第四章生物免疫分析技术课件.ppt

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1、第四章生物免疫分析技术第四章生物免疫分析技术第1页，此课件共34页哦n n免疫分析 利用抗体与抗原的特异性结合作用来选择性地识别和测定作为待测物的抗体和抗原，因为样品中其他干扰化合物不产生免疫性识别，因此免疫反应的选择性非常高。第2页，此课件共34页哦 免疫学方法在食品分析中正得到越来越广泛的运免疫学方法在食品分析中正得到越来越广泛的运用，其中酶联免疫吸附法（用，其中酶联免疫吸附法（ELISA）已经在食品工）已经在食品工业中广泛应用，它能够用于测定人们希望含有的物业中广泛应用，它能够用于测定人们希望含有的物质，以及不希望含有的物质。例如现在人们所关注质，以及不希望含有的物质。例如现在人们所关注

2、的食品安全性问题中一些物质的检测：杀虫剂、药的食品安全性问题中一些物质的检测：杀虫剂、药物残留物、激素、生长素、微生物毒素、真菌毒素物残留物、激素、生长素、微生物毒素、真菌毒素或肠毒素、天然毒素，以及一些添加剂。或肠毒素、天然毒素，以及一些添加剂。免疫分析法具备有效的灵敏度、特异性、快速和低成免疫分析法具备有效的灵敏度、特异性、快速和低成免疫分析法具备有效的灵敏度、特异性、快速和低成免疫分析法具备有效的灵敏度、特异性、快速和低成本的优点；可对大量的样品进行常规分析；能够用于样本的优点；可对大量的样品进行常规分析；能够用于样本的优点；可对大量的样品进行常规分析；能够用于样本的优点；可对大量的样品

3、进行常规分析；能够用于样品的定性筛选，也能够对样品进行定量测定以确定样品品的定性筛选，也能够对样品进行定量测定以确定样品品的定性筛选，也能够对样品进行定量测定以确定样品品的定性筛选，也能够对样品进行定量测定以确定样品中待测组分的含量。中待测组分的含量。中待测组分的含量。中待测组分的含量。第3页，此课件共34页哦4.1 免疫的原理免疫的原理 Ag +Ab AgAb 特异性、灵敏性特异性、灵敏性 在在Ag，Ab反应中，用容易示踪的化学物反应中，用容易示踪的化学物质标记一种反应物，以了解反应是否发质标记一种反应物，以了解反应是否发生，发生部位，以及发生的程度（即对生，发生部位，以及发生的程度（即对未

4、知成分的样品进行定性、定位及定量未知成分的样品进行定性、定位及定量分析）。分析）。第4页，此课件共34页哦4.2 酶联免疫法酶联免疫法n n免疫酶技术：免疫酶技术：把抗原抗体的免疫反应和酶的把抗原抗体的免疫反应和酶的高效催化作用原理有机地结合起来。它具高效催化作用原理有机地结合起来。它具有免疫荧光试验和放射免疫试验的优点，有免疫荧光试验和放射免疫试验的优点，并克服上述两种方法的缺点。并克服上述两种方法的缺点。n n酶标记试剂制备容易、稳定、有效期长，免酶标记试剂制备容易、稳定、有效期长，免疫酶技术的敏感性接近放射免疫试验，可疫酶技术的敏感性接近放射免疫试验，可直接肉眼观察也可借助简单的仪器作定

5、量直接肉眼观察也可借助简单的仪器作定量测定，所得结果比较客观。测定，所得结果比较客观。第5页，此课件共34页哦n n酶免疫测定或免疫酶技术是指酶标记抗体或酶标酶免疫测定或免疫酶技术是指酶标记抗体或酶标记抗体进行的抗原抗体反应。记抗体进行的抗原抗体反应。它主要包括两个方面：它主要包括两个方面：它主要包括两个方面：它主要包括两个方面：n n免疫过氧化物酶法：免疫过氧化物酶法：以过氧化物酶作为标记，与抗以过氧化物酶作为标记，与抗以过氧化物酶作为标记，与抗以过氧化物酶作为标记，与抗原或抗体结合，然后根据酶与其底物间所产生的不原或抗体结合，然后根据酶与其底物间所产生的不原或抗体结合，然后根据酶与其底物间

6、所产生的不原或抗体结合，然后根据酶与其底物间所产生的不溶性颜色产物，借助于光学或电子显微镜观察细胞溶性颜色产物，借助于光学或电子显微镜观察细胞溶性颜色产物，借助于光学或电子显微镜观察细胞溶性颜色产物，借助于光学或电子显微镜观察细胞及亚细胞水平的抗原或抗体。及亚细胞水平的抗原或抗体。及亚细胞水平的抗原或抗体。及亚细胞水平的抗原或抗体。n n酶联免疫吸附法：酶联免疫吸附法：酶联免疫吸附法：酶联免疫吸附法：根据可溶性抗原或抗体与不溶性固根据可溶性抗原或抗体与不溶性固根据可溶性抗原或抗体与不溶性固根据可溶性抗原或抗体与不溶性固相载体结合后，还保留其免疫活性，结合了作为标记相载体结合后，还保留其免疫活性

7、，结合了作为标记相载体结合后，还保留其免疫活性，结合了作为标记相载体结合后，还保留其免疫活性，结合了作为标记的酶催化作用。的酶催化作用。的酶催化作用。的酶催化作用。第6页，此课件共34页哦 ELISA的基本原理和方法的基本原理和方法 ELISA的种类和变化的种类和变化 ELISA的特点的特点 ELISA的应用实例的应用实例ELISA第7页，此课件共34页哦4.2.1 基本原理基本原理它采用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接，然后它采用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接，然后通过酶与底物产生颜色反应，用于定量测定。测定的对通过酶与底物产生颜色反应，用于定量测定。测定的对象可以是抗体也可以是抗

8、原。象可以是抗体也可以是抗原。在这种测定方法中有在这种测定方法中有3种必要的试剂：种必要的试剂：固相的抗原或抗体（固相的抗原或抗体（免疫吸附剂）免疫吸附剂）酶标记的抗原或抗体（酶标记的抗原或抗体（标记物）标记物）酶作用的底物（酶作用的底物（显色剂）显色剂）第8页，此课件共34页哦测量时，抗原（抗体）先结合在固相载体上，但仍保测量时，抗原（抗体）先结合在固相载体上，但仍保留其免疫活性，留其免疫活性，然后加一种抗体（抗原）与酶结合成的偶联物（标然后加一种抗体（抗原）与酶结合成的偶联物（标记物），此偶联物仍保留其原免疫活性与酶活性，记物），此偶联物仍保留其原免疫活性与酶活性，当偶联物与固相载体上的抗

9、原（抗体）反应当偶联物与固相载体上的抗原（抗体）反应结合后，再加上酶结合后，再加上酶的相应底物，即起的相应底物，即起催化水解或氧化还催化水解或氧化还原反应而呈颜色。原反应而呈颜色。第9页，此课件共34页哦颜色反应的深浅与相应的抗体或抗原量成正比，颜色反应的深浅与相应的抗体或抗原量成正比，因此可借助于颜色反应的深浅来定量抗体或抗因此可借助于颜色反应的深浅来定量抗体或抗原。原。这种有色产物可用肉眼、光学显微镜、电子显微这种有色产物可用肉眼、光学显微镜、电子显微镜观察，也可以用分光光度计（酶标仪）加以测镜观察，也可以用分光光度计（酶标仪）加以测定。定。其方法简单，方便迅速，特异性强。其方法简单，方便

10、迅速，特异性强。第10页，此课件共34页哦4.2.2 酶及其底物酶及其底物 酶结合物是酶与抗体或抗原酶结合物是酶与抗体或抗原,半抗原在交联剂作用下半抗原在交联剂作用下联结的产物。是联结的产物。是ELISA成败的关键试剂，它不仅具有成败的关键试剂，它不仅具有抗体抗原特异的免疫反应，还具有酶促反应，显示抗体抗原特异的免疫反应，还具有酶促反应，显示出生物放大作用，但不同的酶选用不同的底物出生物放大作用，但不同的酶选用不同的底物，将，将得到不同的颜色反应。得到不同的颜色反应。第11页，此课件共34页哦酶酶 底底 物物显色反应显色反应显色反应显色反应 测定波长测定波长测定波长测定波长 辣根过氧化物酶辣根

11、过氧化物酶辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶 邻苯二胺邻苯二胺邻苯二胺邻苯二胺四甲替联苯胺四甲替联苯胺四甲替联苯胺四甲替联苯胺氨基水杨酸氨基水杨酸氨基水杨酸氨基水杨酸邻联苯甲胺邻联苯甲胺邻联苯甲胺邻联苯甲胺2,22,22,22,2-连胺基连胺基连胺基连胺基-2(3-2(3-2(3-2(3-乙基乙基乙基乙基-并噻并噻并噻并噻唑啉磺酸唑啉磺酸唑啉磺酸唑啉磺酸-6)-6)-6)-6)铵盐铵盐铵盐铵盐 橘红色橘红色橘红色橘红色黄色黄色黄色黄色棕色棕色棕色棕色兰色兰色兰色兰色蓝绿色蓝绿色蓝绿色蓝绿色492492460460449449425425642642碱性磷酸酯酶碱性磷酸酯酶碱性磷酸酯酶碱性磷酸酯酶 4

12、-4-4-4-硝基酚磷酸盐硝基酚磷酸盐硝基酚磷酸盐硝基酚磷酸盐(PNP)(PNP)(PNP)(PNP)萘酚萘酚萘酚萘酚-AS-Mx-AS-Mx-AS-Mx-AS-Mx磷酸盐磷酸盐磷酸盐磷酸盐+重氮盐重氮盐重氮盐重氮盐 黄色黄色黄色黄色红色红色红色红色 400400500 500 葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶 ABTS+HRP+ABTS+HRP+ABTS+HRP+ABTS+HRP+葡萄糖葡萄糖葡萄糖葡萄糖葡萄糖葡萄糖葡萄糖葡萄糖+甲硫酚嗪甲硫酚嗪甲硫酚嗪甲硫酚嗪+噻唑兰噻唑兰噻唑兰噻唑兰 黄色黄色黄色黄色深蓝色深蓝色深蓝色深蓝色 405405420 420-半乳糖苷酶半乳糖苷

13、酶半乳糖苷酶半乳糖苷酶 甲基伞酮基半乳糖苷甲基伞酮基半乳糖苷甲基伞酮基半乳糖苷甲基伞酮基半乳糖苷(4MuG)(4MuG)(4MuG)(4MuG)硝基酚半乳糖苷硝基酚半乳糖苷硝基酚半乳糖苷硝基酚半乳糖苷(ONPG)(ONPG)(ONPG)(ONPG)荧光荧光荧光荧光黄色黄色黄色黄色 360,450360,450420420 第12页，此课件共34页哦4.2.3 ELISA的种类和变化的种类和变化（一）双抗体夹心法（一）双抗体夹心法（二）间接法（二）间接法（三）竞争法（三）竞争法 （四）双位点一步法（四）双位点一步法（五）捕获法测（五）捕获法测IgMIgM抗体抗体（六）应用亲和素和生物素的（六）应

14、用亲和素和生物素的ELISAELISA 第13页，此课件共34页哦（一）双抗体夹心法（一）双抗体夹心法此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原第14页，此课件共34页哦步骤：步骤：A 将已知抗体吸附于载体上，温育后清洗；将已知抗体吸附于载体上，温育后清洗；B B 加入待检标本溶液，使溶液中的抗原与吸附的抗加入待检标本溶液，使溶液中的抗原与吸附的抗体结合，温育后清洗；体结合，温育后清洗；C C 加入酶标记特异性抗体，温育后清洗；加入酶标记特异性抗体，温育后清洗；加入酶标记特异性抗体，温育后清洗；加入酶标记特异性抗体，温育后清洗；D 加入酶作用底物，产生显色反应，颜

15、色的改变加入酶作用底物，产生显色反应，颜色的改变与所加的待检标本溶液中的抗原量成正比。与所加的待检标本溶液中的抗原量成正比。第15页，此课件共34页哦间接法是检测抗体最间接法是检测抗体最常用的方法，其原理常用的方法，其原理为利用酶标记的抗体为利用酶标记的抗体以检测已与固相结合以检测已与固相结合的受检抗体，故称为的受检抗体，故称为间接法。间接法。（二）间接法（二）间接法第16页，此课件共34页哦步骤：步骤：步骤：步骤：A A 将已知可溶性抗原吸附于载体（聚苯乙烯板或聚乙苯乙烯小珠），将已知可溶性抗原吸附于载体（聚苯乙烯板或聚乙苯乙烯小珠），将已知可溶性抗原吸附于载体（聚苯乙烯板或聚乙苯乙烯小珠）

16、，将已知可溶性抗原吸附于载体（聚苯乙烯板或聚乙苯乙烯小珠），经温育后清洗；经温育后清洗；经温育后清洗；经温育后清洗；B B 加入待检稀释血清，若血清中有相应特异性抗体存在则与吸附的抗加入待检稀释血清，若血清中有相应特异性抗体存在则与吸附的抗加入待检稀释血清，若血清中有相应特异性抗体存在则与吸附的抗加入待检稀释血清，若血清中有相应特异性抗体存在则与吸附的抗原结合，温育后清洗；原结合，温育后清洗；原结合，温育后清洗；原结合，温育后清洗；C C 加入酶标记的抗球蛋白抗体，此时酶标记抗体与吸附的抗原加入酶标记的抗球蛋白抗体，此时酶标记抗体与吸附的抗原加入酶标记的抗球蛋白抗体，此时酶标记抗体与吸附的抗原

17、加入酶标记的抗球蛋白抗体，此时酶标记抗体与吸附的抗原抗体复合物结合，温育后清洗；抗体复合物结合，温育后清洗；抗体复合物结合，温育后清洗；抗体复合物结合，温育后清洗；D D 加入酶作用底物（或称基质），酶分解底物并显色，用光加入酶作用底物（或称基质），酶分解底物并显色，用光加入酶作用底物（或称基质），酶分解底物并显色，用光加入酶作用底物（或称基质），酶分解底物并显色，用光电比色计测定底物显色深浅，即可推知抗体量。电比色计测定底物显色深浅，即可推知抗体量。电比色计测定底物显色深浅，即可推知抗体量。电比色计测定底物显色深浅，即可推知抗体量。第17页，此课件共34页哦（三）竞争法（三）竞争法 此法可用

18、于检测小分子抗原。此法可用于检测小分子抗原。第18页，此课件共34页哦步骤：步骤：步骤：步骤：A A 将已知抗体吸附于固相载体表面，温育后清洗；将已知抗体吸附于固相载体表面，温育后清洗；将已知抗体吸附于固相载体表面，温育后清洗；将已知抗体吸附于固相载体表面，温育后清洗；B B 将可能含抗原的待检溶液和酶标记的已知抗原溶液以适当将可能含抗原的待检溶液和酶标记的已知抗原溶液以适当将可能含抗原的待检溶液和酶标记的已知抗原溶液以适当将可能含抗原的待检溶液和酶标记的已知抗原溶液以适当比例混合，加入已包被的载体孔中，温育后清洗；比例混合，加入已包被的载体孔中，温育后清洗；比例混合，加入已包被的载体孔中，温

19、育后清洗；比例混合，加入已包被的载体孔中，温育后清洗；C C 加入酶作用的底物，产生显色反应。色深表示结合的酶标记抗加入酶作用的底物，产生显色反应。色深表示结合的酶标记抗加入酶作用的底物，产生显色反应。色深表示结合的酶标记抗加入酶作用的底物，产生显色反应。色深表示结合的酶标记抗原多，而待检溶液中未标记的抗原量少；反之，色浅表示结原多，而待检溶液中未标记的抗原量少；反之，色浅表示结原多，而待检溶液中未标记的抗原量少；反之，色浅表示结原多，而待检溶液中未标记的抗原量少；反之，色浅表示结合的酶标记抗原少，而待检溶液中抗原量多。合的酶标记抗原少，而待检溶液中抗原量多。合的酶标记抗原少，而待检溶液中抗原

20、量多。合的酶标记抗原少，而待检溶液中抗原量多。第19页，此课件共34页哦 对照管由于只加酶标抗原，与固相抗体充分对照管由于只加酶标抗原，与固相抗体充分结合，故分解底物显色深；测定管的显色程度则结合，故分解底物显色深；测定管的显色程度则随待测抗原和酶标抗原与固相抗体竞争结合的结随待测抗原和酶标抗原与固相抗体竞争结合的结果而异。如待测抗原量多，竞争性地抑制酶标抗果而异。如待测抗原量多，竞争性地抑制酶标抗原与固相抗体结合，使固相上结合的酶标抗原量原与固相抗体结合，使固相上结合的酶标抗原量减少。因此，加入底物后显色反应较弱。减少。因此，加入底物后显色反应较弱。第20页，此课件共34页哦4.2.4 特点

21、特点特点一：灵敏性特点一：灵敏性 该测定法的灵敏度来自酶。众所周知该测定法的灵敏度来自酶。众所周知,酶是一种有机催酶是一种有机催化剂，很少量的酶即可诱导大量的催化反应化剂，很少量的酶即可诱导大量的催化反应，产生可，产生可供观察的显色反应现象。因此该体系常被称为酶放大供观察的显色反应现象。因此该体系常被称为酶放大体系。体系。ELISA实现了在细胞或亚细胞水平上示踪抗原实现了在细胞或亚细胞水平上示踪抗原或抗体的所在部位，或在微克、甚至纳克水平上对其或抗体的所在部位，或在微克、甚至纳克水平上对其进行定量。进行定量。例如，在测定血清中某一物质的含量时，化学比色法的例如，在测定血清中某一物质的含量时，化

22、学比色法的敏感度为敏感度为mg/ml水平，酶反应测定法的敏感度约为水平，酶反应测定法的敏感度约为510g/ml。第21页，此课件共34页哦特点二：特异性特点二：特异性 其特异性来自抗体或抗原的选择性。抗原抗体其特异性来自抗体或抗原的选择性。抗原抗体的结合实质上只发生在抗原的抗原决定簇与抗体的的结合实质上只发生在抗原的抗原决定簇与抗体的抗原结合位点之间。由于两者在化学结构和空间构抗原结合位点之间。由于两者在化学结构和空间构型上呈互补关系，所以抗原抗体反应具有高度的特型上呈互补关系，所以抗原抗体反应具有高度的特异性。异性。第22页，此课件共34页哦 例如乙肝病毒中的表面抗原（例如乙肝病毒中的表面抗

23、原（HBsAgHBsAg）、）、e e抗原抗原（HBeAgHBeAg）和核心抗体（）和核心抗体（HBcAgHBcAg），虽来源于同一），虽来源于同一病毒，但仅与其相应的抗体结合，而不与另外两病毒，但仅与其相应的抗体结合，而不与另外两种抗体反应。抗原抗体反应的这种特异性使免疫种抗体反应。抗原抗体反应的这种特异性使免疫测定能在一非常复杂的蛋白质化合物（例如血清）测定能在一非常复杂的蛋白质化合物（例如血清）中测定某一特定的物质，而不需先分离待检物。中测定某一特定的物质，而不需先分离待检物。第23页，此课件共34页哦ELISAELISA应用实例应用实例第24页，此课件共34页哦 饲料中盐酸克伦特罗的测

24、定饲料中盐酸克伦特罗的测定 饲料中毒素的测定（主要包括黄曲霉毒素，饲料中毒素的测定（主要包括黄曲霉毒素，简曲霉简曲霉毒素毒素 ）饲料中有害微生物的快速筛检饲料中有害微生物的快速筛检 （如沙门氏菌（如沙门氏菌 ）甲胺磷残留分析甲胺磷残留分析 甲基对硫磷残留分析甲基对硫磷残留分析 呋喃丹残留分析呋喃丹残留分析 ELISA在饲料安全检测中的应用在饲料安全检测中的应用ELISA用于农药残留的检测用于农药残留的检测第25页，此课件共34页哦河豚毒素河豚毒素 植物毒素如罌粟硷、吗啡、藻类毒素植物毒素如罌粟硷、吗啡、藻类毒素 苯并芘苯并芘 主要有除草剂与杀虫剂两大类主要有除草剂与杀虫剂两大类 例如杀暝松（例

25、如杀暝松（FN FN）、）、甲氟磷酸异已酶（甲氟磷酸异已酶（SOMAN SOMAN）、）、草不绿（草不绿（Alachor Alachor）、）、西维因（西维因（Carbaryl Carbaryl）、）、多菌灵及克菌丹（多菌灵及克菌丹（Captan Captan）等。）等。农药的检测农药的检测：第26页，此课件共34页哦 ELISA ELISA检测检测“非典型肺炎非典型肺炎”冠状病毒冠状病毒 ELISA ELISA在结缔组织病早期诊断中的应用检测在结缔组织病早期诊断中的应用检测抗异质性胞核核糖蛋白抗异质性胞核核糖蛋白A2A2（hnRNPA2hnRNPA2）/类风湿类风湿性关节炎（性关节炎（PtA

26、PtA）3333抗体抗体ELISAELISA在疾病诊断中的作用在疾病诊断中的作用 ELISA ELISA法检测幽门螺杆菌抗体法检测幽门螺杆菌抗体第27页，此课件共34页哦ELISAELISA试剂盒商业资讯试剂盒商业资讯第28页，此课件共34页哦ELISA试剂盒试剂盒第29页，此课件共34页哦第30页，此课件共34页哦酶联免疫井酶联免疫井第31页，此课件共34页哦DNM-9602GDNM-9602G酶标分析仪酶标分析仪DNM-9602 DNM-9602 标配酶标分析仪标配酶标分析仪 DNM-9602ADNM-9602A酶标分析仪酶标分析仪几种酶标分析仪几种酶标分析仪第32页，此课件共34页哦4.

27、3 放射免疫法放射免疫法n n放射免疫测定（放射免疫测定（radioimmunoassayradioimmunoassay，RIA）是）是）是）是1959年由年由Berson和和和和Yalow首先用于糖尿病患者胰首先用于糖尿病患者胰岛素含量的测定，是一种将同位素分析的灵敏性和岛素含量的测定，是一种将同位素分析的灵敏性和抗原抗体反应的特异性这两大特点结合起来的免疫抗原抗体反应的特异性这两大特点结合起来的免疫标记测定技术。标记测定技术。n n其优点是灵敏度高、特异性强、精确性好、样品用其优点是灵敏度高、特异性强、精确性好、样品用量少，而且不需要复杂的提纯步骤。缺点是需要特量少，而且不需要复杂的提纯

28、步骤。缺点是需要特殊的仪器设备和一定的防护条件，而且有些同位素殊的仪器设备和一定的防护条件，而且有些同位素标记物的半衰期较短以及试验废物难以处理，对环标记物的半衰期较短以及试验废物难以处理，对环境造成放射性污染。境造成放射性污染。第33页，此课件共34页哦放射免疫测定法放射免疫测定法基本原理基本原理基本原理基本原理n n放射免疫测定是建立在待测抗原和标记抗原放射免疫测定是建立在待测抗原和标记抗原对有限量抗体进行竞争性结合的基础上。待对有限量抗体进行竞争性结合的基础上。待测抗原是指人体内某种微量活性物质（如微测抗原是指人体内某种微量活性物质（如微生物寄生虫抗原、激素、维生素、酶、药生物寄生虫抗原、激素、维生素、酶、药物等），而标记抗原使将已知的上述物质标物等），而标记抗原使将已知的上述物质标记上放射性同位素，具有示踪作用。记上放射性同位素，具有示踪作用。第34页，此课件共34页哦