第14页，共29页Further Optimization in PCR检测灵敏度和信号强度可以通过调整下列参数得以改进15现在学习的是第15页，共29页PCR的建立与

10、优化的建立与优化核酸纯化与逆转录核酸纯化与逆转录PCR试剂体系引物、探针的设计引物、探针的设计16现在学习的是第16页，共29页AAAAAAAAAAAAtRNAmRNArRNARNase不同丰度不同丰度组织名称组织名称样品量样品量总总RNARNA含量含量高丰度高丰度肝脏肝脏1mg2-4g脾脏脾脏1mg心脏心脏1mg中丰度中丰度大脑大脑1mg 0.05-2g胚胎胚胎1mg肾脏肾脏1mg肺肺1mg低丰度低丰度膀胱膀胱1mg 0-0.05g骨骨1mg脂肪脂肪1mg高丰度高丰度成纤细胞成纤细胞1050.5-1g人白细胞人白细胞105细胞中细胞中RNA的种类和含量的种类和含量现在学习的是第17页，共29

11、页“chaotropic salts”in binding bufferRoche 手工提取手工提取RNA的试剂盒的试剂盒细胞和组织High Pure RNA Isolation KitHigh Pure RNA Tissue KitTriPure Isolation Reagent甲醛固定石蜡包埋组织和石蜡包埋组织High Pure FFPE RNA Micro KitHigh Pure RNA Paraffin Kit提取mRNAmRNA Isolation KitmRNA Capture KitHigh Pure miRNA Isolation Kit病毒 RNAHigh Pure Vi

12、ral RNA Kit*High Pure Viral Nucleic Acid Kit现在学习的是第18页，共29页RNA操作注意事项操作注意事项RNA酶（Rnase）是导致RNA降解最主要的物质。此酶非常稳定，在一些极端的条件下只可暂时失活，但限制因素去除后又迅速恢复活性。常规高温高压灭菌方法和蛋白抑制剂不能使所有的Rnase完全失活。1.Rnase 广泛存在于人的皮肤上，因此制备RNA时必须戴手套戴手套2.Rnase 可存在于取液器中，因此设置RNA 专用专用pipettor,或者采用以DEPC配制的 70%乙醇擦洗取液器的内部和外部，可基本达到要求。3.塑料制品、玻璃和金属物品的处理a

13、.尽量已标明RNase-free的塑料制品，如没有开封使用过，通常不必处理，处理步骤：在浸泡塑料制品的容器中，加入终浓度为0.05%0.1%的DEPC-H2O，室温放置过夜，第二天将DEPC-H2O倒出，高温高压蒸汽灭菌至少30分钟。b.玻璃和金属物品250烘烤3小时以上或者180烘烤8小时以上现在学习的是第19页，共29页RNA操作注意事项操作注意事项 选择新鲜血液，不得超过4小时 选择新鲜、生长旺盛的组织 选择处于生长旺盛时期的细胞可将新鲜血液先进行红细胞裂解，得到白细胞，然后加入一定量的细胞裂解液/TRNzol，-70保存较长时间 推荐使用专门的RNA样品储存液进行储存 去掉培养基，加入

14、一定量RNA 提取试剂，-70保存较长时间RNA 应分装后冻存于-70冰箱，样品不能反复冻融长期保持：RNA提取步骤进行到在70%乙醇洗涤时，停止实验，让RNA保存于70%乙醇中现在学习的是第20页，共29页RNA的评价与鉴定的评价与鉴定纯度（OD260/OD280）：OD260/OD280 2.1说明有部分降解得率（OD260）YieldOD260稀释倍数40ng/ul紫外分光光度计检测现在学习的是第21页，共29页1琼脂糖，6V/cm，15min，上样13 ul 电泳检测M 1 2 M 1 2DNA残留蛋白残留RNA的评价与鉴定的评价与鉴定现在学习的是第22页，共29页RT反应主要组成成分

15、反应主要组成成分Reverse Transcriptase AMV Reverse Transcriptase(Avian Myeloblastosis Virus)48 55C M-MuLV Reverse Transcriptase(Moloney Murine Leukaemia)37 42C Transcriptor Reverse Transcriptase(recombinant,E.coli.)up to 65C引物（引物（Oligo dT or Random Primers or Gene Specific Primers)Sequence-specific primers R

16、andom Hexamer Primers and anchored oligo(dT)NRNA模板模板23现在学习的是第23页，共29页Transcriptor Reverse TranscriptaseTranscriptor reverse transcriptaseAbility to synthesize fragments up to 14 kb(full length cDNA)Reverse transcription of difficult templates(e.g.,GC-rich RNA templates)due to thermostability up to 6

17、5CRNase H activity:degrades RNA in RNA:DNA hybridTranscriptor RTInvitrogen Superscript IIInvitrogen Superscript IIIMax Product size14 kb12.3 kb12.3 kbReaction time30 mins50 mins30-60minReaction temperature42-65 42 50-55 Sensitivity50pg total RNA1ng total RNA10pg RNAGC-rich templateYESNo infoNo infoR

18、Nase H activityYESReducedReduced24现在学习的是第24页，共29页一步法一步法RT-PCR VS.二步法二步法 RT-PCR 2-step RT-PCRreverse transcription and PCR-amplification separately1-step RT-PCRreverse transcription and PCR-amplification in one reaction everything for reverse transcriptioneverything for PCR108 copies of the sequence

19、of interesteverything for reverse transcriptionNewly synthesized cDNAcDNA together with everything for PCR108 copies of the sequence of interest25现在学习的是第25页，共29页一步法和二步法一步法和二步法 RT-PCR优点比较优点比较一步法一步法RT-PCR的优点的优点二步法二步法 RT-PCR的优点的优点降低污染的风险降低污染的风险Single tube ReactionNo transfer/opening requiredAutomation

20、is possible可以分别优化可以分别优化RT和和PCR反应条件反应条件Efficient and accurate amplification增加了灵敏度和特异性增加了灵敏度和特异性Sequence-specific primersEntire cDNA sample as pCR template更加灵活更加灵活Allows choice of primerscDNA from a single RT can be used in several PCRsWide choice of RT and PCR enzymes减少反应时间减少反应时间Fewer pipetting steps

21、Reduced total time of RT-PCR可以最大扩增到可以最大扩增到14 kbAmplify RNA sequences up to 14 kb26现在学习的是第26页，共29页Transcriptor HiFi cDNA Synthesis KitFeaturesBlend of Transcriptor enzyme and a proof reading proteinAchieve 7-fold higher fidelity compared to normal reverse transcriptasesObtain full-length cDNA synthes

22、is in only 10minDetect as low as 10 pg template RNAApplications Sequencing transcriptomesQuantitative RT-PCR applicationsRNA splicing analysisCloning genes of interestGenerating cDNA libraries with large and full-length inserts27现在学习的是第27页，共29页Product Comparison Transcriptor Reverse TranscriptaseTra

23、nscriptor Universal cDNA MasterTranscriptor 1st Strand Synthesis KitTranscriptor High Fidelity cDNA Synth.KitSuperScript III 1st Strand Synthesis SystemSensitivity50pg RNA0.1pg RNA1ug RNA10pg RNA1pg RNAMax frag.length14 kb1 kb14 kb14 kb12kbReaction Time30 min10 min30 min10 min50 minRT Temp.60oC60oC6

24、0oC60oC50oCFidelity+/-+/-+/-+n/aMaster mixnoyesnononoUsed forqPCR,RTqPCRqPCR,RTqPCR,RTRT28现在学习的是第28页，共29页Protector RNase InhibitorKey featuresActive at pH5.0-9.0 and temperature between 25oC-55oCBroadspectruminhibition:RNaseA,RnaseB,RnaseT2When to useReversetranscriptionqPCRInvitrotranscription/translation29现在学习的是第29页，共29页