细胞工程第十一章动物细胞培养的应用技术课件.ppt

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1、细胞工程第十一章动物细胞培养的应用技术第1页，此课件共91页哦第一节 动物细胞培养在单克隆抗体制备中的应用n1975年年kohler和和milstein首次用首次用B淋巴细胞杂交瘤技术制备出均一性淋巴细胞杂交瘤技术制备出均一性的单克隆抗体获得的单克隆抗体获得1984年诺贝尔奖。年诺贝尔奖。单克隆抗体概念：每一克隆单克隆抗体概念：每一克隆B细胞所产细胞所产生的理化性状高度均一、组成均一、生的理化性状高度均一、组成均一、只与同一种抗原决定族反应的抗体，只与同一种抗原决定族反应的抗体，称为单克隆抗体（称为单克隆抗体（monoclonal antibody,McAb）。）。第2页，此课件共91页哦n一

2、、杂交瘤技术的基本原理和过程一、杂交瘤技术的基本原理和过程n（一）细胞的选择与融合（一）细胞的选择与融合n（二）选择培养基的应用（二）选择培养基的应用n（三）有限稀释与抗原特异性选择（三）有限稀释与抗原特异性选择第3页，此课件共91页哦n二、杂交瘤技术制备单克隆抗体的基本过程及方法二、杂交瘤技术制备单克隆抗体的基本过程及方法第4页，此课件共91页哦二、杂交瘤技术制备单克隆抗体流程动物免疫分离脾细胞制备骨髓瘤细胞细胞融合HAT培养基选择杂交瘤细胞阳性孔克隆化并扩大培养再次克隆克隆扩大培养扩大培养收集上清液动物接种收集腹水单克隆抗体纯化保存ELISA测血清第5页，此课件共91页哦三、单克隆抗体的基

3、本技术1.抗原提纯与动物免疫：抗原纯度高：电泳纯与骨髓瘤细胞同源的BALB/c小鼠2.细胞的选择：A 经过抗原免疫的B细胞（脾细胞）。B 肿瘤细胞(多发性骨髓瘤细胞:Sp2/0）。3.细胞融合：融合剂：聚乙二醇 (PEG,常用聚合度10002000浓度w/v：40%)细胞比例：1:21:10，常用1:4。反应时间：24min。第6页，此课件共91页哦4.培养基的选择：HAT培养基。含有三种关键成分：次黄嘌呤(hypoxanthine,H)氨甲蝶呤(aminopterin,A)胸腺嘧啶核苷(thymidine,T).5.细胞的DNA合成一般有两条途径：A：由糖和氨基酸合成核苷酸，进而合成DNA，

4、叶酸作为重要的辅酶参与反应。B：在次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷存在下，经次黄嘌呤磷酸核糖转化酶(HGPRT)和胸腺嘧啶核苷激酶(TK)的催化下合成DNA。第7页，此课件共91页哦6.HAT培养基的选择原理：氨甲蝶呤(A)是叶酸拮抗剂，可阻断细胞利用正常途径合成DNA，细胞在含有氨甲蝶呤的培养基中不能通过正常途径合成DNA。瘤细胞是HGPRT酶阴性细胞，自身不能通过替代途径合成DNA而繁殖。B细胞虽含有HGPRT，但不能在体外培养存活（只存活57d，且功能下降)。融合细胞含有B细胞和瘤细胞，其中瘤细胞核利用B细胞的HGPRT酶进行旁路合成DNA而存活。第8页，此课件共91页哦7.克隆化并扩大培养(单细

5、胞培养称为克隆化)：有限稀释法:将细胞悬液逐次稀释后加入培养孔(36%的孔为1个细胞/孔)，可获得单个细胞形成的克隆，选择高分泌抗体的细胞株扩大培养或冻存。显微操作法：在倒置显微镜下吸出单个细胞培养。软琼脂平板法：下饲养/上融合C,分层培养后用法细胞分选仪法：流式细胞仪分选。8.单克隆抗体的制备、纯化：A 体外细胞株扩大培养，取上清液提纯。B 接种小鼠腹腔，取腹水提纯。C 纯化按抗体纯化步骤进行。9.细胞株冻存和复苏：加小牛血清或1640培养液配成终浓度10%的二甲亚砜(DMSO)冻存液后液氮(-196 )保存。原则是：慢冻(逐步降温，以每分钟降1为宜)，快融(立即浸入3740 水浴)。第9页

6、，此课件共91页哦10.注意事项：用降植烷(pristane)等油类制剂，反复注入BALB/C小鼠腹强腔，可诱发产生小鼠骨髓瘤细胞。这种细胞在适宜培养条件下，具有无限繁殖能力，选择本身不会产生Ig(SP2/O和小鼠骨髓瘤653细胞株)的对数期生长细胞作为融合细胞。选择缺乏HGPRT或TK的细胞：A 采用毒性药物8-氮鸟嘌呤(8-azaguanine,8-AG)选育出缺乏HGPRT的细胞(因为缺乏HGPRT+细胞利用8-AG后合成毒性核苷酸而死亡，只有HGPRT+细胞才能存活），培养过程中有个别细胞出现返祖现象，故应定期用1520ug/ml的 8-AG处理细胞。第10页，此课件共91页哦B 或利

7、用5-溴脱氧尿嘧啶(5-bromodeoxyuridine,BudR)诱发缺乏TK的细胞。一般选育缺乏TK的细胞较困难。采用饲养细胞：在体外培养条件下，单个或少数分散的细胞不易顺利生长繁殖。当加入一定量的其他活细胞后，常可促进原有细胞的繁殖，这种加入的细胞即称为饲养细胞，可用普通小鼠脾细胞/腹腔细胞/胸腺细胞、大鼠和豚鼠的腹腔细胞，最常用普通小鼠腹腔细胞。第11页，此课件共91页哦n三、典型制备单克隆抗体具体步骤三、典型制备单克隆抗体具体步骤n（一）细胞的选择与培养（一）细胞的选择与培养n（二）细胞融合试验（二）细胞融合试验n（三）单克隆抗体检测（三）单克隆抗体检测n（四）克隆化培养（四）克隆

8、化培养n（五）杂交瘤细胞的鉴定（五）杂交瘤细胞的鉴定n（六）单克隆抗体的制备（六）单克隆抗体的制备n（七）单克隆抗体的鉴定（七）单克隆抗体的鉴定n（八）单克隆抗体的纯化（八）单克隆抗体的纯化第12页，此课件共91页哦n四、单克隆抗体的应用四、单克隆抗体的应用1.诊断诊断(检测检测)试剂：病原体、肿瘤标志物、细胞表面标志等试剂：病原体、肿瘤标志物、细胞表面标志等2.治疗：治疗：A 移植物受者使用移植物受者使用T细胞的细胞的McAb，可预防急性排斥反应。，可预防急性排斥反应。B 供体骨髓在体外经供体骨髓在体外经T细胞的细胞的McAb处理，可减轻或消除移植物抗宿主反处理，可减轻或消除移植物抗宿主反应

9、。应。C AIDS治疗治疗D 肿瘤介入治疗：细胞毒剂肿瘤介入治疗：细胞毒剂(药物药物)与抗肿瘤抗原的与抗肿瘤抗原的McAb结合后，利用结合后，利用McAb的导向作用，将细胞毒剂的导向作用，将细胞毒剂(药物药物)定位于肿瘤细胞，到达直接杀定位于肿瘤细胞，到达直接杀死肿瘤细胞的目的。死肿瘤细胞的目的。第13页，此课件共91页哦第二节 外源基因在动物细胞中的表达n一、基本原理一、基本原理&基本技术基本技术n宿主宿主n载体载体n原件原件n转导转导第14页，此课件共91页哦n通俗地说，就是按照人们的意愿，把一种生物的个别基因复制出来，加以修饰改造，然后放到另一种生物的细胞里，定向改造生物的遗传性状。第1

10、5页，此课件共91页哦第16页，此课件共91页哦 基因重组与基因工程基因重组与基因工程(genetic recombination(genetic recombinationand genetic engineering)and genetic engineering)第17页，此课件共91页哦基因重组基因重组 是指在体外用酶学方法将不同来源的是指在体外用酶学方法将不同来源的DNADNA进行切割、连进行切割、连接，组成一个新的接，组成一个新的DNADNA分子的过程，又称分子的过程，又称DNADNA重组。重组。基因克隆基因克隆 将重组将重组DNADNA分子导入到合适的受体细胞中，使其扩增和分子导

11、入到合适的受体细胞中，使其扩增和繁殖，以获得大量的同一繁殖，以获得大量的同一DNADNA分子，称此为基因克隆、分子，称此为基因克隆、DNADNA克隆或分子克隆。克隆或分子克隆。基因工程基因工程 实现基因克隆所采用的方法和相关工作，统称为重组实现基因克隆所采用的方法和相关工作，统称为重组DNADNA技术或基因工程。技术或基因工程。第18页，此课件共91页哦 本章主要内容本章主要内容 重要的工具酶重要的工具酶 基因克隆常用的载体基因克隆常用的载体 重组重组DNADNA基本原理基本原理 重组技术在医学和制药重组技术在医学和制药 工业中的应用工业中的应用第19页，此课件共91页哦第一节第一节 重要的工

12、具酶重要的工具酶工工具酶具酶 基基因因工工程程中中的的工工具具酶酶主主要要是是指指用用于于DNADNA和和RNARNA分分子子的的切切割割、连连接接、聚聚合合、修修饰、饰、反转录等反转录等有关的各种酶有关的各种酶系系统统。第20页，此课件共91页哦一、限制性核酸内切酶一、限制性核酸内切酶(RE)(RE)是一类由细菌产生的能专一识别双链是一类由细菌产生的能专一识别双链DNA中的特定碱基中的特定碱基序列、并水解该点磷酸二酯键序列、并水解该点磷酸二酯键 的核酸内切酶，简称的核酸内切酶，简称限制酶限制酶或或切割酶切割酶。根据根据限制酶的限制酶的作用特性，一般分为三类：作用特性，一般分为三类：、和和型，

13、型，其中常用的是其中常用的是型限制酶型限制酶。第21页，此课件共91页哦 限制酶（限制酶（型）识别及切割位点型）识别及切割位点特异识别及切割特异识别及切割4 4 8 8个个bpbp长度且具有长度且具有回文序列回文序列的的DNADNA片断，片断，主要产生主要产生3 3种缺口：种缺口：5 5粘性末端粘性末端3 3粘性末端粘性末端平端或钝端平端或钝端回文序列回文序列是指该部位的核苷酸序列呈是指该部位的核苷酸序列呈180180O O旋转对称旋转对称;粘性末端粘性末端是指经内切酶特异切割后产生的是指经内切酶特异切割后产生的5 5末端突出或末端突出或3 3末端突出的碱基序列相互具有互补性末端突出的碱基序列

14、相互具有互补性。第22页，此课件共91页哦产生产生5-粘性末端粘性末端产生产生3-3-粘性末端粘性末端第23页，此课件共91页哦产生平产生平(头末头末)端端/钝端钝端其它特殊性质其它特殊性质的的型限制酶型限制酶同裂酶（同裂酶（异源同工酶异源同工酶）同尾酶同尾酶可变酶可变酶第24页，此课件共91页哦同裂酶同裂酶 又称异源同工酶。指来源不同，但具有又称异源同工酶。指来源不同，但具有相同的识相同的识别别序列序列。在切割在切割DNA时，其时，其切割点切割点可以是可以是相同相同的，产生的，产生平头末端，称为平头末端，称为同识同切同识同切；切割点切割点也可以是也可以是不同不同的，产生的，产生3或或55粘性

15、末端，粘性末端，称为称为同识异切同识异切。第25页，此课件共91页哦同裂酶同裂酶同识同识同同切切第26页，此课件共91页哦同裂酶同裂酶同识同识异异切切第27页，此课件共91页哦同同 尾尾 酶酶 同尾酶同尾酶指来源不同，但识别与切割顺序有一定的相关指来源不同，但识别与切割顺序有一定的相关性的一类酶。它们作用后性的一类酶。它们作用后产生相同产生相同的的粘性末端粘性末端。第28页，此课件共91页哦可变酶可变酶可变酶可变酶识别顺序中的一个或几个碱基是可变的，识别顺序中的一个或几个碱基是可变的，并且识别顺序往往超过并且识别顺序往往超过6个碱基对。个碱基对。如，如，Bstp，其识别顺序为，其识别顺序为GG

16、TNACC。第29页，此课件共91页哦 常用限制性核酸内切酶的特性微生物名称微生物名称酶名称酶名称识别顺序识别顺序同裂酶同裂酶同尾酶同尾酶Bacillus amyloliquefaciens H解淀粉芽孢杆菌解淀粉芽孢杆菌BamHGGATCCBstBgl MboBacillius globigil球芽孢杆菌球芽孢杆菌Bgl ACATCTEscherichia coli RY13大肠杆菌大肠杆菌EcoRGAATTCHaemophilus influenzae流感嗜血菌流感嗜血菌Hind AAGCTTHsuProvidencia stuartii 164普罗威登细菌普罗威登细菌PstCTGCAGS

17、alpStreptomyces albusSubspecies pathocidicus白色链球菌白色链球菌SalGTCGACAvaXho第30页，此课件共91页哦二、二、DNA聚合酶聚合酶（最常用的最常用的DNA聚合酶有以下聚合酶有以下4种种）DNA聚合酶聚合酶 DNA聚合酶聚合酶大片段大片段Klenow片段片段Taq DNA聚合酶聚合酶T4 噬菌体噬菌体DNA聚合酶聚合酶第31页，此课件共91页哦 DNA聚合酶聚合酶 E.Coli DNA聚合酶聚合酶（DNA pol）是一个具有是一个具有3 种酶活性的多功能性酶。种酶活性的多功能性酶。包括：包括：53DNA DNA 聚合酶活性聚合酶活性 5

18、3核酸外切酶活性核酸外切酶活性35核酸外切酶活性核酸外切酶活性第32页，此课件共91页哦DNA pol 应用应用催化催化DNA缺口平移反应，制备高比活性缺口平移反应，制备高比活性DNA 探针；探针；第二条第二条cDNA链的合成；链的合成；对对DNA3突出末端进行标记；突出末端进行标记；DNA序列分析。序列分析。第33页，此课件共91页哦E.coli DNA pol.催化切口平移第34页，此课件共91页哦KlenowKlenow片段（片段（DNApol.DNApol.大片断）大片断）第35页，此课件共91页哦 Klenow片段用途片段用途补齐双链补齐双链DNA的的 3末端；末端；用标记碱基补用标

19、记碱基补齐齐3末端末端；在在cDNAcDNA克隆中，克隆中，用于第二股链用于第二股链的合成；的合成；DNADNA序列分析。序列分析。第36页，此课件共91页哦 Taq DNA pol（耐热（耐热DNA聚合酶）聚合酶）作用特点作用特点1）Taq DNA pol催化催化DNA合成的最适温度范合成的最适温度范围围70 75，2）95以上高温，半小时不失活，以上高温，半小时不失活，3）最适合用于聚合酶链反应（最适合用于聚合酶链反应（PCR）。）。第37页，此课件共91页哦三、逆转录酶三、逆转录酶 特点特点逆转录酶是一个多功能性酶，至少具有以下逆转录酶是一个多功能性酶，至少具有以下3种酶种酶活性：活性：

20、以单链以单链RNA 为模板，为模板，催化合成催化合成cDNA单链单链具有具有RNase H 活性，能水解活性，能水解RNA:DNA杂交链中的杂交链中的RNA 以以DNA为模板，催化合成为模板，催化合成cDNA双链。双链。第38页，此课件共91页哦逆转录酶的应用：逆转录酶的应用：将将mRNA逆转录成逆转录成cDNA，构建，构建cDNA文库；文库；补平和标记补平和标记5-末端突出的末端突出的DNA片段；片段；代替代替Klenow酶用于酶用于DNA序列分析；序列分析；制备杂交探针等。制备杂交探针等。第39页，此课件共91页哦四、四、DNA连接酶连接酶(DNA ligase)DNADNA连连接接酶酶可

21、可以以 催催化化带带有有粘粘性性末末端端或或平平头头末末端端的的双双链链DNADNA中中一一条条链链的的3 3OHOH与与另另一一条条链链的的5 5POPO3 3H H2 2形形成成磷磷酸酸二酯键而相连，从而构成一条完整的二酯键而相连，从而构成一条完整的DNADNA长链。长链。DNADNA连接酶的用途连接酶的用途（1 1）两个双链两个双链DNADNA片段连接起来片段连接起来5-ACG AATTCGT-3 5-ACG AATTCGT-3 T T4 4DNADNA连接酶连接酶 5-ACGAATTCGT-3 5-ACGAATTCGT-33-TGCTTAA GCA-5 3-TGCTTAAGCA-53-

22、TGCTTAA GCA-5 3-TGCTTAAGCA-5（2 2）修补带有缺口的双链修补带有缺口的双链DNADNA分子分子T4DNA连接连接酶酶第40页，此课件共91页哦五、碱性磷酸酶五、碱性磷酸酶 碱性磷酸酶碱性磷酸酶(BAP)能够催化水解去除能够催化水解去除DNA或或RNA5-端端的磷酸基团。的磷酸基团。用途用途制备载体时，用碱性磷酸酶处理去除载体分子制备载体时，用碱性磷酸酶处理去除载体分子 5端端磷酸基后，可防止载体自身环化连接，提高重组效率。磷酸基后，可防止载体自身环化连接，提高重组效率。用用32P标记标记5-端前，去除端前，去除5-P，再通过激酶作用把放，再通过激酶作用把放射性核苷酸

23、加到射性核苷酸加到5-端进行标记。端进行标记。第41页，此课件共91页哦六、末端六、末端（脱氧核苷酸）转移酶（脱氧核苷酸）转移酶(TdT)作用作用 将将标标记记或或未未标标记记的的dNTPdNTP加加到到DNADNA的的3 3OHOH末末端端；也也可可催催化化载载体体分分子子或或待待克克隆隆的的DNADNA片片断断上上加上互补的同聚尾，便于进一步连接。加上互补的同聚尾，便于进一步连接。应用应用 探针标记探针标记 P32-.dGTPG32G32G32G32G32G32G32G32 在载体和待克隆的片段上形成同聚物尾，以便于进行连接在载体和待克隆的片段上形成同聚物尾，以便于进行连接第42页，此课件

24、共91页哦重要的工具酶重要的工具酶工具酶工具酶 活性活性 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶 识别特异序列，切割识别特异序列，切割DNADNAT4DNAT4DNA连接酶连接酶 催化催化DNA5DNA5-磷酸与磷酸与3 3-羟基羟基形成磷酸二酯键形成磷酸二酯键 DNADNA聚合酶聚合酶 以以DNADNA为模板合成为模板合成DNADNA逆转录酶逆转录酶 以以RNARNA为模板合成为模板合成DNADNA碱性磷酸酶碱性磷酸酶 切除末端磷酸切除末端磷酸T4T4多聚核苷酸激酶多聚核苷酸激酶 催化核酸催化核酸5-5-羟基磷酸化羟基磷酸化末端脱氧核苷酸转移酶末端脱氧核苷酸转移酶 催化催化3-3-端合成同聚体尾端

25、合成同聚体尾第43页，此课件共91页哦第二节第二节基因克隆常用的载体基因克隆常用的载体载体载体(vector)是将外源是将外源DNA(目的目的DNA)片断引入宿主细胞片断引入宿主细胞的运载工具，其化学本质为的运载工具，其化学本质为DNA。本节主要内容本节主要内容 载体必须具备的基本条件载体必须具备的基本条件 载体的种类载体的种类 常用的载体常用的载体第44页，此课件共91页哦一、载体必须具备的基本条件一、载体必须具备的基本条件有自身的有自身的复制子复制子，能独立复制，能独立复制具备多个限制酶的识别位点具备多个限制酶的识别位点(多克隆位点多克隆位点)具有具有遗传表型或遗传表型或筛选筛选标记标记有

26、有足够的容量足够的容量以容纳外源以容纳外源DNA片段。片段。表达型载体表达型载体还应具备与宿主细胞相适应的还应具备与宿主细胞相适应的启动启动 子、前导序列、增强子子、前导序列、增强子等调控元件。等调控元件。载体载体DNA中均有一段中均有一段非必需区非必需区，将外源基因插入，将外源基因插入 该非必需区，而载体本身不受影响。该非必需区，而载体本身不受影响。第45页，此课件共91页哦二、载体的种类二、载体的种类*（一）（一）克隆载体克隆载体用来克隆和扩增用来克隆和扩增DNA片段的载体，具有片段的载体，具有3点点共性共性：能够在受体细胞复制；能够在受体细胞复制；带有药物抗性基因，便于筛选；带有药物抗性

27、基因，便于筛选；可导入受体细胞。可导入受体细胞。（二）（二）表达载体表达载体除具有克隆载体所具有的性质外，还带有表达构件除具有克隆载体所具有的性质外，还带有表达构件转录和翻译所必须的转录和翻译所必须的DNA顺序。顺序。第46页，此课件共91页哦三、常用的载体三、常用的载体（一）（一）质粒质粒 (plasmid)(plasmid)：是存在于细菌染色体外的、能自主复制的双链环是存在于细菌染色体外的、能自主复制的双链环状状DNA分子。分子。作为克隆载体的质粒应具备以下特点：作为克隆载体的质粒应具备以下特点：1.分子量相对较小，能稳定存在于细菌体内，分子量相对较小，能稳定存在于细菌体内，有较高的拷贝数

28、有较高的拷贝数2.具有具有1个以上的遗传标志，便于筛选个以上的遗传标志，便于筛选3.具有多克隆位点具有多克隆位点第47页，此课件共91页哦 总而言之，质粒载体应该是一种分子量较小、总而言之，质粒载体应该是一种分子量较小、高拷贝的高拷贝的“松弛型松弛型”质粒，且具有一个以上遗传质粒，且具有一个以上遗传标志和多克隆位点的质粒。标志和多克隆位点的质粒。广泛应用的质粒：广泛应用的质粒：pBR32质粒、质粒、pUC系列等系列等第48页，此课件共91页哦 pBR322质粒质粒4363 bp 含一个复制点含一个复制点含一个抗氨卞青霉素标含一个抗氨卞青霉素标记记(ampR)一个抗四环素标记一个抗四环素标记(t

29、etR)ampR和和tetR基因内各有一基因内各有一些限制酶的酶切位点，供些限制酶的酶切位点，供外源基因插入外源基因插入当外原基因插入抗药基当外原基因插入抗药基因位点时，因位点时，AmpRAmp敏敏感感(AmpS)、TetRTet敏感敏感(TetS).第49页，此课件共91页哦pUC系列质粒系列质粒 由由pBR322和和M13噬噬菌菌体体构构建建而成的双链质粒载体；而成的双链质粒载体；（1）2674bp；（2）有有ampr和与和与M13噬菌体噬菌体相同的多克隆位点（相同的多克隆位点（MCS）（3）有有一一个个来来自自大大肠肠杆杆菌菌的的LacZ操操纵纵子子的的DNA片片断断,编编码码半乳糖苷酶

30、半乳糖苷酶第50页，此课件共91页哦(二二)噬菌体噬菌体组成特点组成特点：双链线状双链线状DNADNA分子，分子，全长全长50kb50kb，含含6565个基因，个基因，在其分子两端各含有在其分子两端各含有1212个碱基的互补单链，是天然个碱基的互补单链，是天然的粘性末端，被称为的粘性末端，被称为COSCOS位点。位点。第51页，此课件共91页哦噬菌体感染细菌后的溶菌性生长和溶源性生长噬菌体感染细菌后的溶菌性生长和溶源性生长溶菌性生长（溶菌性生长（lytic pathway）噬噬菌菌体体感感染染细细菌菌后后，借借助助其其2个个COS位位点点互互补补成成环环，在在宿宿主主菌菌体体内内连连续续复复制

31、制，合合成成大大量量基基因因产产物物，进进而而装装配配成成噬噬菌菌体体颗颗粒粒，裂裂解解宿宿主主菌菌，释放出来的噬菌体又可感染其他细菌。，释放出来的噬菌体又可感染其他细菌。溶源性生长溶源性生长(lysogenic pathway)噬噬菌菌体体感感染染细细菌菌后后，可可将将自自身身DNA整整合合到到细细菌菌的的染染色色体体中中去去，与与之之一起复制一起复制，并遗传给子代细胞，宿主细胞不被裂解，并遗传给子代细胞，宿主细胞不被裂解。第52页，此课件共91页哦 噬菌体两种生长途径（示意图）噬菌体两种生长途径（示意图）第53页，此课件共91页哦第三节第三节重组重组DNA基本原理基本原理（DNA重组基本程

32、序包括下列过程）重组基本程序包括下列过程）分分获取目的基因和载体获取目的基因和载体接接目的基因与载体的连接目的基因与载体的连接转转重组重组DNA导入宿主细胞导入宿主细胞筛筛重组重组DNA的筛选与鉴定的筛选与鉴定第54页，此课件共91页哦1 1、获取、获取 DNADNA重组基本过程重组基本过程第55页，此课件共91页哦2 2、重组、重组第56页，此课件共91页哦3 3、转化、转化第57页，此课件共91页哦4 4、筛选、筛选第58页，此课件共91页哦5 5、克隆、克隆第59页，此课件共91页哦6 6、表达、表达表达产物分离纯化表达产物分离纯化第60页，此课件共91页哦一、目的基因的获取（一、目的基

33、因的获取（分分）目的基因目的基因 是是指指所所要要研研究究或或应应用用的的基基因因，也也是是需需要要克克隆或表达的基因。隆或表达的基因。目的基因来源目的基因来源1）制备基因组制备基因组DNA 2）制备制备cDNA 3）聚合酶链反应聚合酶链反应4）人工合成基因人工合成基因第61页，此课件共91页哦（一）制备基因组（一）制备基因组DNADNA（基因（基因文库）文库）分离、纯化基因组分离、纯化基因组DNADNA条件：条件：温和，在温和，在EDTAEDTA或或SDSSDS等存在下等存在下RERE用蛋白酶用蛋白酶K K消化细胞、酚抽提消化细胞、酚抽提大小不同酶切片段大小不同酶切片段片段分离：片段分离：常

34、用蔗糖梯度或电泳分离常用蔗糖梯度或电泳分离分别与同样分别与同样RERE消化的载体连接消化的载体连接常用噬菌体载体或质粒载体常用噬菌体载体或质粒载体DNADNA连接酶连接。连接酶连接。导入细胞导入细胞进入宿主细胞内培养扩增。进入宿主细胞内培养扩增。筛选鉴定筛选鉴定用分子杂交、凝胶电泳用分子杂交、凝胶电泳等方法鉴定。等方法鉴定。第62页，此课件共91页哦（二）制备（二）制备cDNA（cDNA文库）文库）（1 1）合成）合成cDNAcDNA第一条链第一条链 反应体系只有反应体系只有mRNAmRNA、逆转录酶、逆转录酶、4 4种种dNTPdNTP、引物。、引物。引物是与引物是与mRNA3mRNA3端端

35、 polyA polyA互补的寡聚互补的寡聚dTdT（121218dT18dT片段）片段）（2 2）合成）合成cDNAcDNA第二条链第二条链 RNase RNase去掉模板去掉模板mRNAmRNA（3 3）构建）构建cDNAcDNA文库文库cDNAcDNA两端加接头或衔接头两端加接头或衔接头接头接头是人工合成的双链寡核苷酸两端平头，含有限制酶切位点。是人工合成的双链寡核苷酸两端平头，含有限制酶切位点。衔接头衔接头是另一种人工合成的双链寡核苷酸一端平头，另一端为粘性末端。是另一种人工合成的双链寡核苷酸一端平头，另一端为粘性末端。cDNAcDNA与载体相连。与载体相连。导入宿主细胞进行克隆，这些

36、菌体内保存导入宿主细胞进行克隆，这些菌体内保存cDNAcDNA集合体便是集合体便是cDNAcDNA文库。文库。第63页，此课件共91页哦（二）制备（二）制备cDNA（cDNA文库）文库）分离目的基因分离目的基因的的mRNAmRNA逆转录生成逆转录生成cDNAcDNA单链单链水解去除水解去除mRNAmRNA，合成合成cDNAcDNA双链双链 水解回折处单链水解回折处单链得到平端双链得到平端双链cDNAcDNA导入宿主细胞克隆导入宿主细胞克隆,构建构建cDNAcDNA文库文库第64页，此课件共91页哦（三）聚合酶链反应（三）聚合酶链反应(PCR)在模板在模板DNADNA、引物、引物、dNTPdNT

37、P、TaqDNATaqDNA聚合酶等条件下，体外聚合酶等条件下，体外经经9494变性、变性、5454退火及退火及7272延伸延伸3 3个步骤的反复多次循环个步骤的反复多次循环（2525 3030次次），扩增目的基因（见），扩增目的基因（见1818章）。章）。（四）人工合成基因（四）人工合成基因 引引用用DNADNA测测序序仪仪测测出出某某一一基基因因的的碱碱基基序序列列，或或根根据据某某一一蛋蛋白白质质的的氨氨基基酸酸组组成成反反推推核核苷苷酸酸序序列列，再再用用DNADNA合合成成仪仪通过化学合成原理合成目的基因。通过化学合成原理合成目的基因。一般先合成短片断一般先合成短片断DNADNA，然

38、后再拼接成长片段。，然后再拼接成长片段。第65页，此课件共91页哦二、二、目的基因与载体的连接（目的基因与载体的连接（接接）（主要有以下（主要有以下4 4种连接方式）种连接方式）1)1)粘性末端连接粘性末端连接22）平头末端连接平头末端连接33）人工接头法人工接头法44）同源多聚尾连接法同源多聚尾连接法第66页，此课件共91页哦 （一）（一）粘性末端连接粘性末端连接将目的基因和载体用同一种限制酶酶切，产生将目的基因和载体用同一种限制酶酶切，产生相同粘性末端，再通过相同粘性末端，再通过DNA连接酶作用将两者连接起来，连接酶作用将两者连接起来，构成重组构成重组DNA分子。分子。（二）平头末端连接（

39、二）平头末端连接某些限制酶只能将目的基因和载体某些限制酶只能将目的基因和载体DNA切割成切割成平端，此时在平端，此时在T4DNA连接酶的作用下同样能连接起连接酶的作用下同样能连接起来。来。第67页，此课件共91页哦（三）（三）人工接头法人工接头法合成连接子合成连接子与与DNADNA平头末端连接平头末端连接限制酶切割限制酶切割,产生产生粘性末端粘性末端连接，构建重组连接，构建重组DNADNA。第68页，此课件共91页哦（四四）同同源源多多聚聚尾尾连连接接法法第69页，此课件共91页哦三、重组三、重组DNA导入宿主细胞（导入宿主细胞（转转）无性繁殖无性繁殖 体体外外重重组组后后的的DNADNA导导

40、入入受受体体细细胞胞，形形成成转转化化子子。然然后后随随受受体体细细胞胞生生长长、增增殖殖，使使重重组组DNADNA发发生生复复制制、扩扩增增，这这一过程称为无性繁殖。一过程称为无性繁殖。克隆克隆 从从上上述述无无性性繁繁殖殖细细胞胞中中进进一一步步筛筛选选出出含含目目的的DNADNA的的重重组组体体分分子即为无性繁殖系或克隆。子即为无性繁殖系或克隆。宿主细胞宿主细胞进行无性繁殖时所采用的受体细胞进行无性繁殖时所采用的受体细胞.第70页，此课件共91页哦 重组重组DNADNA导入宿主细胞的类型导入宿主细胞的类型转化转化以以质粒质粒作载体构建的重组体导入受体细胞的过程；作载体构建的重组体导入受体

41、细胞的过程；转染转染以病毒以病毒作载体构建的重组体导入受体细胞的过程；作载体构建的重组体导入受体细胞的过程；转导转导以以噬菌体噬菌体作载体构建的重组体导入受体细胞的过程作载体构建的重组体导入受体细胞的过程。感受态细胞感受态细胞 用特殊方法处理后，受体细胞才具备接受外源用特殊方法处理后，受体细胞才具备接受外源DNA的能力，的能力，这种细胞称这种细胞称感受态细胞感受态细胞。感受态细胞有原核细胞和真核细胞两大类。感受态细胞有原核细胞和真核细胞两大类。第71页，此课件共91页哦 四、重组四、重组DNA的筛选与鉴定（的筛选与鉴定（筛筛）（筛选含重组体的阳性菌落，一般有下列几种方法筛选含重组体的阳性菌落，

42、一般有下列几种方法）1）平板筛选平板筛选 2）限制酶切图谱筛选限制酶切图谱筛选 3）PCR筛选重组体筛选重组体 4）原位杂交技术原位杂交技术插入失活插入失活蓝白筛选蓝白筛选第72页，此课件共91页哦（一）（一）平板筛选平板筛选 是指利用载体的遗传性标记直接筛选的方法。如，具有抗药性标记的载体，转化宿主细胞后，能在含抗生素（Amp或Tet）的培养平板上生长；未转化的则不能生长。1.插入失活 当外源DNA序列插入质粒中某一抗药基因内，使该基因失活，转化细胞就不能生长在含相应抗生素的培养平板上。第73页，此课件共91页哦 抗生素平板筛选抗生素平板筛选（插入失活插入失活）第74页，此课件共91页哦（2

43、 2）蓝蓝-白白筛选筛选它是一种利用蓝色化合物的形成作为指示剂的筛选方法，筛选含有编码它是一种利用蓝色化合物的形成作为指示剂的筛选方法，筛选含有编码-半乳糖苷酶的基因。半乳糖苷酶的基因。载体：载体：编码编码-半乳糖半乳糖宿主：宿主：编码编码-半乳糖半乳糖 苷酶苷酶N端端序列序列 苷酶苷酶C C端端序列序列-互补互补细菌表达：细菌表达：-半乳糖苷酶活性蛋白半乳糖苷酶活性蛋白5-5-溴溴-4-4-氯氯-3-3-吲哚（吲哚（X-gal）形成形成蓝色菌落蓝色菌落当在质粒中插入外源当在质粒中插入外源DNA-DNA-半乳糖苷酶的半乳糖苷酶的N N端基因失活端基因失活不能与宿主不能与宿主-半乳糖苷酶的半乳糖

44、苷酶的C端端进行进行-互互补补产生产生白色菌落白色菌落。（IPTG 存在下）存在下）第75页，此课件共91页哦蓝蓝白白筛选筛选示意图示意图第76页，此课件共91页哦2.限制性内切酶图谱鉴限制性内切酶图谱鉴第77页，此课件共91页哦3.PCR3.PCR筛选重组体筛选重组体抽提少量重组抽提少量重组DNADNAPCRPCR扩增扩增电泳鉴定电泳鉴定序列分析。序列分析。4.4.原位杂交技术原位杂交技术第78页，此课件共91页哦 五、重组体在宿主细胞中的表达和调控五、重组体在宿主细胞中的表达和调控 基因工程的最终目的是通过载体将外源基因导入合适基因工程的最终目的是通过载体将外源基因导入合适的宿主细胞中高效

45、表达，产生有重要价值的蛋白质产品。的宿主细胞中高效表达，产生有重要价值的蛋白质产品。克隆基因表达有三个条件克隆基因表达有三个条件基因的编码区不能被插入序列所中断基因的编码区不能被插入序列所中断;基因转录要有启动子，而启动子必须能被宿主基因转录要有启动子，而启动子必须能被宿主细胞的细胞的RNA聚合酶有效地识别聚合酶有效地识别;mRNA必须相当稳定，并有效地被翻译，产生的外必须相当稳定，并有效地被翻译，产生的外源蛋白质必须不为宿主细胞的蛋白酶所降解。源蛋白质必须不为宿主细胞的蛋白酶所降解。第79页，此课件共91页哦第四节第四节 重组技术在医学和制药工业中的应用重组技术在医学和制药工业中的应用 一、

46、疾病基因的发现一、疾病基因的发现19901990年年美国科学家首先启动美国科学家首先启动人类基因组计划（人类基因组计划（HGPHGP），），计划历时计划历时1515年，至年，至20052005年完成；年完成；20012001年年2 2月月1212日日由由SinceSince和和NatureNature杂志同时向世界宣布，杂志同时向世界宣布，人类基因组人类基因组3X103X109 9bpbp的最新图谱，约含的最新图谱，约含3 3 4 4万个基因；万个基因；整个人类基因组的全部核苷酸序列不久即将完成。整个人类基因组的全部核苷酸序列不久即将完成。但要揭示人类但要揭示人类4 4万个基因功能的任务将更为

47、艰巨。万个基因功能的任务将更为艰巨。第80页，此课件共91页哦 人类基因组图谱的初步完成，不仅为全部基因的人类基因组图谱的初步完成，不仅为全部基因的定位建立了一个开放框架，而且为分离、鉴定人类疾病定位建立了一个开放框架，而且为分离、鉴定人类疾病相关基因提供了参照模板。相关基因提供了参照模板。如，已知人类遗传性疾病约有如，已知人类遗传性疾病约有30003000种，推测可能是种，推测可能是由于某些基因结构异常或基因位移等突变所致。如果利由于某些基因结构异常或基因位移等突变所致。如果利用分子生物学技术，将患者疾病基因与正常基因图谱作用分子生物学技术，将患者疾病基因与正常基因图谱作对照分析，必将有助于

48、阐明遗传病的分子机制，这对遗对照分析，必将有助于阐明遗传病的分子机制，这对遗传病的基因治疗将起到不可估量的推动作用。传病的基因治疗将起到不可估量的推动作用。第81页，此课件共91页哦 产品名称产品名称治疗功能与医药范围治疗功能与医药范围1.人胰岛素人胰岛素治疗糖尿病治疗糖尿病2.人生长激素人生长激素治疗侏儒症，加速创口愈合治疗侏儒症，加速创口愈合 3.干扰素干扰素治疗癌症、病毒感染治疗癌症、病毒感染4.干扰素干扰素治疗带状疱疹，眼结、角膜炎治疗带状疱疹，眼结、角膜炎5.干扰素干扰素治疗癌症、病毒感染治疗癌症、病毒感染6.人组织纤溶酶原激活因子人组织纤溶酶原激活因子(tPA)溶解血栓，治疗急性心

49、肌梗塞溶解血栓，治疗急性心肌梗塞7.红细胞生成素红细胞生成素(Epo)治疗肾病性贫血，增加红细胞及血色素水平治疗肾病性贫血，增加红细胞及血色素水平8.超氧化物歧化酶超氧化物歧化酶清除超氧化物，治疗关节炎，缓解心肌坏死清除超氧化物，治疗关节炎，缓解心肌坏死9.凝血因子凝血因子 治疗治疗A型血友病型血友病10.乙型肝炎疫苗乙型肝炎疫苗防治肝炎防治肝炎11.神经生长因子神经生长因子维持神经元细胞存活、生长和分化维持神经元细胞存活、生长和分化12.脑啡肤脑啡肤镇痛镇痛13.降钙素降钙素治疗骨质疏松症治疗骨质疏松症二、二、生产蛋白质和多肽类活性物质生产蛋白质和多肽类活性物质第82页，此课件共91页哦 基

50、因工程生产胰岛素的原理（示意图）基因工程生产胰岛素的原理（示意图）第83页，此课件共91页哦三、制备基因工程疫苗三、制备基因工程疫苗 基因工程疫苗可以帮助解决传统技术难以解决的基因工程疫苗可以帮助解决传统技术难以解决的一些特殊的病原体疫苗。一些特殊的病原体疫苗。如如，（1 1）乙型肝炎病毒疫苗（乙型肝炎病毒疫苗（HBVHBV）、丙型肝炎病毒疫）、丙型肝炎病毒疫苗（苗（HCVHCV）等；）等；（2 2）有诱发致癌或产生免疫病理作用的疫苗，如人有诱发致癌或产生免疫病理作用的疫苗，如人TT细胞免疫缺陷病毒（细胞免疫缺陷病毒（HITV-1HITV-1）等；）等；（3 3）常规效果较差的疫苗，如霍乱和痢