高效液相色谱法改动.ppt

《高效液相色谱法改动.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《高效液相色谱法改动.ppt（79页珍藏版）》请在淘文阁 - 分享文档赚钱的网站上搜索。

1、高效液相色谱法改动现在学习的是第1页，共79页20.1 概述20.2 高效液相色谱法的分类与基本原理 20.2.1 高效液相色谱法的分类 20.2.2 基本原理20.3 各类高效液相色谱法 20.3.1 液固吸附色谱法 20.3.2 液液分配色谱法 20.3.3 化学键合相色谱法 20.3.4 其他色谱法现在学习的是第2页，共79页20.4 固定相 20.4.1 液固色谱固定相 20.4.2 化学键合相 20.4.3 其他固定相20.5 流动相（溶剂系统）20.5.1 分离方程式 20.5.2 Snyder溶剂分类 20.5.3 正相洗脱与反相洗脱 20.5.4 洗脱方式现在学习的是第3页，共

2、79页 20.5.5 流动相最优化方法简介20.6 高效液相色谱仪 20.6.1 输液泵 20.6.2 色谱柱与进样器 20.6.3 检测器 20.6.4 超高效液相色谱仪20.7 定性、定量分析方法 20.7.1 定性分析方法 20.7.2 定量分析方法现在学习的是第4页，共79页高效液相色谱法概述现在学习的是第5页，共79页 高效液相色谱法 HPLC （high performance liquid chromatograph）高压输液泵 高效固定相 高灵敏度检测器现在学习的是第6页，共79页高效液相色谱法与经典液相色谱法的比较 见表现在学习的是第7页，共79页现在学习的是第8页，共79页

3、现在学习的是第9页，共79页高效液相色谱法与GC的比较 见表现在学习的是第10页，共79页现在学习的是第11页，共79页现在学习的是第12页，共79页 高效液相色谱法的 分类与基本原理现在学习的是第13页，共79页20.2.1 高效液相色谱法的分类按固定相的聚集状态：LLC和LSC按分离机制：分配、吸附、离子交换（IEC）、空间排阻（SEC）、亲合（AC）、手性（CC）、胶束（MC）、电色谱法（EC）。现在学习的是第14页，共79页HPLCLSCLLCNLLC和RLLCBPC（狭）RBPCNBPCISC一般RBPCPICIEC一般IECICAA（氨基酸分析法）SECGPC和GFCAC（亲和）M

4、C（胶束）CC（手性）现在学习的是第15页，共79页20.2.2 高效液相色谱法的基本原理HPLC的范氏方程：现在学习的是第16页，共79页讨论：涡流扩散项：填料和填充均匀程度高效液相色谱柱的装填现在学习的是第17页，共79页纵向扩散项现在学习的是第18页，共79页传质阻力项现在学习的是第19页，共79页温度一般为室温 选甲醇、乙腈粘度小的溶剂粒径现在学习的是第20页，共79页综上所述，HPLC应采用：1)采用小粒径、窄粒度分布的球形固定相，首选化学键合相，用均浆法装柱；2）采用低粘度流动相，低流速（1ml/min)；3）柱温一般以2535度为宜。太低，则流动相的粘度增加，温度高易产生气泡。现

5、在学习的是第21页，共79页流速分析型HPLC一般流量为1mL/min。现在学习的是第22页，共79页各类高效液相色谱法现在学习的是第23页，共79页20.3.1 液固吸附色谱法分离机理 溶质分子与流动相分子竞争吸附吸附剂表面吸附活性中心，靠溶质分子的分配系数（容量因子）不同而分离。影响容量因子的因素 溶质分子的极性 溶剂的极性 硅胶的活性现在学习的是第24页，共79页若以硅胶为固定相：洗脱剂：以烷烃为底剂，加适量极性调整剂组成的二元或三元流动相。流动相应该不含水。现在学习的是第25页，共79页20.3.2 液液分配色谱法分离机理 靠样品组分溶入固定相与流动相达到“平衡”后分配系数的差别而分离

6、。正、反相液液色谱法 注意流出顺序。目前，物理涂渍的液液色谱几乎已被化学键合相所取代。现在学习的是第26页，共79页20.3.3 化学键合相色谱法 将固定液的官能团键合在载体表面，就构成化学键合相。以化学键合相为固定相的色谱法称为化学键合相色谱法，简称键合相色谱法（bonded phase chromatograph，BPC）现在学习的是第27页，共79页化学键合相的优点 均一、稳定；不易流失，使用周期长；柱效高；重现性好。现在学习的是第28页，共79页反相键合相色谱法（RBPC或RHPLC）固定相：在载体表面键合含弱极性或中等极性的基团，如十八烷基硅烷（C18）（ODS柱）、辛烷基（C8）、

7、甲基（CH3）、苯基等。现在学习的是第29页，共79页流动相：以水做主体，加适量的极性调节剂增加选择性如甲醇、乙腈、四氢呋喃等。出峰顺序：极性强的组分先出柱，极性弱的组分后出柱。分析对象：分离非极性至中等极性的各种分子型化合物。现在学习的是第30页，共79页影响保留时间的因素：溶质的分子结构：极性越弱，保留时间越长。流动相的表面张力、介电常数和pH值：对于二元或多元体系改变溶剂的配比可改变流动相的表面张力和介电常数。通常，流动相中有机溶剂含量增加，k变小。例如：在水甲醇体系中增加甲醇的量，可降低表面力和介电常数，使容量因子变小。现在学习的是第31页，共79页正相键合相色谱法 固定相：在载体表面

8、键合含中等极性或较强极性的基团，如氰基（CN）、氨基（NH3）、或二羟基等。流动相：以非极性或弱极性的溶剂如己烷、庚烷等为主体，加适量的极性调节剂增加选择性如乙醚、氯仿、二氯甲烷等。现在学习的是第32页，共79页出峰顺序：极性弱的组分先出柱，极性强的组分后出柱。影响保留时间的因素：键合相的种类、流动相的强度、试样的性质。流动相的极性增强，洗脱能力增加，保留时间缩短。现在学习的是第33页，共79页适应范围：分离溶于有机溶剂的极性至中等极性的分子型化合物。现在学习的是第34页，共79页反相离子对色谱法（RPIC）现在学习的是第35页，共79页写成通式：现在学习的是第36页，共79页表：反相离子对色

9、谱的离子对试剂序号反离子种类主要应用对象1季铵盐（如四丁基铵磷酸盐TBA、溴化十六烷基三甲基铵（CTAB）强酸、弱酸、磺酸染料、羧酸、氢化可的松及其盐2叔铵（如三辛铵）磺酸盐、羧酸等3烷基磺酸盐（如甲基、戊基、己基、庚基、樟脑磺酸盐）强碱、弱碱、儿茶酚胺、鸦片碱等4高氯酸胺5烷基磺酸盐（如十二烷基磺酸盐、正庚烷基磺酸钠（PICB7)与3类似，选择性不同现在学习的是第37页，共79页离子对色谱法的适用对象：用于有机酸、碱、盐的分离，以及用离子交换色谱法无法分离的离子型和非离子型化合物的混合物的分离。现在学习的是第38页，共79页离子抑制色谱法 （ion suppression chromatog

10、raph，ISC）在反相色谱法中，通过向流动相加入少量弱酸（常用乙酸）、弱碱（常用氨水）或缓冲盐（常用磷酸盐及乙酸盐）来调节流动相的pH，抑制样品组分的离解，增加它在固定相中的溶解度，以达到分离有机弱酸、弱碱的目的，这种技术称为离子抑制色谱法。现在学习的是第39页，共79页调节pH范围：27.5 pH8.0 破坏键合相与载体的结合 pH8）不稳定；在孔隙中大分子扩散困难，降低柱效；硅胶表面上的剩余硅羟基对分离有影响。目前研制的基质有：氧化铝、氧化锆、氧化钍和氧化钛。现在学习的是第50页，共79页主要掌握正相和反相键合相：键合的基团的极性及适用情况。现在学习的是第51页，共79页表：反相HPLC

11、常用的化学键合相类型牌号名称官能团粒度/m形状说明长链YWG-C18H37C18硅烷10非球形Partisil ODSC18硅烷5，10非球形5CZprbax ODSC18硅烷6球形15C短链LiChrosorb RP-8C8硅烷5，10非球形1314CYWG C6H6苯基硅烷10非球形7CLiChrosorb RP-2二甲基硅烷 5，10非球形5C现在学习的是第52页，共79页键合相的性质和特点 含碳量：指键合在硅胶表面上的烷基所含碳的质量分数，随链长增长，从322。覆盖度：指硅胶被键合后，在硅胶中的有效羟基与硅烷试剂反应的程度，在键合后有时还用短链的硅烷试剂与剩余和新产生的羟基反应，使羟基

12、全部被”帽盖“（即封尾）而不起作用。现在学习的是第53页，共79页 键合相的特点：使用过程中不流失；化学稳定性好；适于梯度洗脱；载样量大。现在学习的是第54页，共79页流动相（溶剂系统）现在学习的是第55页，共79页HPLC对流动相的要求：不与固定相反应；对试样有适宜的溶解度，k在110之内，最好在25之间；与检测器相适应；纯度高，粘度小。使用前滤过，脱气。现在学习的是第56页，共79页20.5.1 分离方程式 讨论：主要受溶剂种类的影响；在溶剂组成确定后，k主要由溶剂的配比所左右。现在学习的是第57页，共79页20.5.2 Snyder溶剂分类 Snyder选择了3个参考物质，用于检验溶剂的

13、3种分子间作用力，分别用Xe、Xd、Xn表述。表：参考物与被检溶剂间的作用力参考物乙醇（质子给予体）二氧六环（质子受体）硝基甲烷（强偶极）被检溶剂的作用力类型质子受体作用力(Xe)质子给予体作用力(Xd)强偶极作用力(Xn)现在学习的是第58页，共79页 描述溶剂极性用Snyder提出的溶剂极性参数P来衡量。表：常用溶剂的极性参数和选择性参数溶剂PXeXdXn正戊烷0.0-乙醚2.80.530.130.34二氯甲烷3.10.290.180.53氯仿4.10.250.410.33甲醇5.10.480.220.31现在学习的是第59页，共79页 可将81种色谱溶剂，按Xe、Xd、Xn在三角形坐标图

14、上的相邻关系分为8类。选择不同组别的溶剂，分子作用力不同，容易使改变，利于分离。现在学习的是第60页，共79页20.5.3 正相洗脱与反相洗脱 溶剂洗脱强度指流动相中溶剂的洗脱能力,它不仅与流动相，而且与固定相的极性有关。在正相色谱中,“溶剂洗脱强度”与溶剂极性成正比；而在反相色谱中，溶剂极性越大,洗脱能力越小。现在学习的是第61页，共79页 反相键合相色谱法的溶剂强度用另一强度因子S表示。表：反相色谱常用溶剂的强度因子S水甲醇乙腈丙酮二噁烷乙醇异丙醇四氢呋喃03.03.23.43.53.64.24.5现在学习的是第62页，共79页混合液设计统计技术：根据溶剂选择性分组，选具有显著选择性差异的

15、溶剂。反相：水为底剂，甲醇、乙腈和四氢呋喃为选择性溶剂。正相：已烷或戊烷为底剂，乙醚、氯仿和二氯甲烷为选择性溶剂。现在学习的是第63页，共79页混合溶剂的强度现在学习的是第64页，共79页20.5.4 洗脱方式等度洗脱：在一个分析周期内流动相组成保持恒定，适合于组分数目较少、性质差别不大的试样。现在学习的是第65页，共79页梯度洗脱（程序洗脱）在一个分析周期内程序程序控制改变流动相的组成，如溶剂的极性、离子强度和pH值等，可使一个复杂样品中性质差异很大的组分，能在各自适宜的分离条件（容量因子k适宜）下分离。梯度洗脱能缩短分析时间、提高分离度、改善峰形、提高检测灵敏度。现在学习的是第66页，共7

16、9页高效液相色谱仪现在学习的是第67页，共79页总 图现在学习的是第68页，共79页现在学习的是第69页，共79页高压泵 主要部件之一，压力：150350105 Pa。应具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可调、耐腐蚀等特性现在学习的是第70页，共79页梯度淋洗装置 外梯度:利用两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按一定的比例送入梯度混合室，混合后进入色谱柱。内梯度:一台高压泵,通过比例调节阀,将两种或多种不同极性的溶剂按一定的比例抽入高压泵中混合。现在学习的是第71页，共79页现在学习的是第72页，共79页进样装置流路中为高压力工作状态，通常使用耐高压的六通阀进样装置，其结构如图所示：现在学习的是

17、第73页，共79页高效分离柱 柱体为直型不锈钢管，内径16 mm，柱长540 cm。发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。现在学习的是第74页，共79页液相色谱检测器 紫外检测器 应用最广，对大部分有机化合物有响应。特点：灵敏度高；线形范围高；流通池可做的很小（1mm 10mm，容积 8L）；对流动相的流速和温度变化不敏感；波长可选，易于操作；可用于梯度洗脱。（参照书P539：截止波长）现在学习的是第75页，共79页荧光检测器（FD）灵敏度比紫外检测器高，选择性好，但只能适合于能产生荧光的物质（或通过衍生化能产生荧光的物质）的检测。现在学习的是第76页，共79页电化学检测器：包括极谱、库仑、安培和电导检测器。安培检测器可检测具有氧化还原活性（能发生电极反应）的物质，灵敏度高。现在学习的是第77页，共79页蒸发光散射检测器（ELSD）：是通用型的检测器。它适合于检测挥发性低于流动相的组分，主要用于糖类、高级脂肪酸、磷脂、维生素、氨基酸、甘油三酯及甾体等的检测。但灵敏度较低。此外，流动相必须是挥发性的，不能含缓冲盐。现在学习的是第78页，共79页示差折光检测器 除紫外检测器之外应用最多的检测器；可连续检测参比池和样品池中流动相之间的折光指数差值。差值与浓度呈正比；通用型检测器（每种物质具有不同的折光指数）；灵敏度低、对温度敏感、不能用于梯度洗脱；现在学习的是第79页，共79页