医学级研究生生放射性核素标记化合物.pptx

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1、第四章 放射性核素标记化合物 第一节 概述一、放射性核素标记技术和放射性核素标记化合物的含义 放射性核素标记化合物是化合物的分子结构中某一分子或原子被放射性核素原子取代后的化合物。1414C-C-尿素-1414COCO2 2 -3232P PATPATP 1-1-1414C C乙酰胆碱第1页/共47页二、放射性核素标记化合物（一）放射性核素标记化合物的特点结合牢固有合适的放射性物理半衰期容易测量第2页/共47页二、放射性核素标记化合物（一）放射性核素标记化合物的特点（二）同位素标记与非同位素标记（1 1）同位素标记(isotopic labelling)(isotopic labelling)

2、：被标记化合物中固有元素被其放射性核素的同位素取代所形成的标记。有机化合物：1414C C 、3 3H H 硫、磷化合物：3535S S、3232P P特点：所得化合物的物理化学及生 物特性与原化合物基本相同第3页/共47页 （2 2）非同位素标记(non-isotopic labelling)(non-isotopic labelling)：非固有元素131131I I-蛋白质、125125I I-蛋白质125125I I-类固醇激素特点：组成不完全相同物理化学及生物特性有所改变二、放射性核素标记化合物（一）放射性核素标记化合物的特点（二）同位素标记与非同位素标记第4页/共47页（三）放射性

3、核素标记化物的命名无机化合物：131131I-NaII-NaI、3535S-S-硫酸有机化合物：1-1-1414C-C-醋酸（1 1）定位标记（Specific labeling Specific labeling）5(S)-5(S)-3 3H-H-尿嘧啶（2 2）准定位标记（Normal labelingNormal labeling）6,7(n)-6,7(n)-3 3H-H-雌二醇第5页/共47页（3 3）均匀标记（Uniform Uniform labelinglabeling）U-U-1414C-C-葡萄糖（4 4）全标记 （General General labelinglabeli

4、ng）G-G-3 3H-H-胆固醇（三）放射性核素标记化物的命名第6页/共47页（5 5）双标记或多标记（Double labeling and multiped Double labeling and multiped labelinglabeling）C C3 3H H3 3-3535S S-CH-CH2 2CHCH2 2CH(NHCH(NH2 2)-COOH)-COOH 1313C CH H3 3-1414C COOHOOH（三）放射性核素标记化物的命名第7页/共47页放射性比活度Specific activity放射化学纯度Radiochemical purity（四）放射性比活度与放

5、射化学纯度第8页/共47页（五）不稳定性1.1.核衰变2.2.辐射自分解3.3.脱落4.4.位移（四）放射性比活度与放射化学纯度第9页/共47页碘标记化合物的基本特性125125I I、131131I I、123123I:I:半衰期、能量适宜125125I I、131131I I：价廉易得125125I I：易于探测第二节 蛋白质与多肽放射性碘标记124Xe+1n-125I+124Xe(n,)125IXian氙第10页/共47页碘标记化合物的基本特性一、蛋白质与多肽的放射性碘标记技术特点：苯环比直链易于标记且稳定（一）基本原理形式：NaNa*I-I-*I I-*I I2 2 或 *I I+（二

6、）常用标记方法分类：直接标记法间接标记法第二节 蛋白质与多肽放射性碘标记第11页/共47页Na*I氧化剂*I2或*I+酪氨酸残基1.直接标记法lao第12页/共47页1.1.直接标记法(1)(1)氯胺T T法原理：次氯酸使*I-氧化特点：简便、快速 便宜易得、标记效率高、重复性好、反应易控制 是使用最广泛的碘标记技术还原剂：偏重亚硫酸钠（焦亚硫酸钠）第13页/共47页氯胺T T法注意事项 氯胺T T溶液应新鲜配制 氯胺T T 用量应严格控制 偏重亚硫酸钠也应新鲜配制、1.5-21.5-2倍于氯胺T T pH7.4-7.8,0.2-0.5M pH7.4-7.8,0.2-0.5M磷酸缓冲液 减少反

7、应体积 反应时间：10s-3min10s-3min 室温进行1.1.直接标记法 (1)(1)氯胺T T法第14页/共47页1.1.直接标记法 （2 2）乳过氧化物酶法原理：当少量H H2 2O O2 2存在时,乳过氧化物酶与H H2 2O O2 2结合,释放出新生氧,使*I I-氧化。特点：反应十分温和 放射性比活度高 能保持生物和免疫活性缺点：标记率比氯胺T T法低,30%,30%40%40%。还原剂：缓冲液或半胱氨酸或巯基乙醇第15页/共47页乳过氧化物酶法注意事项 H H2 2O O2 2应分次加入乳过氧化物酶用量应控制 在标记蛋白量的1%1%以下 采用双酶标记法(葡萄糖氧化酶)pH 3

8、.0-8.0 pH 3.0-8.0反应时间：30-60min30-60min第16页/共47页1.直接标记法(3)固相氧化剂法原理：将氧化剂交联在琼脂糖凝胶上或涂在塑料管或塑料珠子表面,形成不溶性的固相氧化剂。特点：能简化标记中止反应不需加还原剂第17页/共47页1.1.直接标记法(3)(3)固相氧化剂法 固相酶法 将乳过氧化物酶或葡萄糖氧化酶交联到琼脂糖凝胶（Sepharose Sepharose 4B4B）上,反应条件仍同于上述酶法。第18页/共47页 氯甘脲(Iodogen)(Iodogen)法 1 1，3 3，4 4，6-6-四氯3,6-3,6-二苯甘脲 将氯甘脲用氯仿溶解后涂于反应管

9、底部，用N N2 2气吹干，置-20-20o oC C冷藏备用。1.直接标记法(3)固相氧化剂法第19页/共47页 Iodo-Beads Iodo-Beads法 将氯胺T T的衍生物N-N-氯苯磺胺共价连接到无孔的聚苯乙烯小珠表面。1.直接标记法(3)固相氧化剂法第20页/共47页 固相酶法 氯甘脲(Iodogen)(Iodogen)法 Iodo-BeadsIodo-Beads法 1.直接标记法(3)固相氧化剂法第21页/共47页1.1.直接标记法(4)N-(4)N-溴替丁二酰亚胺 (N-Bromosuccinimide)(N-Bromosuccinimide)原理：溴代瑚玻酰亚胺的作用与氯胺

10、T T和IodogenIodogen法相似。特点：标记率高、操作简单、快、安全 可标记较低浓度蛋白质缺点：体内实验可能产生微量毒性第22页/共47页三、蛋白质与多肽的放射性碘标记技术 1.1.直接标记法 (1)(1)氯胺T T法 (2)(2)乳过氧化物酶法 (3)(3)固相氧化剂法 固相酶法 氯甘脲(Iodogen)(Iodogen)法 Iodo-BeadsIodo-Beads法 (4)N-(4)N-溴替丁二酰亚胺 第23页/共47页2.间接标记法又称联接标记法 是先将放射性碘联结到一个小分子载体上,再将这个小分子物质与蛋白质结合。3-丙酸-N-琥珀酰亚脂第24页/共47页2.间接标记法优缺点

11、优点：避免了蛋白质和氧化剂直接接触 Bolton-HunterBolton-Hunter试剂主要联接到 蛋白质分子表面的赖氨酸残基的 氨基或蛋白质的N-N-末端上缺点：较大分子的引入 碘化蛋白质的放射性比活度和 碘的利用率均较直接标记法低第25页/共47页二、核酸的放射性碘标记技术放射性碘-碱基方法：解链 三氧化铊 碘-碳共价键第26页/共47页第三节 放射性标记化合物的纯化与鉴定一、标记化合物的提纯 游离放射性核素 标记的杂质 辐射自分解第27页/共47页第三节 放射性标记化合物的纯化与鉴定一、标记化合物的提纯（一）标记率测定1.1.基本原理（1 1）纸层析(paper chromatogr

12、aphy)(paper chromatography)（2 2）薄层层析(thin layer-)(thin layer-)硅胶或氧化铝-吸附力和分配系数离子交换树脂-携带电荷聚酰胺-氢键第28页/共47页第三节 放射性标记化合物的纯化与鉴定一、标记化合物的提纯（一）标记率测定1.1.基本原理2.2.基本操作（1 1）选择固定相（2 2）选择展开剂（3 3）点样与展开第29页/共47页第三节 放射性标记化合物的纯化与鉴定一、标记化合物的提纯（一）标记率测定1.1.基本原理2.2.基本操作3.3.测量结果（1 1）放射自显影（2 2）分段测量（3 3）放射性扫描第30页/共47页第三节 放射性标

13、记化合物的纯化与鉴定一、标记化合物的提纯（一）标记率测定1.1.基本原理2.2.基本操作3.3.测量结果4.4.注意事项（1 1）层析系统：有效分开（2 2）高比活度：加载体（3 3）多次点样第31页/共47页第三节 放射性标记化合物的纯化与鉴定一、标记化合物的提纯（一）标记率测定（二）标记物的分离纯化1.1.纸层析和薄层层析2.2.柱层析（1 1）凝胶过滤层析(gel filtration chromatography)(gel filtration chromatography)（2 2）离子交换层析（ion-exchange chromatographyion-exchange chro

14、matography）第32页/共47页第三节 放射性标记化合物的纯化与鉴定一、标记化合物的提纯（一）标记率测定（二）标记物的分离纯化1.1.纸层析和薄层层析2.2.柱层析（3 3）亲和层析(affinity chromatography)(affinity chromatography)（4 4）放射性高效液相色谱仪第33页/共47页第三节 放射性标记化合物的纯化与鉴定一、标记化合物的提纯（一）标记率测定（二）标记物的分离纯化1.1.纸层析和薄层层析2.2.柱层析3.3.透析法第34页/共47页第三节 放射性标记化合物的纯化与鉴定一、标记化合物的提纯二、标记化合物的鉴定和质量控制（一）放射化

15、学纯度的测定 特定组分的放射性（cpm）放射化学纯度=100%各组分的放射性之和（cpm）第35页/共47页第三节 放射性标记化合物的纯化与鉴定一、标记化合物的提纯二、标记化合物的鉴定和质量控制（一）放射化学纯度的测定（二）放射性浓度（三）放射性比活度1.1.直接测定计算法 放射性浓度放射性浓度 (KBq/ml)(KBq/ml)放射性比活度放射性比活度 =化学浓度化学浓度(g/ml)(g/ml)第36页/共47页第三节 放射性标记化合物的纯化与鉴定一、标记化合物的提纯二、标记化合物的鉴定和质量控制（一）放射化学纯度的测定（二）放射性浓度（三）放射性比活度1.1.直接测定计算法2.2.色谱扫描面

16、积计算法第37页/共47页 特定组分峰的 各段放射性之和标记率（%）=100%全层析谱 各段放射性之和 投入标记的放射性活度标记率放射性比活度=投入标记的待标记物质的化学量（三）放射性比活度1.直接测定计算法2.层析谱放射性测定计算法第38页/共47页第三节 放射性标记化合物的纯化与鉴定一、标记化合物的提纯二、标记化合物的鉴定和质量控制（一）放射化学纯度的测定（二）放射性浓度（三）放射性比活度1.1.直接测定计算法2.2.色谱扫描面积计算法3.3.自身取代计算法第39页/共47页第三节 放射性标记化合物的纯化与鉴定一、标记化合物的提纯二、标记化合物的鉴定和质量控制（一）放射化学纯度的测定（二）

17、放射性浓度（三）放射性比活度（四）生物活性和免疫活性的测定第40页/共47页（四）生物活性和免疫活性的测定方法：鉴定生物活性时,让其与受体结合;鉴定免疫活性时,让其与抗体结合。第41页/共47页三、标记化合物的辐射自分解与对策（一）辐射自分解的类型1.初级内分解2.初级外分解3.次级分解第42页/共47页H2OH2OO OH1.初级内分解2.初级外分解3.次级分解核衰变释放的射线核衰变产生子体核素产生激活物质第43页/共47页三、标记化合物的辐射自分解与对策（一）辐射自分解的类型（二）影响辐射自分解的因素1.标记化合物吸收射线能量的效率2.标记化合物的比活度3.标记化合物的化学纯度第44页/共47页三、标记化合物的辐射自分解与对策（一）辐射自分解的类型（二）影响辐射自分解的因素（三）控制辐射自分解的方法1.比活度适当2.稀释分散3.加自由基消除剂4.降低储存温度第45页/共47页 同位素标记与非同位素标记 蛋白质与多肽的放射性碘标 记技术的方法 标记化合物的提纯小结第46页/共47页谢谢您的观看！第47页/共47页