第八章荧光分光光度法课件.ppt

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1、第八章荧光分光光度法第八章荧光分光光度法第1页，此课件共50页哦第八章第八章 荧光分光光度法荧光分光光度法n n分子荧光、磷光分析法的基本原理分子荧光、磷光分析法的基本原理分子荧光、磷光分析法的基本原理分子荧光、磷光分析法的基本原理 介绍荧光磷光光谱的产生、主要影响因素、荧光强介绍荧光磷光光谱的产生、主要影响因素、荧光强介绍荧光磷光光谱的产生、主要影响因素、荧光强介绍荧光磷光光谱的产生、主要影响因素、荧光强度与被测物质之间的关系度与被测物质之间的关系度与被测物质之间的关系度与被测物质之间的关系n n荧光分析仪器荧光分析仪器荧光分析仪器荧光分析仪器n n分子荧光定量分析分子荧光定量分析分子荧光定

2、量分析分子荧光定量分析第2页，此课件共50页哦 8-1 概述概述一、分子发光分析法及其分类一、分子发光分析法及其分类一、分子发光分析法及其分类一、分子发光分析法及其分类n n某些物质的分子吸收一定能量后，电子从基态跃迁到激发态，某些物质的分子吸收一定能量后，电子从基态跃迁到激发态，某些物质的分子吸收一定能量后，电子从基态跃迁到激发态，某些物质的分子吸收一定能量后，电子从基态跃迁到激发态，以光辐射的形式从激发态回到基态，这种现象称为分子发光，以光辐射的形式从激发态回到基态，这种现象称为分子发光，以光辐射的形式从激发态回到基态，这种现象称为分子发光，以光辐射的形式从激发态回到基态，这种现象称为分子

3、发光，在此基础上建立起来的分析方法为分子发光分析法在此基础上建立起来的分析方法为分子发光分析法在此基础上建立起来的分析方法为分子发光分析法在此基础上建立起来的分析方法为分子发光分析法较高激发态较高激发态基基 态态吸收能吸收能量受激量受激光辐射光辐射退激退激分子在退激过程中以光辐射形式释放能量分子在退激过程中以光辐射形式释放能量第3页，此课件共50页哦n n根据分子受激时所吸收能源及辐射光的机理不同分为以下根据分子受激时所吸收能源及辐射光的机理不同分为以下根据分子受激时所吸收能源及辐射光的机理不同分为以下根据分子受激时所吸收能源及辐射光的机理不同分为以下几类：几类：几类：几类：光致发光：以光源来

4、激发而发光光致发光：以光源来激发而发光光致发光：以光源来激发而发光光致发光：以光源来激发而发光 电致发光：以电能来激发而发光电致发光：以电能来激发而发光电致发光：以电能来激发而发光电致发光：以电能来激发而发光原子发射光谱法原子发射光谱法原子发射光谱法原子发射光谱法 生物发光：以生物体释放的能量激发而发光生物发光：以生物体释放的能量激发而发光生物发光：以生物体释放的能量激发而发光生物发光：以生物体释放的能量激发而发光 化学发光：以化学反应能激发而发光化学发光：以化学反应能激发而发光化学发光：以化学反应能激发而发光化学发光：以化学反应能激发而发光-化学发光分析法化学发光分析法化学发光分析法化学发光

5、分析法荧光荧光荧光分析法荧光分析法磷光磷光磷光分析法磷光分析法第4页，此课件共50页哦二、分子荧光分析法的特点二、分子荧光分析法的特点1.1.灵敏度高灵敏度高灵敏度高灵敏度高n n荧光强度随激发光强度增强而增强（提高激发光强度，荧光强度随激发光强度增强而增强（提高激发光强度，荧光强度随激发光强度增强而增强（提高激发光强度，荧光强度随激发光强度增强而增强（提高激发光强度，可提高荧光强度可提高荧光强度可提高荧光强度可提高荧光强度 采用高灵敏度的检测系统可大大提高灵敏采用高灵敏度的检测系统可大大提高灵敏度，检测限荧光分析法比分光光度法低度，检测限荧光分析法比分光光度法低24个数个数量级量级激发激发发

6、射荧光发射荧光强强强强激发光激发光激发光激发光 物物物物 质质质质第5页，此课件共50页哦2.2.选择性好选择性好选择性好选择性好n n不同的物质用不同的光进行激发，选择不同的激发光波不同的物质用不同的光进行激发，选择不同的激发光波不同的物质用不同的光进行激发，选择不同的激发光波不同的物质用不同的光进行激发，选择不同的激发光波长长长长n n不同的物质发射的荧光不同，选择不同的检测荧光波长不同的物质发射的荧光不同，选择不同的检测荧光波长不同的物质发射的荧光不同，选择不同的检测荧光波长不同的物质发射的荧光不同，选择不同的检测荧光波长n n比较容易排除其它物质的干扰，选择性好比较容易排除其它物质的干

7、扰，选择性好比较容易排除其它物质的干扰，选择性好比较容易排除其它物质的干扰，选择性好3.3.实验方法简单实验方法简单实验方法简单实验方法简单4.4.待测样品用量少待测样品用量少待测样品用量少待测样品用量少；仪器价格适中；测定范围较广；仪器价格适中；测定范围较广；仪器价格适中；测定范围较广；仪器价格适中；测定范围较广n n具发光强度可定量测定许多痕量的无机物和有机物，广泛具发光强度可定量测定许多痕量的无机物和有机物，广泛具发光强度可定量测定许多痕量的无机物和有机物，广泛具发光强度可定量测定许多痕量的无机物和有机物，广泛应用在生物化学、分子生物学、免疫学及农牧产品分析、应用在生物化学、分子生物学、

8、免疫学及农牧产品分析、应用在生物化学、分子生物学、免疫学及农牧产品分析、应用在生物化学、分子生物学、免疫学及农牧产品分析、卫生检疫等领域。卫生检疫等领域。卫生检疫等领域。卫生检疫等领域。n n荧光法比磷光法应用广泛。荧光法比磷光法应用广泛。荧光法比磷光法应用广泛。荧光法比磷光法应用广泛。第6页，此课件共50页哦 8-2 荧光和磷光光谱法荧光和磷光光谱法一、荧光和磷光光谱的产生一、荧光和磷光光谱的产生一、荧光和磷光光谱的产生一、荧光和磷光光谱的产生n n具有不饱和基团的基态分子光照后，具有不饱和基团的基态分子光照后，具有不饱和基团的基态分子光照后，具有不饱和基团的基态分子光照后，价电子跃迁价电子

9、跃迁价电子跃迁价电子跃迁产生产生产生产生荧光和磷光荧光和磷光荧光和磷光荧光和磷光 基态分子基态分子基态分子基态分子 价电子跃迁到激发态价电子跃迁到激发态价电子跃迁到激发态价电子跃迁到激发态光照激发光照激发去激发光去激发光 *n基基基基 态态态态第7页，此课件共50页哦1.电子自旋状态的多重性电子自旋状态的多重性n n大多数分子含有偶数电子，基态分子每一个轨道中两个电子大多数分子含有偶数电子，基态分子每一个轨道中两个电子大多数分子含有偶数电子，基态分子每一个轨道中两个电子大多数分子含有偶数电子，基态分子每一个轨道中两个电子自旋方向总是相反的自旋方向总是相反的自旋方向总是相反的自旋方向总是相反的

10、，处于基态单重态。用，处于基态单重态。用，处于基态单重态。用，处于基态单重态。用“S S0 0”表示表示表示表示 ；当；当；当；当物质受光照射时，基态分子吸收光能产生电子能级跃迁，物质受光照射时，基态分子吸收光能产生电子能级跃迁，物质受光照射时，基态分子吸收光能产生电子能级跃迁，物质受光照射时，基态分子吸收光能产生电子能级跃迁，由基态跃迁由基态跃迁由基态跃迁由基态跃迁至更高的单重态，电子自旋方向没有改变，至更高的单重态，电子自旋方向没有改变，至更高的单重态，电子自旋方向没有改变，至更高的单重态，电子自旋方向没有改变，净自旋净自旋净自旋净自旋 =0=0.这种跃迁是符这种跃迁是符这种跃迁是符这种跃

11、迁是符合光谱定律的。合光谱定律的。合光谱定律的。合光谱定律的。基态单重态 S0第一激发单重态 S1S S0 0,S,S1 1,S,S2 2,S,S3 3分别代表基态分别代表基态分别代表基态分别代表基态,第一第一第一第一,二二二二,三激发单重态三激发单重态三激发单重态三激发单重态单重态分子具有抗磁性，激发态的平均寿命约为单重态分子具有抗磁性，激发态的平均寿命约为10-8第8页，此课件共50页哦n n若分子中电子跃迁过程中伴随着自旋方向的改变，由若分子中电子跃迁过程中伴随着自旋方向的改变，由若分子中电子跃迁过程中伴随着自旋方向的改变，由若分子中电子跃迁过程中伴随着自旋方向的改变，由基态单重态基态单

12、重态基态单重态基态单重态激发三重态，净自旋激发三重态，净自旋激发三重态，净自旋激发三重态，净自旋 0 0。这种跃迁为。这种跃迁为。这种跃迁为。这种跃迁为禁阻跃迁禁阻跃迁禁阻跃迁禁阻跃迁 T T1 1、T T2 2、T T3 3分别表示第一、二、三激发三重态分别表示第一、二、三激发三重态分别表示第一、二、三激发三重态分别表示第一、二、三激发三重态 基态单重态基态单重态 S0第一激发三重态第一激发三重态 T1自旋平行自旋平行三重态分子具有顺磁性，激发态的平均寿命约为三重态分子具有顺磁性，激发态的平均寿命约为10-41S第9页，此课件共50页哦n n分子中电子受激跃迁到激发态后，处于激发态的分子是不

13、稳定的，去激返回分子中电子受激跃迁到激发态后，处于激发态的分子是不稳定的，去激返回分子中电子受激跃迁到激发态后，处于激发态的分子是不稳定的，去激返回分子中电子受激跃迁到激发态后，处于激发态的分子是不稳定的，去激返回到较低激发态或基态时有两种方式：无辐射去激和辐射去激到较低激发态或基态时有两种方式：无辐射去激和辐射去激到较低激发态或基态时有两种方式：无辐射去激和辐射去激到较低激发态或基态时有两种方式：无辐射去激和辐射去激2.2.无辐射去激无辐射去激无辐射去激无辐射去激不伴随发光现象的过程叫无辐射去激，体系内的多余的能量以热不伴随发光现象的过程叫无辐射去激，体系内的多余的能量以热不伴随发光现象的过

14、程叫无辐射去激，体系内的多余的能量以热不伴随发光现象的过程叫无辐射去激，体系内的多余的能量以热的形式释放。包括：的形式释放。包括：的形式释放。包括：的形式释放。包括：n n内部转换（内部转换（内部转换（内部转换（ICIC）相同的多重态之间的转换相同的多重态之间的转换相同的多重态之间的转换相同的多重态之间的转换 S-SS-Sn n系间窜跃（系间窜跃（系间窜跃（系间窜跃（ISCISC）不同的多重态之间的转换不同的多重态之间的转换不同的多重态之间的转换不同的多重态之间的转换 S-T S-T n n振动驰豫（振动驰豫（振动驰豫（振动驰豫（VRVR）同一电子能级中，从较高振动能级到较低振动能级的过程同一

15、电子能级中，从较高振动能级到较低振动能级的过程同一电子能级中，从较高振动能级到较低振动能级的过程同一电子能级中，从较高振动能级到较低振动能级的过程n n外部转移外部转移外部转移外部转移指激发态分子与溶剂分子或溶质分子的相互作用及能量转移，使荧光或磷指激发态分子与溶剂分子或溶质分子的相互作用及能量转移，使荧光或磷指激发态分子与溶剂分子或溶质分子的相互作用及能量转移，使荧光或磷指激发态分子与溶剂分子或溶质分子的相互作用及能量转移，使荧光或磷光强度减弱或消灭光强度减弱或消灭光强度减弱或消灭光强度减弱或消灭n n发生系间窜跃电子需转向，发生系间窜跃电子需转向，发生系间窜跃电子需转向，发生系间窜跃电子需

16、转向，S S1 1TT1 1间进行，比内部转换困难间进行，比内部转换困难间进行，比内部转换困难间进行，比内部转换困难 第10页，此课件共50页哦T1S0ISCVRVRIC吸光吸光 吸光吸光S0S1S2VR：振动驰豫：振动驰豫IC：内部转换：内部转换ISC：系间窜跃：系间窜跃第11页，此课件共50页哦3.荧光和磷光光谱的产生荧光和磷光光谱的产生辐射去激辐射去激n n处于处于处于处于S S1 1或或或或T T1 1态的电子返回态的电子返回态的电子返回态的电子返回S S0 0态时，伴随有发光现象，这种过程态时，伴随有发光现象，这种过程态时，伴随有发光现象，这种过程态时，伴随有发光现象，这种过程叫辐射

17、去激叫辐射去激叫辐射去激叫辐射去激 S S1 1或或或或T T1 1 S S0 0 发光（1 1）荧光：）荧光：）荧光：）荧光：当电子从第一激发单重态当电子从第一激发单重态当电子从第一激发单重态当电子从第一激发单重态S S1 1的最低振动能级回到基态的最低振动能级回到基态的最低振动能级回到基态的最低振动能级回到基态S S0 0各振动能级各振动能级各振动能级各振动能级所产生的光辐射叫荧光所产生的光辐射叫荧光所产生的光辐射叫荧光所产生的光辐射叫荧光n n 荧光是相同多重态间的允许跃迁，产生速度快，荧光是相同多重态间的允许跃迁，产生速度快，荧光是相同多重态间的允许跃迁，产生速度快，荧光是相同多重态间

18、的允许跃迁，产生速度快，1010-9-91010-6-6s s，又，又，又，又叫快速荧光或瞬时荧光，外部光源停止照射，荧光马上熄灭叫快速荧光或瞬时荧光，外部光源停止照射，荧光马上熄灭叫快速荧光或瞬时荧光，外部光源停止照射，荧光马上熄灭叫快速荧光或瞬时荧光，外部光源停止照射，荧光马上熄灭n n 无论开始电子被激发至什么高能级，它都经过无辐射去激消耗能量无论开始电子被激发至什么高能级，它都经过无辐射去激消耗能量无论开始电子被激发至什么高能级，它都经过无辐射去激消耗能量无论开始电子被激发至什么高能级，它都经过无辐射去激消耗能量后到后到后到后到S S1 1的最低振动能级，发射荧光，荧光波长比激发光波长

19、长。的最低振动能级，发射荧光，荧光波长比激发光波长长。的最低振动能级，发射荧光，荧光波长比激发光波长长。的最低振动能级，发射荧光，荧光波长比激发光波长长。荧荧荧荧 激激激激第12页，此课件共50页哦T1S0ISCVRVRIC吸光吸光 吸光吸光 荧光荧光图图5-1 分子荧光光谱产生过程示意图分子荧光光谱产生过程示意图S0S1S2VR：振动驰豫：振动驰豫IC：内部转换：内部转换ISC：系间窜跃：系间窜跃第13页，此课件共50页哦（2）磷光）磷光n n当当当当受激电子降到受激电子降到受激电子降到受激电子降到S S1 1的最低振动能级后，未发射荧光，而是经过的最低振动能级后，未发射荧光，而是经过的最低

20、振动能级后，未发射荧光，而是经过的最低振动能级后，未发射荧光，而是经过系间窜跃到系间窜跃到系间窜跃到系间窜跃到T T1 1振动能级，经振动驰豫到振动能级，经振动驰豫到振动能级，经振动驰豫到振动能级，经振动驰豫到 T T1 1最低振动能级，从最低振动能级，从最低振动能级，从最低振动能级，从T T1 1最低振动能级回到基态的各个振动能级所发射的光叫磷光最低振动能级回到基态的各个振动能级所发射的光叫磷光最低振动能级回到基态的各个振动能级所发射的光叫磷光最低振动能级回到基态的各个振动能级所发射的光叫磷光n n从从从从T T1 1 S S1 1要改变电子自旋，发光速度慢，约为要改变电子自旋，发光速度慢，

21、约为要改变电子自旋，发光速度慢，约为要改变电子自旋，发光速度慢，约为 1010-4-4 10s 10s，光，光，光，光照停止后，磷光仍可持续一段时间照停止后，磷光仍可持续一段时间照停止后，磷光仍可持续一段时间照停止后，磷光仍可持续一段时间n n分子相互碰撞的无辐射能量埙耗大，所以磷光的波长更长分子相互碰撞的无辐射能量埙耗大，所以磷光的波长更长分子相互碰撞的无辐射能量埙耗大，所以磷光的波长更长分子相互碰撞的无辐射能量埙耗大，所以磷光的波长更长n n 磷磷磷磷 荧荧荧荧 激激激激 *易产生荧光易产生荧光易产生荧光易产生荧光 n n *易产生磷光易产生磷光易产生磷光易产生磷光第14页，此课件共50页

22、哦T1S0ISCVRVRIC吸光吸光 吸光吸光 荧光荧光 磷光磷光图图5-1 分子荧光、磷光光谱产生过程示意图分子荧光、磷光光谱产生过程示意图S0S1S2VR：振动驰豫：振动驰豫IC：内部转换：内部转换ISC：系间窜跃：系间窜跃VR第15页，此课件共50页哦二、荧光、磷光与分子结构的关系二、荧光、磷光与分子结构的关系n n了解荧光与分子结构的关系，可以预测哪些物质能产生荧光，了解荧光与分子结构的关系，可以预测哪些物质能产生荧光，了解荧光与分子结构的关系，可以预测哪些物质能产生荧光，了解荧光与分子结构的关系，可以预测哪些物质能产生荧光，在什么条件下产生，以及发射的荧光有什么特征以便更好地在什么条

23、件下产生，以及发射的荧光有什么特征以便更好地在什么条件下产生，以及发射的荧光有什么特征以便更好地在什么条件下产生，以及发射的荧光有什么特征以便更好地运用荧光分析技术，采取一些措施把不发荧光的物质产生荧运用荧光分析技术，采取一些措施把不发荧光的物质产生荧运用荧光分析技术，采取一些措施把不发荧光的物质产生荧运用荧光分析技术，采取一些措施把不发荧光的物质产生荧光，即把非荧光体变成荧光体，弱荧光体变成强荧光体光，即把非荧光体变成荧光体，弱荧光体变成强荧光体光，即把非荧光体变成荧光体，弱荧光体变成强荧光体光，即把非荧光体变成荧光体，弱荧光体变成强荧光体（一）荧光效率（一）荧光效率（一）荧光效率（一）荧光

24、效率 n n荧光强度常用荧光量子效率荧光强度常用荧光量子效率荧光强度常用荧光量子效率荧光强度常用荧光量子效率 f f 来描述来描述来描述来描述 荧光量子效率荧光量子效率荧光量子效率荧光量子效率 f f=发荧光的分子数发荧光的分子数激发态分子总数激发态分子总数 f f 是一个物质荧光特性的重要参数，反映了荧光物质发射是一个物质荧光特性的重要参数，反映了荧光物质发射是一个物质荧光特性的重要参数，反映了荧光物质发射是一个物质荧光特性的重要参数，反映了荧光物质发射荧光的能力，荧光的能力，荧光的能力，荧光的能力，f f 越大，荧光越强，在越大，荧光越强，在越大，荧光越强，在越大，荧光越强，在0101之间

25、之间之间之间第16页，此课件共50页哦n n若以各种跃迁速率常数来表示若以各种跃迁速率常数来表示n nKf 为荧光发射过程的速率常数为荧光发射过程的速率常数取决于取决于物质的化学结构物质的化学结构n nKi 为非辐射跃迁的速率常数之和为非辐射跃迁的速率常数之和主要主要取决于化学环境，也与化学结构有关取决于化学环境，也与化学结构有关n n分析上有应用价值的荧光化合物的荧光效率分析上有应用价值的荧光化合物的荧光效率在在0.11之间之间第17页，此课件共50页哦n n至今对激发态分子的性质了解不深，无法定量地描述荧至今对激发态分子的性质了解不深，无法定量地描述荧至今对激发态分子的性质了解不深，无法定

26、量地描述荧至今对激发态分子的性质了解不深，无法定量地描述荧光与分子结构之间的关系光与分子结构之间的关系光与分子结构之间的关系光与分子结构之间的关系n n一般情况，一般情况，一般情况，一般情况，有机芳香族化合物及金属离子配合物有机芳香族化合物及金属离子配合物有机芳香族化合物及金属离子配合物有机芳香族化合物及金属离子配合物是最强是最强是最强是最强最有用的荧光体最有用的荧光体最有用的荧光体最有用的荧光体（二）荧光磷光与有机化合物结构的关系（二）荧光磷光与有机化合物结构的关系n n物质只有吸收了紫外可见光，产生物质只有吸收了紫外可见光，产生物质只有吸收了紫外可见光，产生物质只有吸收了紫外可见光，产生

27、*n n *跃迁，产跃迁，产跃迁，产跃迁，产生荧光生荧光生荧光生荧光n n *与与与与n n *跃迁相比，摩尔吸收系数大跃迁相比，摩尔吸收系数大跃迁相比，摩尔吸收系数大跃迁相比，摩尔吸收系数大10102 210103 3，寿，寿，寿，寿命短命短命短命短n n *跃迁常产生较强的荧光，跃迁常产生较强的荧光，跃迁常产生较强的荧光，跃迁常产生较强的荧光，n n *跃迁产生的荧光跃迁产生的荧光跃迁产生的荧光跃迁产生的荧光弱，但可产生系间窜跃，产生更强的磷光弱，但可产生系间窜跃，产生更强的磷光弱，但可产生系间窜跃，产生更强的磷光弱，但可产生系间窜跃，产生更强的磷光第18页，此课件共50页哦1.1.共轭体

28、系共轭体系共轭体系共轭体系有较强的荧光有较强的荧光有较强的荧光有较强的荧光n n具有共轭体系的芳环或杂环化合物，具有共轭体系的芳环或杂环化合物，具有共轭体系的芳环或杂环化合物，具有共轭体系的芳环或杂环化合物，电子共轭程电子共轭程电子共轭程电子共轭程度越大，越易产生荧光度越大，越易产生荧光度越大，越易产生荧光度越大，越易产生荧光;环越多，共轭程度越大，产生环越多，共轭程度越大，产生环越多，共轭程度越大，产生环越多，共轭程度越大，产生荧光波长越长，发射的荧光强度越强荧光波长越长，发射的荧光强度越强荧光波长越长，发射的荧光强度越强荧光波长越长，发射的荧光强度越强 f f ex ex/nm/nm em

29、em/nm/nm 0.11 205 278 0.29 286 3100.46 365 400苯苯萘萘蒽蒽 350菲菲线状环结构比非线状结线状环结构比非线状结构的荧光波长长构的荧光波长长第19页，此课件共50页哦 芳香族化合物因具有共轭的不饱和体系，多数芳香族化合物因具有共轭的不饱和体系，多数能发生荧光能发生荧光 多环芳烃是重要的环境污染物，可用荧光法测定多环芳烃是重要的环境污染物，可用荧光法测定 3，4-苯并苯并芘是强致癌物芘是强致癌物 ex ex=386 nm=386 nm emem=430 nm=430 nm第20页，此课件共50页哦2.刚性平面结构较稳定的平面结构n n具有强荧光的分子多

30、数有刚性平面结构具有强荧光的分子多数有刚性平面结构荧光素：氧桥把两荧光素：氧桥把两个环固定在一个平个环固定在一个平面上，具有平面结面上，具有平面结构，强荧光物质构，强荧光物质酚酞：无氧桥把两个酚酞：无氧桥把两个环固定，不能很好的环固定，不能很好的共平面，为非荧光物共平面，为非荧光物质质第21页，此课件共50页哦例 1，2-二苯乙烯二苯乙烯反式：平面构型 强荧光体顺式：非平面构型 非荧光体第22页，此课件共50页哦（三）金属螯合物的荧光（三）金属螯合物的荧光n n大多数无机盐类金属离子，不能产生荧光，但某些螯合大多数无机盐类金属离子，不能产生荧光，但某些螯合大多数无机盐类金属离子，不能产生荧光，

31、但某些螯合大多数无机盐类金属离子，不能产生荧光，但某些螯合物都能产生很强的荧光，可用于痕量金属离子的测定物都能产生很强的荧光，可用于痕量金属离子的测定物都能产生很强的荧光，可用于痕量金属离子的测定物都能产生很强的荧光，可用于痕量金属离子的测定n n不少有机配体是弱荧光体不少有机配体是弱荧光体不少有机配体是弱荧光体不少有机配体是弱荧光体 或不发荧光，但与或不发荧光，但与或不发荧光，但与或不发荧光，但与MMn+n+形成形成形成形成螯合物后变为平面构型，就会使荧光加强或产生荧螯合物后变为平面构型，就会使荧光加强或产生荧螯合物后变为平面构型，就会使荧光加强或产生荧螯合物后变为平面构型，就会使荧光加强或

32、产生荧光光光光n n例：例：例：例：8-8-羟基喹啉为弱荧光体，与羟基喹啉为弱荧光体，与羟基喹啉为弱荧光体，与羟基喹啉为弱荧光体，与MMn+n+Al Al3+3+、MgMg2+2+形形形形成螯合物后，能形成刚性结构，荧光加强成螯合物后，能形成刚性结构，荧光加强成螯合物后，能形成刚性结构，荧光加强成螯合物后，能形成刚性结构，荧光加强第23页，此课件共50页哦（四）取代基的类型（四）取代基的类型n n取代基对荧光物质的荧光特征和强取代基对荧光物质的荧光特征和强度也有很大影响。分成三类：度也有很大影响。分成三类：（1 1）增强荧光的取代基）增强荧光的取代基 有有-OH、-OR、-NH2、-NHR、-

33、NR2等给电子基团等给电子基团n n由于基团的由于基团的 n 电子（孤对电子）的电子云与电子（孤对电子）的电子云与苯环上的苯环上的 轨道平行，共享了共轭轨道平行，共享了共轭 电子，电子，扩大了共轭体系，使荧光波长长移，荧光强扩大了共轭体系，使荧光波长长移，荧光强度增强度增强第24页，此课件共50页哦（2 2）减弱荧光的取代基）减弱荧光的取代基 -COOH-COOH、-NO-NO2 2 、-COOR COOR、-NO-NO、-SH-SH 吸电子基团吸电子基团吸电子基团吸电子基团,使荧光波长短移，使荧光波长短移，使荧光波长短移，使荧光波长短移，荧光强度减弱荧光强度减弱荧光强度减弱荧光强度减弱芳环上

34、被芳环上被芳环上被芳环上被F F、ClCl、BrBr、I I 取代后，使系间窜跃加强，磷取代后，使系间窜跃加强，磷取代后，使系间窜跃加强，磷取代后，使系间窜跃加强，磷光增强，荧光减弱。其荧光强度随卤素原子量增加而减光增强，荧光减弱。其荧光强度随卤素原子量增加而减光增强，荧光减弱。其荧光强度随卤素原子量增加而减光增强，荧光减弱。其荧光强度随卤素原子量增加而减弱，磷光相应增强，这种效应为重原子效应。弱，磷光相应增强，这种效应为重原子效应。弱，磷光相应增强，这种效应为重原子效应。弱，磷光相应增强，这种效应为重原子效应。（3 3）影响不明显的取代基）影响不明显的取代基 -NH -NH3 3+、-R-R

35、、-SO-SO3 3HH等等等等第25页，此课件共50页哦三、环境对荧光的影响三、环境对荧光的影响 1.1.溶剂的影响溶剂的影响溶剂的影响溶剂的影响 同一荧光物质在不同的溶剂中可能表现出不同的荧同一荧光物质在不同的溶剂中可能表现出不同的荧同一荧光物质在不同的溶剂中可能表现出不同的荧同一荧光物质在不同的溶剂中可能表现出不同的荧光性质光性质光性质光性质 一般来说，溶剂的极性增强，荧光波长长移，荧光一般来说，溶剂的极性增强，荧光波长长移，荧光一般来说，溶剂的极性增强，荧光波长长移，荧光一般来说，溶剂的极性增强，荧光波长长移，荧光强度增大强度增大强度增大强度增大 2.2.温度的影响温度的影响温度的影响

36、温度的影响低温下测定，提高灵敏度低温下测定，提高灵敏度低温下测定，提高灵敏度低温下测定，提高灵敏度 因为辐射跃迁的速率基本不随温度变，而非辐因为辐射跃迁的速率基本不随温度变，而非辐因为辐射跃迁的速率基本不随温度变，而非辐因为辐射跃迁的速率基本不随温度变，而非辐射跃迁随温度升高显著增大。大多数荧光物质都随射跃迁随温度升高显著增大。大多数荧光物质都随射跃迁随温度升高显著增大。大多数荧光物质都随射跃迁随温度升高显著增大。大多数荧光物质都随溶液温度升高荧光效率下降，荧光强度减弱。溶液温度升高荧光效率下降，荧光强度减弱。溶液温度升高荧光效率下降，荧光强度减弱。溶液温度升高荧光效率下降，荧光强度减弱。温度

37、对磷光影响更大温度对磷光影响更大温度对磷光影响更大温度对磷光影响更大第26页，此课件共50页哦3.pH的影响n n大多数含有酸性或碱性基团的芳香族化合物的荧光性大多数含有酸性或碱性基团的芳香族化合物的荧光性大多数含有酸性或碱性基团的芳香族化合物的荧光性大多数含有酸性或碱性基团的芳香族化合物的荧光性质受溶液质受溶液质受溶液质受溶液pHpH的影响很大的影响很大的影响很大的影响很大n n共轭酸碱对是具有不同荧光性质的两种型体，具有各自共轭酸碱对是具有不同荧光性质的两种型体，具有各自共轭酸碱对是具有不同荧光性质的两种型体，具有各自共轭酸碱对是具有不同荧光性质的两种型体，具有各自的荧光效率和荧光波长的荧

38、光效率和荧光波长的荧光效率和荧光波长的荧光效率和荧光波长例：例：苯酚苯酚离子化后，离子化后，荧光消失荧光消失pH1有有荧光荧光pH13无无荧光荧光第27页，此课件共50页哦n n但两个苯环相连的化合物，又表现出相反的性质，分子但两个苯环相连的化合物，又表现出相反的性质，分子但两个苯环相连的化合物，又表现出相反的性质，分子但两个苯环相连的化合物，又表现出相反的性质，分子形式无荧光，离子化后显荧光形式无荧光，离子化后显荧光形式无荧光，离子化后显荧光形式无荧光，离子化后显荧光例：例：苯酚苯酚有荧光有荧光无荧光无荧光另外，表面活性剂也会影响荧光强度和特性第28页，此课件共50页哦四、荧光强度与荧光物质

39、浓度的关系四、荧光强度与荧光物质浓度的关系n n用强度为用强度为用强度为用强度为I I0 0的入射光，照射到液池内的荧光物质时，的入射光，照射到液池内的荧光物质时，的入射光，照射到液池内的荧光物质时，的入射光，照射到液池内的荧光物质时，产生荧光，荧光强度产生荧光，荧光强度产生荧光，荧光强度产生荧光，荧光强度I If f 用仪器测得，在荧光浓度很稀用仪器测得，在荧光浓度很稀用仪器测得，在荧光浓度很稀用仪器测得，在荧光浓度很稀 (A(A0.050.05)时，荧光物质发射的荧光强度时，荧光物质发射的荧光强度时，荧光物质发射的荧光强度时，荧光物质发射的荧光强度I If f 与浓度有下面与浓度有下面与浓

40、度有下面与浓度有下面的关系的关系的关系的关系n nI If f=f f I Ia a=f f（I I0 0-I-I）I Ia a为吸收的辐射强度为吸收的辐射强度为吸收的辐射强度为吸收的辐射强度I I0 0为入射光强度为入射光强度为入射光强度为入射光强度荧光池I I0 0I IIf荧光强度检测器n n I If f=f f（I I0 0-I-I0 01010-A-A ）=f f I I0 0 （1 1-10-10-A-A ）I=I=I I0 01010-A-A将上式展开第29页，此课件共50页哦 当当当当A A 0.050.05时，方括号中其它各项与第一项相比可忽略时，方括号中其它各项与第一项相

41、比可忽略时，方括号中其它各项与第一项相比可忽略时，方括号中其它各项与第一项相比可忽略不计，上式简化不计，上式简化不计，上式简化不计，上式简化 I If f=2.3 =2.3 f f I I0 0A A =2.3 =2.3 f f I I0 0 bcbc当当A 0.05时，时，I If f与与与与 f f、I I0 0、和和和和c c 有关，对一给定物质，有关，对一给定物质，有关，对一给定物质，有关，对一给定物质，当激发光波长和强度一定时，当激发光波长和强度一定时，当激发光波长和强度一定时，当激发光波长和强度一定时，f f、I I0 0、和和和和b b为常数，为常数，为常数，为常数，合并为合并为

42、合并为合并为KK If=KC Ip=KC定量分析依据定量分析依据定量分析依据定量分析依据第30页，此课件共50页哦n n荧光强度与物质浓度呈线形关系，荧光强度与物质浓度呈线形关系，If=KC只只有在浓度低时使用，荧光物质测定的是微有在浓度低时使用，荧光物质测定的是微量或痕量组分，灵敏度高量或痕量组分，灵敏度高n n浓度高时，浓度高时，If与与C不呈线形关系，有时不呈线形关系，有时C增增大，大，If反而降低因为公式反而降低因为公式 中后面影响，中后面影响，有时发生荧光猝灭效应有时发生荧光猝灭效应第31页，此课件共50页哦n n荧光猝灭荧光猝灭 荧光物质与溶剂或其它物质之间荧光物质与溶剂或其它物质

43、之间发生化学反应，或发生碰撞后使荧光强度发生化学反应，或发生碰撞后使荧光强度下降下降或荧光效率或荧光效率 f 下降称为荧光猝灭。下降称为荧光猝灭。n n使荧光强度降低的物质称为荧光猝灭剂使荧光强度降低的物质称为荧光猝灭剂n n氧分子及产生重原子效应的溴化物、碘化物氧分子及产生重原子效应的溴化物、碘化物等都是常见的荧光猝灭剂等都是常见的荧光猝灭剂n n碰撞猝灭碰撞猝灭 M+激激 M*M*+Q M+Q+热热n n自熄灭自熄灭荧光物质发射的荧光被荧光物质荧光物质发射的荧光被荧光物质的基态分子所吸收，即自吸收现象的基态分子所吸收，即自吸收现象第32页，此课件共50页哦 荧光分析仪器荧光分析仪器荧光分析

44、仪器荧光分析仪器主要由光源、单色器、液槽、检测主要由光源、单色器、液槽、检测主要由光源、单色器、液槽、检测主要由光源、单色器、液槽、检测器和显示器组成器和显示器组成器和显示器组成器和显示器组成光源第一单色器液池检测器第二单色器检测器放大器及记录器 ex ex emem与分光光度计有两点不同与分光光度计有两点不同两个单色器两个单色器检测器与激发光互成直角检测器与激发光互成直角I I0 0I I五、荧光分析仪器五、荧光分析仪器第33页，此课件共50页哦1、光源、光源n n激发光源一般要求比吸收测量中的光源有更大的发射强激发光源一般要求比吸收测量中的光源有更大的发射强激发光源一般要求比吸收测量中的光

45、源有更大的发射强激发光源一般要求比吸收测量中的光源有更大的发射强度；适用波长范围宽度；适用波长范围宽度；适用波长范围宽度；适用波长范围宽n n荧光计中，常使用卤钨灯作光源荧光计中，常使用卤钨灯作光源荧光计中，常使用卤钨灯作光源荧光计中，常使用卤钨灯作光源n n荧光光度计中常用高压汞灯和氙弧灯荧光光度计中常用高压汞灯和氙弧灯荧光光度计中常用高压汞灯和氙弧灯荧光光度计中常用高压汞灯和氙弧灯利用汞蒸气放电发光的利用汞蒸气放电发光的利用汞蒸气放电发光的利用汞蒸气放电发光的光源；常用其发射光源；常用其发射光源；常用其发射光源；常用其发射365 nm365 nm、405 nm405 nm、436 nm 4

46、36 nm 三条谱线三条谱线三条谱线三条谱线以以以以365 nm 365 nm 的谱线最强的谱线最强的谱线最强的谱线最强应用最广泛的一种光应用最广泛的一种光源，可发射源，可发射250800nm很强的连续光源很强的连续光源第34页，此课件共50页哦2、单色器n n荧光计用滤光片作单色器，荧光计只能用于定量分析，不荧光计用滤光片作单色器，荧光计只能用于定量分析，不荧光计用滤光片作单色器，荧光计只能用于定量分析，不荧光计用滤光片作单色器，荧光计只能用于定量分析，不能获得光谱能获得光谱能获得光谱能获得光谱n n大多数荧光光度计一般采用两个光栅单色器，有较高大多数荧光光度计一般采用两个光栅单色器，有较高

47、大多数荧光光度计一般采用两个光栅单色器，有较高大多数荧光光度计一般采用两个光栅单色器，有较高的分辨率，能扫描图谱，既可获得激发光谱，又可获的分辨率，能扫描图谱，既可获得激发光谱，又可获的分辨率，能扫描图谱，既可获得激发光谱，又可获的分辨率，能扫描图谱，既可获得激发光谱，又可获得荧光光谱得荧光光谱得荧光光谱得荧光光谱n n第一单色器作用：第一单色器作用：第一单色器作用：第一单色器作用：分离出所需要的激发光，选择最佳激分离出所需要的激发光，选择最佳激分离出所需要的激发光，选择最佳激分离出所需要的激发光，选择最佳激发波长发波长发波长发波长 exex ，用此激发光激发液池内的荧光物质，用此激发光激发液

48、池内的荧光物质，用此激发光激发液池内的荧光物质，用此激发光激发液池内的荧光物质 exexn n第二单色器作用：第二单色器作用：第二单色器作用：第二单色器作用：滤掉一些杂散光和杂质所发射的干扰滤掉一些杂散光和杂质所发射的干扰滤掉一些杂散光和杂质所发射的干扰滤掉一些杂散光和杂质所发射的干扰光，用来选择测定用的荧光波长光，用来选择测定用的荧光波长光，用来选择测定用的荧光波长光，用来选择测定用的荧光波长 emem。在选定的在选定的在选定的在选定的 emem 下测下测下测下测定荧光强度，定量分析定荧光强度，定量分析定荧光强度，定量分析定荧光强度，定量分析第35页，此课件共50页哦3 3、样品池、样品池、

49、样品池、样品池n n盛放测定溶液，通常是石英材料的方形池，四面都盛放测定溶液，通常是石英材料的方形池，四面都盛放测定溶液，通常是石英材料的方形池，四面都盛放测定溶液，通常是石英材料的方形池，四面都透光，只能用手拿棱或最上边透光，只能用手拿棱或最上边透光，只能用手拿棱或最上边透光，只能用手拿棱或最上边4 4、检测器、检测器、检测器、检测器n n把光信号转化成电信号把光信号转化成电信号把光信号转化成电信号把光信号转化成电信号,放大放大放大放大,直接转成荧光强度直接转成荧光强度直接转成荧光强度直接转成荧光强度n n荧光的强度一般较弱，要求检测器有较高的灵敏度，荧光的强度一般较弱，要求检测器有较高的灵

50、敏度，荧光的强度一般较弱，要求检测器有较高的灵敏度，荧光的强度一般较弱，要求检测器有较高的灵敏度，荧光光度计采用光电倍增管荧光光度计采用光电倍增管荧光光度计采用光电倍增管荧光光度计采用光电倍增管n n荧光分析比吸收光度法具有高得多的灵敏度，是因荧光分析比吸收光度法具有高得多的灵敏度，是因荧光分析比吸收光度法具有高得多的灵敏度，是因荧光分析比吸收光度法具有高得多的灵敏度，是因为荧光强度与激发光强度成正比，提高激发光强度为荧光强度与激发光强度成正比，提高激发光强度为荧光强度与激发光强度成正比，提高激发光强度为荧光强度与激发光强度成正比，提高激发光强度可可可可 大大提高荧光强度大大提高荧光强度大大提