蛋白质和氨基酸的测定讲稿.ppt

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1、关于蛋白质和氨基酸的测定第一页，讲稿共五十一页哦8-1概述概述8-2蛋白质的定性测定（自学）蛋白质的定性测定（自学）8-3蛋白质的定量测定蛋白质的定量测定*（8-4蛋白质的末端测定）蛋白质的末端测定）8-5氨基酸的定性测定（自学）氨基酸的定性测定（自学）8-6氨基酸的定量测定氨基酸的定量测定*8-7氨基酸的分离及测定氨基酸的分离及测定第八章第八章蛋白质和氨基酸的测定蛋白质和氨基酸的测定第二页，讲稿共五十一页哦本章重点本章重点1.凯氏定氮法的原理及注意事项。凯氏定氮法的原理及注意事项。2.蛋白质快速测定法有哪些？蛋白质快速测定法有哪些？3.氨基酸总量的测定方法（甲醛滴定法）。氨基酸总量的测定方法

2、（甲醛滴定法）。第三页，讲稿共五十一页哦第一节第一节概述概述l蛋白质是复杂的含氮有机化合物。蛋白质是复杂的含氮有机化合物。l蛋白质换算系数蛋白质换算系数F 玉米、鸡蛋、肉玉米、鸡蛋、肉 6.25 6.25 花生花生 5.465.46 乳制品乳制品 6.38 6.38 大米大米 5.955.95 面粉面粉 5.70 5.70 大豆及制品大豆及制品 5.715.71l蛋白质平均含蛋白质平均含N量（量（15-17.6）为）为16%。第四页，讲稿共五十一页哦l不同的食品中蛋白质含量不一样，一般动物性食品的不同的食品中蛋白质含量不一样，一般动物性食品的蛋白质含量高于植物性食品。蛋白质含量高于植物性食品。

3、鸡肉鸡肉鸭鸭兔肉兔肉牛肉牛肉猪肉猪肉带鱼带鱼21.516.521.220.19.518.1大豆大豆稻米稻米菠菜菠菜苹果苹果黄瓜黄瓜牛乳牛乳36.38.52.40.40.83.5第五页，讲稿共五十一页哦l测定意义：测定意义：评价食品的营养价值。评价食品的营养价值。为合理开发利用食物资源，提高产品质量，优为合理开发利用食物资源，提高产品质量，优化食品配方及生产过程控制提供依据。化食品配方及生产过程控制提供依据。第六页，讲稿共五十一页哦其中：其中：凯氏定氮法凯氏定氮法最常用的，国内外应用普遍。最常用的，国内外应用普遍。双双缩缩脲脲反反应应、染染料料结结合合反反应应、酚酚试试剂剂法法等等多多用用于于生

4、生产产单单位位质量控制分析。质量控制分析。国外：红外分析仪国外：红外分析仪在一般的常规检验中多进行氨基酸总量的测定，通常采用酸碱滴在一般的常规检验中多进行氨基酸总量的测定，通常采用酸碱滴定法来完成。定法来完成。各种氨基酸的分离与定量各种氨基酸的分离与定量色谱技术。色谱技术。有多种氨基酸分析仪。有多种氨基酸分析仪。l蛋白质的测定方法：蛋白质的测定方法：分两大类分两大类一类是利用蛋白质的共性即含氮量、肽键和折射率等测定蛋一类是利用蛋白质的共性即含氮量、肽键和折射率等测定蛋白质含量；白质含量；另一类是利用蛋白质中的氨基酸残基（酸性和碱性基团、芳另一类是利用蛋白质中的氨基酸残基（酸性和碱性基团、芳香基

5、团等）测定蛋白质含量。香基团等）测定蛋白质含量。第七页，讲稿共五十一页哦第二节第二节蛋白质的定性测定蛋白质的定性测定（自学）（自学）一、蛋白质的一般显色反应一、蛋白质的一般显色反应电电泳泳或或纸纸层层析析之之后后用用一一些些染染料料与与蛋蛋白白质质结结合合并并变变色。书中列举了色。书中列举了5种染料。种染料。二、复合蛋白质的显色反应二、复合蛋白质的显色反应（一）糖蛋白的显色（一）糖蛋白的显色（3种方法）种方法）（二）脂蛋白的显色（二）脂蛋白的显色（2种方法）种方法）第八页，讲稿共五十一页哦测定总氮量测定总氮量 N%F=粗蛋白质含量粗蛋白质含量%因为：样品中除蛋白氮外，可能还包括有非蛋白质因为：

6、样品中除蛋白氮外，可能还包括有非蛋白质含氮化合物，如核酸、含氮碳水化合物、生物碱、含氮化合物，如核酸、含氮碳水化合物、生物碱、含氮类脂、卟啉和含氮色素等。含氮类脂、卟啉和含氮色素等。第三节第三节蛋白质的定量测定蛋白质的定量测定！第九页，讲稿共五十一页哦一、一、凯氏定氮法凯氏定氮法 由由Kieldhl于于1833年提出，现发展为常量、微量、年提出，现发展为常量、微量、自动定氮仪法，半微量法及改良凯氏法。自动定氮仪法，半微量法及改良凯氏法。改良：改良：氮的完全氨化，缩短时间，简化操作。氮的完全氨化，缩短时间，简化操作。主要改良催化剂及消化主要改良催化剂及消化蒸馏蒸馏装置。装置。第十页，讲稿共五十一

7、页哦（一）常量凯氏定氮法（一）常量凯氏定氮法原理原理样样品品与与浓浓硫硫酸酸和和催催化化剂剂一一同同加加热热消消化化，使使蛋蛋白白质质分分解解，其其中中碳碳和和氢氢被被氧氧化化为为二二氧氧化化碳碳和和水水逸逸出出，而而样样品品中中的的有有机机氮氮转转化化为为氨氨与与硫硫酸结合成硫酸铵。然后加碱蒸馏，使氨蒸出。酸结合成硫酸铵。然后加碱蒸馏，使氨蒸出。用用H3BO3吸吸收收后后再再以以标标准准HCl滴滴定定或或H2SO4溶溶液液滴滴定定。根根据据标准酸消耗量可以计算出蛋白质的含量。标准酸消耗量可以计算出蛋白质的含量。也也可可以以用用过过量量的的标标准准H2SO4或或标标准准HCl溶溶液液吸吸收收后

8、后再再以以标标准准NaOH滴定过量的酸。滴定过量的酸。为什么？第十一页，讲稿共五十一页哦催化剂催化剂煮沸煮沸1、消化：、消化：NCOC+浓浓H2SO4（NH4）2SO4+CO2+SO2+H2O2、蒸馏与吸收：、蒸馏与吸收：2NaOH+（NH4）2SO42NH3+Na2SO4+2H2O 2NH 2NH3 3+4H+4H3 3BOBO3 3 （NHNH4 4）2 2B B4 4O O7 7+5H+5H2 2O O 3 3、滴定：（、滴定：（NHNH4 4）2 2B B4 4O O7 7+5H+5H2 2O+2HCl 2NHO+2HCl 2NH4 4Cl+4HCl+4H3 3BOBO3 3 (注注:

9、NCOC,Nitrogen containing organic compounds):NCOC,Nitrogen containing organic compounds)凯氏定氮法原理（方程式）凯氏定氮法原理（方程式）整个过程分三步：消化、蒸馏与吸收、滴定整个过程分三步：消化、蒸馏与吸收、滴定第十二页，讲稿共五十一页哦1.消化消化加硫酸钾加硫酸钾作为增温剂，提高溶液沸点，作为增温剂，提高溶液沸点，纯硫酸沸点纯硫酸沸点340，加入硫酸钾之后可以提高，加入硫酸钾之后可以提高至至400以上。也可加入硫酸钠，氯化钾等提以上。也可加入硫酸钠，氯化钾等提高沸点，但效果不如硫酸钾。高沸点，但效果不如硫酸

10、钾。要防止暴沸要防止暴沸第十三页，讲稿共五十一页哦加硫酸铜加硫酸铜作为催化剂。还可以作消化终点指示剂、作为催化剂。还可以作消化终点指示剂、蒸馏时碱性指示剂。还可以加氧化汞、汞（均有毒，蒸馏时碱性指示剂。还可以加氧化汞、汞（均有毒，价格贵）、硒粉、二氧化钛。价格贵）、硒粉、二氧化钛。加氧化剂加氧化剂如双氧水、次氯酸钾等加速有机如双氧水、次氯酸钾等加速有机物氧化速度。物氧化速度。第十四页，讲稿共五十一页哦凯氏定氮法注意事项凯氏定氮法注意事项图：常量凯氏定氮消化及蒸馏装置图：常量凯氏定氮消化及蒸馏装置 a a消化装置消化装置 b b蒸馏吸收装置蒸馏吸收装置1 1、硫酸钾、硫酸钾 及及硫酸铜的作用硫酸

11、铜的作用2 2、火候控制、火候控制3 3、装置的气密、装置的气密性性4 4、何时加碱、何时加碱5 5、难消化的、难消化的 对对策策6 6、停止蒸馏、停止蒸馏第十五页，讲稿共五十一页哦自动回流消化蒸馏仪自动回流消化蒸馏仪第十六页，讲稿共五十一页哦2.蒸馏与吸收蒸馏与吸收消化液消化液+40%氢氧化钠加氢氧化钠加热蒸馏，放出氨气。热蒸馏，放出氨气。“以以奈氏试剂奈氏试剂”检查。检查。同时用同时用4%硼酸吸收硼酸吸收Nessler试剂，试剂，K2（HgI4）检验检验NH4+离子，析出黄色或红棕离子，析出黄色或红棕色沉淀。色沉淀。第十七页，讲稿共五十一页哦3.滴定滴定用用HCl滴定滴定用混合指示剂（甲基

12、红用混合指示剂（甲基红+溴甲酚绿或亚甲基兰溴甲酚绿或亚甲基兰+甲基红）甲基红）终点：蓝色终点：蓝色微红色微红色计算：计算：F要根据样品来源定要根据样品来源定 3学时第十八页，讲稿共五十一页哦说明及注意：说明及注意：本本法法可可应应用用于于各各类类食食品品中中蛋蛋白白质质含含量量测测定定（粗粗蛋蛋白白质）质）。结果准确，但费时。结果准确，但费时。所用试剂溶液应用无氨蒸馏水配制。所用试剂溶液应用无氨蒸馏水配制。同时作一空白试验，从消化开始到滴定同时作一空白试验，从消化开始到滴定。消消化化时时不不要要用用强强火火，应应保保持持和和缓缓沸沸腾腾，以以免免粘粘贴贴在在凯凯氏氏瓶瓶内内壁壁上上的的含含氮氮

13、化化合合物物在在无无硫硫酸酸存存在在的的情情况况下下消消化化不完全而造成氮损失。不完全而造成氮损失。第十九页，讲稿共五十一页哦消化时应注意不时转动凯氏烧瓶，以便利用冷消化时应注意不时转动凯氏烧瓶，以便利用冷凝酸液将附在瓶壁上的固体残渣洗下，并促进其消凝酸液将附在瓶壁上的固体残渣洗下，并促进其消化完全。化完全。样品中若含脂肪或糖较多时，消化过程中易产生大样品中若含脂肪或糖较多时，消化过程中易产生大量泡沫，为防止泡沫溢出瓶外，在开始消化时应用量泡沫，为防止泡沫溢出瓶外，在开始消化时应用小火加热，并时时摇动；或者加入少量辛醇或液体小火加热，并时时摇动；或者加入少量辛醇或液体石蜡或硅油消泡剂，并同时注

14、意控制热源强度。石蜡或硅油消泡剂，并同时注意控制热源强度。当样品消化液不易澄清透明时，可将凯氏烧瓶冷却，当样品消化液不易澄清透明时，可将凯氏烧瓶冷却，加入加入30过氧化氢过氧化氢23m1后再继续加热消化后再继续加热消化。第二十页，讲稿共五十一页哦般消化至呈透明后，继续消化般消化至呈透明后，继续消化30分钟即可，但对于含有特别难分钟即可，但对于含有特别难以氨化的氮化合物的样品，如含赖氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸以氨化的氮化合物的样品，如含赖氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸等时，需适当延长消化时间（如大豆粉）。有机物如分解完全，消等时，需适当延长消化时间（如大豆粉）。有机物如分解完全，消化液呈蓝色或浅

15、绿色，但含铁量多时，呈较深绿色。化液呈蓝色或浅绿色，但含铁量多时，呈较深绿色。蒸馏装置不能漏气。蒸馏时，加热火力要稳定，否则将发生倒吸蒸馏装置不能漏气。蒸馏时，加热火力要稳定，否则将发生倒吸现象。现象。(NH4)2SO4 检验第二十一页，讲稿共五十一页哦蒸馏前加蒸馏前加NaOH要足量，溶液应变为深蓝色或黑褐要足量，溶液应变为深蓝色或黑褐色色（Cu（OH）2、CuO、铜氨离子），如颜色不变可、铜氨离子），如颜色不变可能碱不够能碱不够。蒸馏完毕后，应先将冷凝管下端提离液面清洗管蒸馏完毕后，应先将冷凝管下端提离液面清洗管口，再蒸口，再蒸1分钟后关掉热源否则可能造成吸收液倒分钟后关掉热源否则可能造成吸

16、收液倒吸。吸。H3BO3吸收液的温度不应超过吸收液的温度不应超过40，否则对，否则对NH3的的吸收作用减弱而造成损失。吸收作用减弱而造成损失。第二十二页，讲稿共五十一页哦（二）微量凯氏定氮法（二）微量凯氏定氮法1、原理、步骤及适用范围同前、原理、步骤及适用范围同前2、与常量法不同点：、与常量法不同点：样品量、试剂用量样品量、试剂用量减少减少加入硼酸量加入硼酸量由由50ml10ml,滴定用盐酸浓度由滴定用盐酸浓度由0.1mol/L0.01mol/L,可用微量滴定管。可用微量滴定管。3、蒸馏装置见下图、蒸馏装置见下图。第二十三页，讲稿共五十一页哦保持酸保持酸性性第二十四页，讲稿共五十一页哦第二十五

17、页，讲稿共五十一页哦改良式微量凯氏改良式微量凯氏定氮装置定氮装置 第二十六页，讲稿共五十一页哦（三）自动凯氏定氮法（三）自动凯氏定氮法1 1、原理及适用范围同前原理及适用范围同前 2 2、特点：特点：（1）消化装置用优质玻璃制成的凯氏消化瓶，红外）消化装置用优质玻璃制成的凯氏消化瓶，红外线加热的消化炉。线加热的消化炉。（2）快速：一次可同时消化）快速：一次可同时消化8个样品，个样品，30分钟可消化完分钟可消化完毕。毕。（3）自动：自动加碱蒸馏，自动吸收和滴定，自动数）自动：自动加碱蒸馏，自动吸收和滴定，自动数字显示装置。可计算总氮百分含量并记录，字显示装置。可计算总氮百分含量并记录，12分钟完

18、分钟完成成1个样。个样。第二十七页，讲稿共五十一页哦如何测定蛋白氮？如何测定蛋白氮？先把非蛋白质的含氮物与蛋白质分开。一般多采用先把非蛋白质的含氮物与蛋白质分开。一般多采用沉淀剂（沉淀剂（CuSO4+NaOH，或三氯乙酸，或三氯乙酸），将蛋白质），将蛋白质沉淀析出，经过过滤（或离心分离），将沉淀物再沉淀析出，经过过滤（或离心分离），将沉淀物再用凯氏法测定含用凯氏法测定含N量。量。马铃薯含非蛋白氮多。马铃薯含非蛋白氮多。乳中非蛋白氮的测定？乳中非蛋白氮的测定？第二十八页，讲稿共五十一页哦二、双缩脲法二、双缩脲法传传统统的的凯凯氏氏定定氮氮法法应应用用范范围围广广，灵灵敏敏度度高高、准准确确，不不

19、要要大大仪仪器器，但费时间，有环境污染。但费时间，有环境污染。快速方法：快速方法：双缩脲法双缩脲法 紫外分光光度法紫外分光光度法 染料结合法染料结合法 水杨酸比色法水杨酸比色法 红外光谱法红外光谱法 考马斯亮蓝染料比色法考马斯亮蓝染料比色法 样品消化转化为铵盐后，样品消化转化为铵盐后，在一定条件下与水杨酸在一定条件下与水杨酸钠和次氯酸钠生成蓝色钠和次氯酸钠生成蓝色化合物，化合物，660nm660nm比色。比色。在酸性溶液中与蛋在酸性溶液中与蛋白质结合染色，白质结合染色，620nm620nm吸收。快、灵吸收。快、灵敏，干扰较少。敏，干扰较少。第二十九页，讲稿共五十一页哦1.原理原理脲脲（尿尿素素

20、）NH2CONH2加加热热至至150160时时，两两分分子子缩缩合合成双缩脲。成双缩脲。双双缩缩脲脲能能和和硫硫酸酸铜铜的的碱碱性性溶溶液液生生成成紫紫红红色色络络合合物物，这这种种反反应应叫叫双缩脲反应双缩脲反应。蛋蛋白白质质分分子子中中含含有有肽肽键键CONH，与与双双缩缩脲脲结结构构相相似似。在在同同样样条条件件下下也也有有呈呈色色反反应应，在在一一定定条条件件下下，其其颜颜色色深深浅浅与与蛋蛋白白质质含含量量成成正正比比，可可用用分分光光光光度度计计来来测测其其吸吸光光度度，确确定定含含量量。（560nm）NH2CONHCONH2+NH3NH2CONH2+NH2CONH2第三十页，讲稿

21、共五十一页哦配合物：双缩脲铜钠氢氧化物配合物：双缩脲铜钠氢氧化物第三十一页，讲稿共五十一页哦注：测蛋白质时叫双缩脲法，并不另加双缩脲。注：测蛋白质时叫双缩脲法，并不另加双缩脲。样样品不用消化品不用消化可直接用粉样，振荡、显色后离心。可直接用粉样，振荡、显色后离心。2.方法特点及应用范围方法特点及应用范围本本法法灵灵敏敏度度较较低低，但但操操作作简简单单快快速速，故故在在生生物物化化学学领领域域中中常常用用。本本法法亦亦适适用用于于豆豆类类、油油料料、米米谷谷等等作物种子及肉类等样品测定。作物种子及肉类等样品测定。3.主要仪器：主要仪器：分光光度计，离心机分光光度计，离心机4.试剂：试剂：(1)

22、碱性硫酸铜溶液碱性硫酸铜溶液(2)四氯化碳四氯化碳第三十二页，讲稿共五十一页哦5操作方法：采用凯氏法测出的蛋白质样品为标准操作方法：采用凯氏法测出的蛋白质样品为标准样绘标准曲线样绘标准曲线。三紫外吸收法三紫外吸收法 1 1原理：利用蛋白质的特有基团，原理：利用蛋白质的特有基团，R R（NHCHCO NHCHCO）对紫外光有吸收作用，在对紫外光有吸收作用，在280 nm280 nm下，吸光度与蛋白下，吸光度与蛋白质浓度成直线关系，求含量。质浓度成直线关系，求含量。第三十三页，讲稿共五十一页哦2 2适用范围：常用于生物化学工作，因为干扰因素多，故在食适用范围：常用于生物化学工作，因为干扰因素多，故

23、在食品分析领域应用不广泛。品分析领域应用不广泛。3 3主要仪器：主要仪器：紫外分光光度计紫外分光光度计 离心机（离心机（3000 3000 5000 r/min5000 r/min）4 4操作：用凯氏法测得结果的同类样品作标样做标准曲线。操作：用凯氏法测得结果的同类样品作标样做标准曲线。测牛乳测牛乳 冰醋酸冰醋酸第三十四页，讲稿共五十一页哦第五节第五节 氨基酸的定性测定（自学）氨基酸的定性测定（自学）利用各种显色反应（利用各种显色反应（134138页）页）第三十五页，讲稿共五十一页哦一、氨基酸的一般显色反应一、氨基酸的一般显色反应茚三酮法、吲哚醌法和邻苯二甲醛法。前二种是经典的常用茚三酮法、吲

24、哚醌法和邻苯二甲醛法。前二种是经典的常用显色法，后一种是近年来发展起来的荧光显色法。显色法，后一种是近年来发展起来的荧光显色法。1.1.茚三酮法茚三酮法氨基酸或蛋白质能与茚三酮作用，生成蓝紫色化合物。氨基酸或蛋白质能与茚三酮作用，生成蓝紫色化合物。2 2.吲哚醌法吲哚醌法各种氨基酸与吲哚醌试剂能显示不同颜色，因此可借此辩认氨各种氨基酸与吲哚醌试剂能显示不同颜色，因此可借此辩认氨基酸。基酸。3 3.邻苯二甲醛法（最灵敏）邻苯二甲醛法（最灵敏）邻苯二甲醛在邻苯二甲醛在2-巯基乙醇存在下，在碱性溶液中与氨基酸作用巯基乙醇存在下，在碱性溶液中与氨基酸作用产生荧光化合物，最适的激发光和发射光波长分别为产

25、生荧光化合物，最适的激发光和发射光波长分别为340nm和和455nm。在手提式紫外灯。在手提式紫外灯(254/365)下观察。下观察。各种氨基酸显现的荧光强度不同。各种氨基酸显现的荧光强度不同。第三十六页，讲稿共五十一页哦二、个别氨基酸的显色反应二、个别氨基酸的显色反应利用个别氨基酸与某些试剂具有特殊的显色反应定性氨基酸。可应用于纸层析和利用个别氨基酸与某些试剂具有特殊的显色反应定性氨基酸。可应用于纸层析和纸电泳显色。纸电泳显色。精氨酸，胱氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丝氨酸和羟赖氨酸、羟脯氨酸精氨酸，胱氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丝氨酸和羟赖氨酸、羟脯氨酸,色色氨酸、酪氨酸、酪氨酸和组

26、氨酸。氨酸、酪氨酸、酪氨酸和组氨酸。第三十七页，讲稿共五十一页哦第六节第六节 氨基酸定量测定氨基酸定量测定一氨基酸的一般定量测定一氨基酸的一般定量测定（一）甲醛滴定法（一）甲醛滴定法 1.1.原理：原理：氨基酸本身有碱性氨基酸本身有碱性 NHNH2 2 基，又有基，又有 酸性酸性COOHCOOH基，成中性内盐，加入甲醛溶液后，与基，成中性内盐，加入甲醛溶液后，与NHNH2 2结合，碱性消失，再用强碱来滴定结合，碱性消失，再用强碱来滴定COOHCOOH基。基。（有多种写法）（有多种写法）第三十八页，讲稿共五十一页哦2 2、测定、测定 适量样品于适量样品于100ml100ml容量瓶中（含氨基酸约容

27、量瓶中（含氨基酸约20mg20mg）水定容水定容 取取20.0ml20.0ml于烧杯中，加于烧杯中，加60ml60ml水水 用用0.05mol/LNaOH0.05mol/LNaOH滴至滴至pH8.2pH8.2（此体积可供计算总酸含量）（此体积可供计算总酸含量）加加10.0ml10.0ml中性甲醛中性甲醛 NaOHNaOH滴滴至至pH 9.2pH 9.2，记录消耗体积，记录消耗体积V V1 1。空白试验：空白试验：80ml80ml水水 NaOHNaOH调至调至pH8.2 pH8.2 加加10.0ml10.0ml中性甲醛中性甲醛 NaOHNaOH滴至滴至pH9.2pH9.2，耗，耗V V0 0ml

28、ml。用酸度计电极的选择？第三十九页，讲稿共五十一页哦3、说明、说明本法准确快速，可用于各类样品游离氨基酸含量测本法准确快速，可用于各类样品游离氨基酸含量测定。定。固样先粉碎，称量后用水萃取约半小时（固样先粉碎，称量后用水萃取约半小时（50水水浴）。浴）。铵盐的存在使结果偏高，因其也与甲醛作用产生铵盐的存在使结果偏高，因其也与甲醛作用产生酸。酸。也可用指示剂指示终点（中性红、百里酚酞），但准也可用指示剂指示终点（中性红、百里酚酞），但准确度稍差，对深色样品要用活性炭脱色，但芳香族氨基确度稍差，对深色样品要用活性炭脱色，但芳香族氨基酸易被吸附。酸易被吸附。第四十页，讲稿共五十一页哦同时取两份样：

29、同时取两份样：+中性红指示剂，用氢氧化钠直接滴，中和样液中性红指示剂，用氢氧化钠直接滴，中和样液中其它酸性物质。中其它酸性物质。pH6.8pH6.88.08.0 +百里酚酞百里酚酞+中性甲醛中性甲醛+NaOH+NaOH 滴，中和了滴，中和了 样液中氨基酸的羧基与其它酸性物质的总和。样液中氨基酸的羧基与其它酸性物质的总和。pH9.4pH9.410.6(10.6(淡蓝色淡蓝色)二者之差可计算氨基酸含量。二者之差可计算氨基酸含量。第四十一页，讲稿共五十一页哦（二）茚三酮比色法（二）茚三酮比色法1、原理：、原理：氨基酸在碱性溶液中能与茚三酮作用，氨基酸在碱性溶液中能与茚三酮作用，生成蓝紫色化合物（脯氨

30、酸反应成黄色），可用吸生成蓝紫色化合物（脯氨酸反应成黄色），可用吸光光度法测定，光光度法测定，=570nm。2 2、测定：样品、测定：样品 水提取氨基酸，活性炭脱色（水提取氨基酸，活性炭脱色（），过滤），过滤 分取澄清液于分取澄清液于25ml25ml比色管中比色管中 加茚三酮，加茚三酮，pH8.04pH8.04磷酸盐缓磷酸盐缓冲液冲液 水浴加热水浴加热15min 15min 迅速冷却，水定容迅速冷却，水定容 静置静置15min 15min 测测A A570570，空白为参比。同时作标准曲线，氨基酸标液用某，空白为参比。同时作标准曲线，氨基酸标液用某一干燥的氨基酸如异亮氨酸配制。一干燥的氨基酸如

31、异亮氨酸配制。3 3、结果：氨基酸含量（、结果：氨基酸含量（mg/100gmg/100g）以所用标准氨基酸计）以所用标准氨基酸计 第四十二页，讲稿共五十一页哦二个别氨基酸的定量测定二个别氨基酸的定量测定介绍了介绍了8种氨基酸的定量测定方法种氨基酸的定量测定方法见见P147155第四十三页，讲稿共五十一页哦第七节第七节 氨基酸的分离与测定氨基酸的分离与测定 一薄层色谱法（一薄层色谱法（TLCTLC法）法）Thin Layer ChromatographyThin Layer Chromatography简介：简介：一种微量而快速的层析方法，它把吸附剂或支持一种微量而快速的层析方法，它把吸附剂或支

32、持剂均匀的铺在玻璃板上成一薄层，把样品点在薄层上，剂均匀的铺在玻璃板上成一薄层，把样品点在薄层上，然后用合适的溶剂展开，从而达到分离、鉴定和定量然后用合适的溶剂展开，从而达到分离、鉴定和定量的目的。因为层析在薄层上进行，所以称为薄层层析。的目的。因为层析在薄层上进行，所以称为薄层层析。它的应用范围比纸上层析更广泛，常用来分析氨基酸、它的应用范围比纸上层析更广泛，常用来分析氨基酸、农药残留量、黄曲霉毒素等。农药残留量、黄曲霉毒素等。第四十四页，讲稿共五十一页哦（一）原理：（一）原理：取一定量经水解的样品溶液，滴在制好的薄层板取一定量经水解的样品溶液，滴在制好的薄层板上，在溶剂系统中进行双向上行法

33、展开，样品各组分上，在溶剂系统中进行双向上行法展开，样品各组分在薄层板上经过多次的被吸附、解吸、交换等作用，在薄层板上经过多次的被吸附、解吸、交换等作用，同一物质具有相同的同一物质具有相同的R Rf f值，不同成分则有不同的值，不同成分则有不同的R Rf f值，值，因而各种氨基酸可达到彼此分离的目的。然后用茚三酮显因而各种氨基酸可达到彼此分离的目的。然后用茚三酮显色，与标准氨基酸进行对比，鉴别氨基酸种类，从显色斑色，与标准氨基酸进行对比，鉴别氨基酸种类，从显色斑点颜色的深浅可以大致确定其含量。点颜色的深浅可以大致确定其含量。第四十五页，讲稿共五十一页哦R Rf f=a/b=a/bab样点样点溶

34、剂前沿溶剂前沿点样原点点样原点第四十六页，讲稿共五十一页哦l优点：优点：展开时间短，一般在展开时间短，一般在20302030分钟，展开距离通常只需分钟，展开距离通常只需10 cm10 cm，且分离效果好。且分离效果好。层析后得到的斑点小而清晰。层析后得到的斑点小而清晰。能够使用多种显色剂。能够使用多种显色剂。点样量少，灵敏度高。（比纸层析高点样量少，灵敏度高。（比纸层析高1010010100倍）倍）精确到精确到0.01ug0.01ug。也可用于大量分离也可用于大量分离500 mg500 mg，作为样品制备层析。，作为样品制备层析。l缺点：缺点：R Rf f值重现性比纸层析差。值重现性比纸层析差

35、。TLC法与其他方法比较：简便快速、灵敏度高，成本低，应用法与其他方法比较：简便快速、灵敏度高，成本低，应用广泛。广泛。第四十七页，讲稿共五十一页哦（三）操作步骤（三）操作步骤 薄层板制备薄层板制备 样品液制备样品液制备 点样点样 展开展开 显色显色定定性性：在在同同一一块块板板上上，同同等等条条件件下下操操作作，被被测测样样与与标标准准样样同同时时展展开开、显色，同显色，同 R Rf f 值即是；值即是；查手册找相同的查手册找相同的 R Rf f 值。值。定定量量：a.a.目目视视定定量量法法：以以标标准准斑斑点点对对照照，相相当当于于样样品品斑斑点点中中含含量量ugug数。数。b.b.斑点

36、面积定量法。斑点面积定量法。c.c.将样点取下来，定容，离心，比色。将样点取下来，定容，离心，比色。d.d.利用薄层色谱扫描仪。利用薄层色谱扫描仪。第四十八页，讲稿共五十一页哦二氨基酸自动分析仪法二氨基酸自动分析仪法原原理理：利利用用各各种种氨氨基基酸酸的的酸酸碱碱性性、极极性性和和分分子子量量大大小小不不同同等等性性质质，使使用用阳阳离离子子交交换换树树脂脂在在色色谱谱柱柱上上进进行行分分离离。采采用用不不同同的的pH值值和和离离子子浓浓度度的的缓缓冲冲溶溶液液即即可可将将它它们们依依次洗脱下来，洗脱下来的氨基酸可用茚三酮显色，从而定量各种氨基酸。次洗脱下来，洗脱下来的氨基酸可用茚三酮显色，从而定量各种氨基酸。三气相色谱法三气相色谱法衍衍生生三三氟氟乙乙酰酰基基正正丁丁酯酯。它它包包括括用用正正丁丁醇醇的的酯酯化化和和用用三三氟氟乙乙酸酸酐酐(TFAA)的的酰化两个步骤。酰化两个步骤。四高效液相色谱法四高效液相色谱法柱前衍生，柱前衍生，用紫外吸收检测器或荧光检测器。用紫外吸收检测器或荧光检测器。第四十九页，讲稿共五十一页哦第五十页，讲稿共五十一页哦感感谢谢大大家家观观看看第五十一页，讲稿共五十一页哦