CH蛋白质组与蛋白质组学.pptx

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1、主要内容 一、蛋白质组的基本概念和历史 二、蛋白质组的特征 三、蛋白质组与基因组的关系 四、蛋白质组的研究技术和研究策略第二章 蛋白质组与蛋白质组学第1页/共57页 1、蛋白质组和蛋白质组学 蛋白质组是澳大利亚学者Williams 和 Wilkins于1994年首先提出。“Proteome”源于蛋白质(Protein)和基因组(genome)两个词的结合，用于表示一种细胞、组织或生物个体所能表达出来的所有蛋白质。蛋白质组是一个基因组所能表达出来的所有蛋白质构成的整体，不是局限于一个或几个蛋白质。同一基因组在不同细胞、不同组织中的表达情况各不相同。一、蛋白质组的基本概念和历史第2页/共57页 蛋

2、白质组学蛋白质组学(proteomics)(proteomics)是研究蛋白质组成及其功能网络的科学。是研究蛋白质组成及其功能网络的科学。一般认为蛋白质组学是研究蛋白质组或应用大规模蛋白质分离和识别技术研究蛋白质组的一门学科，是对基因组所表达的整套蛋白质的分析。Proteomics Proteomics 通过对细胞内蛋白质组成种类、丰度、功能变化及与细通过对细胞内蛋白质组成种类、丰度、功能变化及与细胞或生物个体机能变化相互联系的分析，揭示细胞或生物生命活动规律。胞或生物个体机能变化相互联系的分析，揭示细胞或生物生命活动规律。主要研究内容：主要研究内容：表达蛋白质组学 特定的细胞、组织或器官合成

3、的蛋白质种类、丰度特定的细胞、组织或器官合成的蛋白质种类、丰度及功能及功能，关键技术 2-D电泳等。一、蛋白质组的基本概念和历史第3页/共57页一、蛋白质组的基本概念和历史 结构蛋白质组学 蛋白质的序列和高级结构，X-射线单晶衍射分析（晶体结构分析）、多维核磁共振波谱分析、电镜二维晶体三维重构术（电子晶体学）。细胞图谱蛋白质组学 蛋白质的胞内分布及移位，确定蛋白质在亚细胞结构中的位置，通过纯化细胞器或用质谱仪鉴定蛋白复合物组成等。功能蛋白质组学 蛋白质的功能模式，蛋白质与蛋白质及其与其他分子的相互作用。第4页/共57页 2、蛋白质组研究简况 1975年，首先由OFarrell等创立Two-di

4、mensional electrophoresis。1997 年 Wilkins,M.and Williams 提出了蛋白质组的概念。1997年召开了第一次国际“蛋白质组学”会议。1999年1月在英国伦敦举行了应用蛋白质组会议。我国也于1998年启动了蛋白质组学研究，在中科院上海生物化学研究所举办了两次全国性的蛋白质组学研讨会。一、蛋白质组的基本概念和历史第5页/共57页 2003 2003年成立了中国人类蛋白质组组织（年成立了中国人类蛋白质组组织（CHHUPOCHHUPO）。）。20032003年年9 9月、月、20042004年年8 8月以及月以及20052005年年8 8月召开了中国蛋白

5、质组学首届、第二届及第三届学术大会。月召开了中国蛋白质组学首届、第二届及第三届学术大会。20042004年年1010月在中国北京召开了第三届国际蛋白质组学会议。月在中国北京召开了第三届国际蛋白质组学会议。科技部已将疾病蛋白质组研究列入我国科技部已将疾病蛋白质组研究列入我国“973”973”计划项目和计划项目和“863”863”计划项目；国家自然科学基金委员会计划项目；国家自然科学基金委员会也将也将“蛋白质组研究蛋白质组研究”列为重点项目。我国在鼻咽癌、白血病、肝癌和肺癌蛋白质组研究方面取得了较大的进列为重点项目。我国在鼻咽癌、白血病、肝癌和肺癌蛋白质组研究方面取得了较大的进展。展。一、蛋白质组

6、的基本概念和历史第6页/共57页 3.Why is proteomics necessary Displaying and studying the products of genes directly is an attractive way of studying disease and complex problem in biology The study of gene expression can also be attempted at the level of mRNA(microarray.)However (1)You can have a protein in the c

7、ell when its mRNA is no longer present;(2)You can have lots of mRNA without translation of the message to protein;一、蛋白质组的基本概念和历史第7页/共57页 (3)No good correlation between mRNA abudence and protein amout in a cell at a given time;(4)Protein post-translational modification;(5)Protein subcellular location

8、.Proteomics directly contributes to Annotation of genome.一、蛋白质组的基本概念和历史第8页/共57页 蛋白质的“四维”研究 特定的时间：合成与降解 特定的空间：区域性与运动性 Dynamic Proteomics(动态蛋白质组学)动态表达、动态组成、动态定位、动态关系 动态表达：通过对疾病发生,发展,预后过程中的蛋白质差异谱构建,跟踪关键蛋白质在疾病不同时期动态表达。蛋白质表达量的差异是功能变化的基础之一。二、蛋白质组的特征第9页/共57页 动态组成：蛋白质翻译后修饰,如磷酸化，糖基化,乙酰化等的大规模分析和监测。蛋白质翻译后修饰增加蛋

9、白质的复杂性，信号传递的方式。动态定位：亚细胞蛋白质组分析及定位，与功能相关的蛋白质空间动态变化分析。定位变化导致相互作用的改变，蛋白质群功能改变。动态关系：蛋白质功能复合物，蛋白质-蛋白质作用网络，蛋白质与小分子配体相互作用分析。不同的蛋白质群及其结构发挥不同的功能。二、蛋白质组的特征第10页/共57页 蛋白质组的确定蛋白质组的确定？1 1，蛋白质组的完整性：，蛋白质组的完整性：基因组内基因（或基因组内基因（或ORFORF）数量？）数量？基因表达？基因表达？2 2，蛋白质组的测定：，蛋白质组的测定：修饰蛋白质的判据？修饰蛋白质的判据？蛋白质的动态变化（降解或转运）？蛋白质的动态变化（降解或转

10、运）？二、蛋白质组的特征第11页/共57页Relational Query ToolsSequence databasesGenomeWhat could happenGene ExpressiondatabasesTranscriptome+What would happenProtein ExpressiondatabasesProteome+What is happening三、蛋白质组与基因组的关系第12页/共57页 （一）蛋白质组研究技术的复杂性 具有比基因组学研究更高的复杂性：20种化学和物理性质不同的氨基酸。蛋白质量的动态差别（106）。蛋白质的不稳定性。蛋白质修饰的多样性和复杂

11、性。四、蛋白质组的研究技术和研究策略第13页/共57页（一）蛋白质组研究技术的复杂性第14页/共57页 1、基于二维电泳-质谱技术的蛋白质组研究 2、基于液相色谱（电泳）-质谱技术的蛋白质组研究 液相电泳-质谱技术 液相色谱-质联用技术 同位素亲和标签技术(isotope-coded affinity tages,ICAT)3、蛋白质芯片（二）蛋白质组学的主要研究方法第15页/共57页 Two-dimensional Electrophoresis(2-DE)1st dimension:isoelectric focusing(IEF)proteins are separated in a p

12、H gradient until reach a stationary position where their net charge is zero.The pH at which a protein has zero net charge is called isoelectric point(pI).2nd dimension:SDS-PAGE Proteins are separated according their molecular weight(Mr)（二）蛋白质组学的主要研究方法第16页/共57页1980sThe introduction of immobilised pH

13、gradient(IPG)eliminlated the problem of gradient instability and poor sample loading capacityImmobilised pH gradient(IPG)pH gradient(ampholyte)is co-polymerised with the acrylamide gel matrix to form completely stable gradients.The commercial precast IPG stripes is available in various pH ranges(3-1

14、0,4-7.).（二）蛋白质组学的主要研究方法第17页/共57页2-DE is the only method currently available which iscapable of simultaneously separating thousands of proteins（二）蛋白质组学的主要研究方法第18页/共57页Cell cultureProtein extraction2-DESilver stainingImage analysisScanning（二）蛋白质组学的主要研究方法第19页/共57页第20页/共57页+pH 3pH 7.5pH 10+pH 3pH 7.5pH

15、10+pH 3pH 7.5pH 10+pH 3pH 7.5pH 10The 1st D:Isoelectric Focusing（二）蛋白质组学的主要研究方法第21页/共57页+pH 3pH 7.5pH10pH 3.0pH 7.5pH10电荷分子量2-D 理论（二）蛋白质组学的主要研究方法第22页/共57页主机PROTEAN IEF Cell7cm,11cm,17cm水化盘各25个,每个可做1-12个胶条矿物油7cm,11cm,17cm高通量聚焦槽各一个,每个聚焦槽可做1-12个胶条镊子、小刷子另可加配备24cm聚焦槽和杯上样聚焦槽（1-12个胶条）（二）蛋白质组学的主要研究方法第23页/共5

16、7页低通量（低通量（1-21-2块胶）用于一般分析实验块胶）用于一般分析实验高通量（高通量（1-121-12块胶）用于大规模蛋白质组实验块胶）用于大规模蛋白质组实验Mini PROTEAN3 (7cm)CriterionTM Cell(11cm)PROTEAN II XL Cell (17,18cm)Mini PROTEAN3 Dodeca(7cm)CriterionTM Dodeca Cell(11cm)PROTEAN Plus Dodeca(17,18,24cm)第二向第二向SDS PAGESDS PAGE（二）蛋白质组学的主要研究方法第24页/共57页2-D 胶分析分析软件胶分析分析软件

17、全自动点检测和定量分全自动点检测和定量分析，可同时进行析，可同时进行100100块块以上胶的分析，数据库以上胶的分析，数据库对胶的数目没有限制，对胶的数目没有限制，可进行统计分析，可对可进行统计分析，可对每组胶进行差异表达分每组胶进行差异表达分析，蛋白进行注释和索析，蛋白进行注释和索引。引。（二）蛋白质组学的主要研究方法第25页/共57页pIM.Wt.（二）蛋白质组学的主要研究方法第26页/共57页Differential AnalysisProteins fromcultured human cellsA=Derivative of B AB（二）蛋白质组学的主要研究方法第27页/共57页A

18、BE.Coli grown at 30 CE.Coli grown at 42 CDifferential Expression Differential Expression（二）蛋白质组学的主要研究方法第28页/共57页 荧光差异染色荧光差异染色 利用两种不同的荧光染料如利用两种不同的荧光染料如Cy3Cy3（绿光）和（绿光）和Cy5Cy5（红光）分别对从对照（红光）分别对从对照和处理材料提取的蛋白质进行标记、混合、混合样品进行蛋白质双向电泳分和处理材料提取的蛋白质进行标记、混合、混合样品进行蛋白质双向电泳分离，分别以两种不同的激光去激发扫描生成两种不同的彩色图像，然后再将离，分别以两种不同

19、的激光去激发扫描生成两种不同的彩色图像，然后再将两者叠加，根据电泳斑点所形成的颜色判断蛋白质的代谢变化。两者叠加，根据电泳斑点所形成的颜色判断蛋白质的代谢变化。黄色：没有差异黄色：没有差异 红色：上调红色：上调 绿色：下调绿色：下调（二）蛋白质组学的主要研究方法第29页/共57页（二）蛋白质组学的主要研究方法第30页/共57页 2-DE技术的缺点：技术的缺点：极极酸酸、极极碱碱性性蛋蛋白白质质，疏疏水水性性蛋蛋白白质质，分分子子量量极极大大极极小小蛋蛋白白质质以以及及低低丰度蛋白质用此种技术难于有效分离。丰度蛋白质用此种技术难于有效分离。胶内酶解过程费时、费力，难于与质谱联用实现自动化。胶内酶

20、解过程费时、费力，难于与质谱联用实现自动化。液相色谱法液相色谱法(liquidchromatography，LC);毛细管电泳毛细管电泳(capillaryelectrophoresis，CE);液质联用技术（液质联用技术（LC-MS/MS）.（二）蛋白质组学的主要研究方法第31页/共57页同位素标记亲和标签方法同位素标记亲和标签方法 Aebersold Aebersold 和其合作者建立的一种和其合作者建立的一种同位素标记亲和标签试剂同位素标记亲和标签试剂(isotopically coded affinity tag(isotopically coded affinity tag，ICAT

21、)ICAT)差异蛋白鉴定方法。差异蛋白鉴定方法。ICATICAT试剂的结构包含一个试剂的结构包含一个生物素头部生物素头部、一个、一个连接部分连接部分和一个碘激活的和一个碘激活的羰基基团羰基基团，其中羰基基团能够特异性地与肽链中的半胱氨酸侧链反应，借，其中羰基基团能够特异性地与肽链中的半胱氨酸侧链反应，借助于生物素亲和标记将其抽提出来。助于生物素亲和标记将其抽提出来。重同位素的形态与轻同位素的形态的差别相当于在连接区部分的重同位素的形态与轻同位素的形态的差别相当于在连接区部分的8 8个氢个氢原子被原子被8 8个氘原子取代。个氘原子取代。（二）蛋白质组学的主要研究方法第32页/共57页（二）蛋白质

22、组学的主要研究方法同位素标记亲和标签方法第33页/共57页 （1 1）两个蛋白质样品）两个蛋白质样品(细胞状态细胞状态I I和细胞状态和细胞状态)分别单独用分别单独用d0ICATd0ICAT和和d8ICATd8ICAT试剂标记；试剂标记；（2 2）混合、胰蛋白酶水解；）混合、胰蛋白酶水解；（3 3）肽混合物用生物素）肽混合物用生物素亲和色谱柱分析，含半胱氨酸残基肽被结合在柱上；亲和色谱柱分析，含半胱氨酸残基肽被结合在柱上；（4 4）洗脱、串联质谱检测定量。）洗脱、串联质谱检测定量。一对不同标记的肽几乎在相同的时间洗脱，可以通过两个距离为一对不同标记的肽几乎在相同的时间洗脱，可以通过两个距离为8

23、 Da8 Da的质谱信号识别出来。的质谱信号识别出来。参考文献：参考文献：同位素亲和标签同位素亲和标签(ICAT)(ICAT)系列技术及其在蛋白质组研究中的应用系列技术及其在蛋白质组研究中的应用（二）蛋白质组学的主要研究方法第34页/共57页蛋白芯片(protein chip)技术（二）蛋白质组学的主要研究方法第35页/共57页 （1）点样：未经处理的样品(如血清，尿液等)直接点在芯片上，根据芯片表面不同的化学或生物特性结合相应的蛋白质；（2）冲洗：洗去芯片上结合的非蛋白组份；（3）加上能量吸收分子溶液：在芯片表面形成含有分析物和大量能量吸收分子“晶体”；（4）激光解吸电离法(SELDI)：将

24、保留在芯片上的蛋白质洗脱下来；（5）质谱分析：电离的蛋白质可以通过飞行时间质谱仪精确地测定它们的质量。（二）蛋白质组学的主要研究方法第36页/共57页High Vacuum SystemInletIon SourceMass FilterDetectorData SystemMass Spectrometry（三）质谱在蛋白质鉴定中的应用第37页/共57页第38页/共57页TOF-MS instrument with a single acceleration stageFEq F=ma a=Eq/m（三）质谱在蛋白质鉴定中的应用第39页/共57页（三）质谱在蛋白质鉴定中的应用第40页/共57

25、页 肽质量纹鉴定法肽质量纹鉴定法 Peptide Mass Fingerprinting(PMFPeptide Mass Fingerprinting(PMF）是目前蛋白质组研究中较为）是目前蛋白质组研究中较为常用的鉴定方法这一技术于常用的鉴定方法这一技术于19931993年被多个研究小组分别独立提出。年被多个研究小组分别独立提出。肽质量指纹鉴定的依据：第一种蛋白质都有特定的氨基酸序列，被特肽质量指纹鉴定的依据：第一种蛋白质都有特定的氨基酸序列，被特定的蛋白质酶水解可以得到一套特定肽链片断（肽片段质量图谱）定的蛋白质酶水解可以得到一套特定肽链片断（肽片段质量图谱）。由于。由于每种蛋白质的氨基酸

26、序列都不同，蛋白质被酶水解后，产生的肽片段序列每种蛋白质的氨基酸序列都不同，蛋白质被酶水解后，产生的肽片段序列也各不相同，肽片段质量图谱可用于蛋白质的鉴定。也各不相同，肽片段质量图谱可用于蛋白质的鉴定。（三）质谱在蛋白质鉴定中的应用第41页/共57页由于在由于在ESI条件下待分析物可能带上一个或多个电荷，而条件下待分析物可能带上一个或多个电荷，而MALDI-TOF(Matrix-AssistedLaserDesorptionIonizationTimeofFlightMassSpectrometry,基质辅助激光解析电离飞行时间质谱基质辅助激光解析电离飞行时间质谱)分析中的离分析中的离子一般只

27、带一个电荷，比较容易计算。另外，由于子一般只带一个电荷，比较容易计算。另外，由于MALDI-TOF质谱仪产质谱仪产生的质谱图精度较高，而由生的质谱图精度较高，而由ESI质谱仪产生的质谱图精度相对较低。质谱仪产生的质谱图精度相对较低。目前一级质谱鉴定蛋白质的算法（肽质量纹）主要用在目前一级质谱鉴定蛋白质的算法（肽质量纹）主要用在MALDI-TOF产生的质谱图上。多肽质量纹一般都是在产生的质谱图上。多肽质量纹一般都是在MALDI-TOF仪器的结果上进行。仪器的结果上进行。（三）质谱在蛋白质鉴定中的应用第42页/共57页Bovine Carbonic anhydraseand human Hsp70

28、s protein（一级质谱）（三）质谱在蛋白质鉴定中的应用第43页/共57页（三）质谱在蛋白质鉴定中的应用第44页/共57页 PMF PMF中的问题中的问题 （1 1）质量相近的多肽怎么处理？）质量相近的多肽怎么处理？限制用来搜索的数据库，如果做的试验用的是小白鼠的组织，那么你可以只在鼠类的数据库中搜索；要限制用来搜索的数据库，如果做的试验用的是小白鼠的组织，那么你可以只在鼠类的数据库中搜索；要求必须有多个多肽和数据库相匹配，才做出最后的蛋白质鉴定。求必须有多个多肽和数据库相匹配，才做出最后的蛋白质鉴定。（2 2）一张质谱图中可能有多个蛋白存在？）一张质谱图中可能有多个蛋白存在？通常，通常，

29、MALDI-TOFMALDI-TOF是与双向电泳连接使用。双向电泳的一个电泳点上可能有是与双向电泳连接使用。双向电泳的一个电泳点上可能有2-32-3个蛋白。个蛋白。（三）质谱在蛋白质鉴定中的应用第45页/共57页 肽氨基酸序列法肽氨基酸序列法 在一级质谱图中，选择其中的一个峰，对其进行在一级质谱图中，选择其中的一个峰，对其进行CIDCID（Collision-Collision-induced Dissociationinduced Dissociation），使其在特定的部位断裂就得到一张二级质谱），使其在特定的部位断裂就得到一张二级质谱图。图。这里的假设是一级质谱中的一个峰就对应了一个多肽

30、，实际情况可能这里的假设是一级质谱中的一个峰就对应了一个多肽，实际情况可能并不是这样。并不是这样。对于一张一级质谱图，可以选择多个峰进行二级质谱的操作。这样就对于一张一级质谱图，可以选择多个峰进行二级质谱的操作。这样就可以适应一张质谱图里有多个蛋白的情况。可以适应一张质谱图里有多个蛋白的情况。（三）质谱在蛋白质鉴定中的应用第46页/共57页（三）质谱在蛋白质鉴定中的应用二级质谱图第47页/共57页（三）质谱在蛋白质鉴定中的应用多肽在质谱分析中的可能断裂方式第48页/共57页Peptide Sequences and Mass Measurements（三）质谱在蛋白质鉴定中的应用第49页/共5

31、7页Fregmentation of Peptide Ions（三）质谱在蛋白质鉴定中的应用第50页/共57页Typical Peptide MS/MS Spectrum（三）质谱在蛋白质鉴定中的应用第51页/共57页数据库搜索的流程数据库搜索的流程 常用的二级质谱的数据库搜索算法包括：常用的二级质谱的数据库搜索算法包括：SequestSequest；MascotMascot；Sonar,GutenTag,OLAV,ProbIDSonar,GutenTag,OLAV,ProbID。数据库搜索算法一般包括两个步骤：数据库搜索算法一般包括两个步骤：第一个步骤是筛选数据库里的多肽，找出所有可能与质谱

32、图匹配的多肽。第一个步骤是筛选数据库里的多肽，找出所有可能与质谱图匹配的多肽。第二个步骤就是拿这些选出来的多肽去和质谱图进行比对，并输出最高分值的多肽作为一个第二个步骤就是拿这些选出来的多肽去和质谱图进行比对，并输出最高分值的多肽作为一个PSMPSM（Peptide-Spectrum MatchPeptide-Spectrum Match）。）。（三）质谱在蛋白质鉴定中的应用第52页/共57页MS for Characterization of Proteins and peptide Peptide mass fingerprinting(MALDI-TOF)Database theoret

33、ical digestionDigestionMatching&ScoringDigestion第53页/共57页MSforCharacterizationofProteinsandpeptide Peptide MassDatabase identification Sequence-specific MS/MSGHVASTYKDigestion第54页/共57页（三）质谱在蛋白质鉴定中的应用第55页/共57页 参考文献：肽质量指纹谱鉴定蛋白质时生物信息学分析条件的优化参考文献：肽质量指纹谱鉴定蛋白质时生物信息学分析条件的优化（三）质谱在蛋白质鉴定中的应用第56页/共57页感谢您的观看！第57页/共57页