理学现代生物技术转基因生物外源基因表达及其安全性.pptx

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1、第一节 转基因生物外源基因表达一、外源基因表达系统 转基因生物技术或称基因工程的最终目的就是要在一个合适的系统中，使外源基因高效表达，从而生产有重要价值的产品，基因工程的表达系统有原核表达系统和真核表达系统两大类。第1页/共56页（一）原核生物的外源基因表达系统 外源基因在原核细胞中的表达就是使克隆的外源基因在原核细胞中以发酵的方式快速、高效地合成基因产物。第2页/共56页（一）原核生物的外源基因表达系统 1原核生物基因表达的特点 同所有的生命过程一样，外源基因在原核细胞中的表达包括两个主要过程：即DNA转录成mRNA和mRNA翻译成蛋白质。第3页/共56页（一）原核生物的外源基因表达系统 与

2、真核细胞相比，原核生物的基因表达有下列特点：原核生物只有一种RNA聚合酶(真核细胞有3种)识别原核细胞的启动子，催化所有RNA 的合成。原核生物的基因表达是以操纵子为单位的，即由数个相关的结构基因及其调控区结合构成1个基因表达的协同单位。第4页/共56页（一）原核生物的外源基因表达系统 由于原核生物无核膜，转录与翻译是偶联的，二者也是连续进行的。原核生物染色体DNA是裸露的环形DNA，转录成mRNA后可直接在胞浆中与核糖体结合翻译形成蛋白质。原核基因一般不含内含子，在原核细胞中缺乏真核细胞的转录后加工系统。因此，当克隆的含有内含子的真核基因在原核细胞中转录成的mRNA前体后，其中的内含子部分就

3、不能被切除。第5页/共56页（一）原核生物的外源基因表达系统 原核基因表达的控制主要是在转录水平，这种控制比对基因产物的直接控制要慢。在大肠杆菌mRNA的核糖体结合位点上有1个转译的起始密码子及同16s核糖体RNA 3末端碱基互补的序列即S-D序列是真核基因所没有的。第6页/共56页（一）原核生物的外源基因表达系统 2、外源基因在原核细胞中表达的基本条件通过表达载体将外源基因导入宿主菌。必须利用原核细胞的强启动子和S-D序列等调控元件。外源基因不能带有间隔序列(内含子)。外源基因与载体连接后必须形成正确的开放阅读框架。利用宿主菌的调控系统。第7页/共56页（一）原核生物的外源基因表达系统 3、

4、原核细胞中基因的重要表达调控元件 (1)启动子 启动子是DNA链上能与RNA聚合酶结合并能起动m RNA合成的核苷酸序列，它是基因表达不可缺少的重要调控序列。没有启动子，基因就不能转录。(2)终止子 在1个基因的3末端或是1个操纵子的3端还有一特定的核苷酸序列，它有终止转录的功能，这一DNA序列称为终止子。第8页/共56页（二）真核生物的外源基因表达系统 1真核生物基因及表达的主要特点 u与原核生物不同，真核生物基因表达具有程序、时间和空间上不同层次的严格、精密的控制，这是由真核基因的复杂性决定的。u 真核细胞与原核细胞在基因转录、翻译及DNA的空间结构方面都存在很大的差异，真核生物在基因结构

5、及表达方面有着与原核生物不同的特点。第9页/共56页（二）真核生物的外源基因表达系统 1真核生物基因及表达的主要特点 基因组DNA的存在形式使基因转录的启动一般不具备快起始的能力，大多数真核DNA都与蛋白质结合成紧密结构，不像原核DNA是裸露的。真核生物一条成熟的mRNA链只能翻译出一条多肽链，不存在原核生物中常见的多基因操纵子形式。真核基因的转录和翻译在细胞的不同部位，转录在细胞核内进行面翻译在细胞质中进行，两者既有间隔又有联系，不像原核基因在同一部位进行转译。第10页/共56页（二）真核生物的外源基因表达系统 1真核生物基因及表达的主要特点 原核基因转录的调节区小且位于启动子上游不远处，真

6、核基因的调节区不仅要大得多而且可能远离启动子达数百甚至上干个碱基。真核基因中间含有不被翻译的内含子，大多数真核基因的初级转录本不具有功能，需在细胞的一定部位进行剪接加工形成各种中间产物，因而可以通过是否加工mRNA前体来调控基因的表达。真核基因的表达受到多层次的精密调节，比原核基因复杂得多，也涉及更多的蛋白质因子的参与。第11页/共56页（二）真核生物的外源基因表达系统 2真核基因的重要表达调控元件 真核基因在其表达的转录、转录后加工、翻译、翻译后蛋白的加工、运输及定位等各个环节都取决于一系列重要调控元件的作用，外源基因的表达正是通过这些调控元件来实现的。(1)启动子（2）增强子（3）终止子（

7、4）修饰序列第12页/共56页（二）真核生物的外源基因表达系统 3真核生物外源基因表达系统(1)瞬时表达系统 在此系统中外源基因没有稳定的整合到宿主细胞染色体中，而是以染色体外的DNA形式存在，因此外源基因只能得到瞬时表达。(2)诱导表达系统 诱导型基因表达系统对子认识基因在生长发育、生理活动及其病理过程中的作用都具有重要的意义。第13页/共56页（二）真核生物的外源基因表达系统 3真核生物外源基因表达系统 (3)组成型特异表达系统乳腺表达系统膀胱生物反应器血液表达系统第14页/共56页二、外源基因对转基因生物遗传的影响 转基因技术使人们能够按照自己的意愿，对生命最基本的遗传物质进行直接操作，

8、把所需要的目的基因导入细胞内，使生物体获得新的性状。外源基因被导入宿主并整合进受体DNA后，一旦遗传表达，将表现出新的遗传性状。由于外源基因进入，与内源基因发生相互作用，可能使转基因生物中的外源基因甚至内源基因的遗传表达受到一定影响。第15页/共56页二、外源基因对转基因生物遗传的影响 （一）转基因生物中外源基因的丢失 在基因工程的研究和应用过程中，发现有时在第一代转基因生物体内可以检测出外源基因的存在，在第二代、第三代也还可以检测出来，但在后面几代中就检测不到了，即发生了外源基因丢失。第16页/共56页二、外源基因对转基因生物遗传的影响 （二）转基因生物中外源基因的次生效应u外源基因的次生效

9、应是指由于外源基因的插入而对宿主体内某些基因的表达所产生的影响。u目前的技术不能够准确控制外源基因在宿主染色体上的插入位点，所以外源基因可能插入到宿主基因组中的非编码区、结构基因或调控区，从而产生插入突变，预期的结果也就显现不出来。u常见的次生代谢效应有两种情况：一是由于外源基因的插入导致宿主体内某一基因失活；二是由于外源基因的插入将宿主体内某一基因激活。u由于目前的科学技术水平还很难准确预测一个外源基因在新的遗传背景下会发生什么样的相互作用，因此对外源基因的次生效应尚无法进行控制和预测。第17页/共56页二、外源基因对转基因生物遗传的影响 （三）转基因生物中的基因沉默外源基因整合后不仅可能引

10、起宿主体内某些基因的失活，外源基因自身也很容易被受体基因组存在的修饰与限制系统所识别并加以修饰和抑制，造成失活和沉默。形式包括：顺式失活和反式失活两种。第18页/共56页二、外源基因对转基因生物遗传的影响 （四）转基因生物中外源基因的逃逸转基因生物体内整合的外源基因以某种途径转移到其他生物体内或环境中，这种现象称为外源基因的逃逸。外源基因逃逸的途径：转基因作物花粉的散布，这种途径是转基因植物中外源基因逃逸的主要渠道之一；转基因生物分泌物或残骸在环境中的残留；食物链的传递。第19页/共56页二、外源基因对转基因生物遗传的影响 （五）外源基因在后代中的遗传多样性 外源基因在后代中的遗传多样性因转基

11、因个体杂交或转基因个体自交结合。一般来说，外源基因的传递遵循孟德尔遗传规律，自交后代表现31的分阁规律，杂交后代表现1：1的分离规律。但是在某些情况下，作为两个不连锁的显性基因在自交后代中也有表现出151的分离现象。另外，有一个特殊现象是自交一代符合31分离规律，但自交二代却不符合孟德尔分离规律。第20页/共56页三、影响外源基因表达的主要因素及其调控策略 （一）影响外源基因表达的主要因素 1、有效的转录起始这是外源基因能否在宿主细胞中表达及其效率的关键步骤之一，起始的速率是基因表达的主要限速步骤，启动子的强弱及相关的调控序列将影响外源基因的表达与否及其表达效率。第21页/共56页三、影响外源

12、基因表达的主要因素及其调控策略 （一）影响外源基因表达的主要因素 2、有效延伸和转录终止外源基因的转录一旦起始，接下来的问题是如何保证mRNA的有效延伸、终止以及稳定的积累(尤其在真核细胞中)。然而，在转录物内的衰减和非特异性终止可诱发转录中的mRNA分子提前终止。第22页/共56页三、影响外源基因表达的主要因素及其调控策略 （一）影响外源基因表达的主要因素 3、mRNA的稳定性是翻译出蛋白质的模板，mRNA的稳定校直接关系到翻译产物的多少，即表达的效率。4有效的翻译起始和有效的转录起始一样，有效的翻译起始是外源基因表达的关键，起始密码子、核糖体结合位点及其相关核苷酸序列对翻译起始至关重要。第

13、23页/共56页三、影响外源基因表达的主要因素及其调控策略 （一）影响外源基因表达的主要因素 5、遗传密码应用的偏倚性 不同基因对遗传密码的应用并不是随机的，高表达的基因经常使用偏倚性密码，即使用其常用密码有更高的表达效率。6mRNA的二级结构 无论是原核基因还是真核基因的表达，翻译的起始经常受到mRNA不适当的二级结构的影响(如5端非翻译区的茎环二级结构)。第24页/共56页三、影响外源基因表达的主要因素及其调控策略 （一）影响外源基因表达的主要因素 7、RNA转录后加工 绝大多数真核基因含有内含子，需在细胞核中被加工去除而产生成熟的mRNA。8mRNA序列上终止密码的选择 所有三个终止密码

14、子在它们的终止效率上是不同的，UAA在高水平表达中终止效率最好，若采用一串联的终止密码效果更好。第25页/共56页三、影响外源基因表达的主要因素及其调控策略 （一）影响外源基因表达的主要因素 9、表达载体的拷贝数及稳定性在多数情况下，目标基因的扩增程度与基因表达效率成正比。表达载体的稳定性是维持基因表达的必要前提条件，而表达载体的稳定性不但与自身特性有关，也与受体细胞特性密切相关。10外源蛋白的稳定性 外源蛋白质表达后是否能在宿主细胞中稳定积累而不被内源蛋白酶水解，这是基因高效表达的一个重要参数。第26页/共56页三、影响外源基因表达的主要因素及其调控策略 （二）外源基因表达调控的策略 1、提

15、高外源基因在原核细胞表达的策略 (1)提高翻译水平(2)减轻细胞的代谢负荷(3)提高表达蛋白的稳定性，防止外源蛋白被降解。第27页/共56页三、影响外源基因表达的主要因素及其调控策略 （二）外源基因表达调控的策略 2、提高外源基因在真核细胞表达的策略 （1）转录前（基因水平）调控（2）转录水平调控（3）转录后调控（4）翻译水平调控第28页/共56页四、基因表达调控技术 （一）反义RNA 1概念 反义RNA(antisense RNA)是指与靶RNA(多为mRNA）具有互补序列的RNA分子，它通过与靶RNA进行碱基配对结合的方式参与基因的表达调控。第29页/共56页四、影响外源基因表达的主要因素

16、及其调控策略 （一）反义RNA 2反义RNA 的调控方式(1)在核酸复制水平上 反义RNA可作为DNS复制的抑制因子，它可与引物DNA前体互补结合，抑制DNA的复制，从而控制复制的频率。(2)在转录水平上 反义RNA与mRNA 5端互补而阻止RNA的转录。(3)在翻译水平上 反义RNA在翻译水平上的调控主要表现在三个方面：一是与mRNA 5端非翻译区包括S-D序列的结合，直接抑制翻译；二是与mRNA 5编码区，主要是起始密码子AUG结合，抑制翻译起始；三是靶mRNA 的非编码区互补结合，间接抑制mRNA 的翻译。第30页/共56页四、影响外源基因表达的主要因素及其调控策略 （一）反义RNA 3

17、反义RNA 的应用(1)植物学研究中的应用：控制果实成熟；提高植物抗病性；改变花卉的颜色；控制植物淀粉的合成；控制油料植物种子中脂肪酸的合成；控制雄性不育。(2)反义RNA在动物及人类疾病治疗上的应用：对疾病基因的具有调控作用；在人类疾病治疗中的应用。第31页/共56页四、影响外源基因表达的主要因素及其调控策略 （二）基因敲除 1概念基因敲除(gene knock out)是指对一个结构已知但功能未知的基因,从分子水平上设计实验，将该基因去除，或用其他序列相近的基因取代，然后从整体观察实验生物，推测相应基因的功能。基因敲除可中止某一基因的表达外，还包括引入新基因及引入定点突变。既可以是用突变基

18、因或其他基因敲除相应的正常基因，也可以用正常基因敲除相应的突变基因。目前这项技术主要集中在动物研究上。第32页/共56页四、影响外源基因表达的主要因素及其调控策略 （二）基因敲除 2基因敲除技术的应用建立人类疾病的转基因动物模型，为医学研究提供材料。基因敲除小鼠是研究疾病的发生机理、分子基础及诊断治疗的重要实验材料。改造动物，鉴定新基因或其新功能，研究发育生物学。深入研究基因敲除小鼠在胚胎发育及生命各期的表现，可以得到详细的有关该基因在生长发育中的作用，为研究基因的功能和生物效应提供模式。第33页/共56页四、影响外源基因表达的主要因素及其调控策略 （二）基因敲除 2基因敲除技术的应用去除多余

19、基因或修饰改造原有异常基因，以达到治疗的目的。改造生物，培育新的生物品种。第34页/共56页四、影响外源基因表达的主要因素及其调控策略 （三）RNA 干涉 1概念RNA 干涉（interference）：利用双链RNA可以特异性地降解相应序列mRNA，从而特异性阻断相应基因的表达。2、RNA 干涉的应用利用RNA 干涉可以实现多基因突变。可以利用同一基因家族的多个基因具有一段同源性很高的保守序列这一特征，设计针对这一区段序列的双链RNA分子，注射一种双链RNA既可以产生多个基因同时剔除的表型。RNA干涉可以产生基因降低表达的各种表型，而且抑制基因表达的时间可以随意控制在发育的任何阶段。第35页

20、/共56页第二节 转基因生物的安全性及其风险评估 一、转基因生物安全性 （一）生物安全概念 1、广义生物安全、广义生物安全广义的生物安全，是指在一个特定的时空范围内，由于自然或人类活动引起的外来物种迁入，并由此对当地其他物种和生态系统造成改变和危害；人为造成环境的剧烈变化而对生物多样性产生影响和威胁；在科学研究、开发、生产和应用中造成对人类健康、生存环境和社会生活有害的影响。第36页/共56页 一、转基因生物安全性（一）生物安全概念 2、狭义生物安全、狭义生物安全 狭义的生物安全主要是指通过基因工程技术产生的遗传工程体及其产品所带来的上述种种有害影响。本节所述的转基因生物的安全性即属这一范畴。

21、第37页/共56页 一、转基因生物安全性（二）国内外对转基因生物安全性的看法 1、转基因生物安全性问题的由来、转基因生物安全性问题的由来 2、国际社会、科学界和各国政府对转基因、国际社会、科学界和各国政府对转基因生物安全性的认识生物安全性的认识 第38页/共56页 二、转基因生物安全性评价 （一）生物安全性评价的目的 为转基因生物技术的安全管理和科学决策提供科学依据。有针对性地采取与之相适应的监测和控制措施，保障人类健康和环境安全。回答公众疑问，消除公众由于缺乏全面了解面产生的种种误解，形成对转基因生物安全性的正确认识。提高转基因生物产品的国际竞争能力，促进国际贸易，维护国家权益。促进转基因生

22、物技术作为具有巨大应用前景的产业走上健康有序、可持续发展的道路。第39页/共56页 二、转基因生物安全性评价 （二）生物安全性评价原则、标准和程序 1安全性评价的原则 对转基因生物安全性评价应遵守科学、客观、公正、个案评审的原则，针对每项基因工程工作的具体情况确定其安全等级。第40页/共56页 二、转基因生物安全性评价 （二）生物安全性评价原则、标准和程序 2安全等级的划分标准 安全等级安全等级潜在危险程度潜在危险程度对人类健康和生态环境尚不存在危险对人类健康和生态环境尚不存在危险对人类健康和生态环境具有低度危险对人类健康和生态环境具有低度危险对人类健康和生态环境具有中度危险对人类健康和生态环

23、境具有中度危险对人类健康和生态环境具有高度危险对人类健康和生态环境具有高度危险第41页/共56页3安全等级的划分程序 程序目的结果第一步确定受体生物的安全等级安全等级、或级第二步确定基因操作对安全性的影响类型安全类型、或型第三步确定遗传工程体的安全等级安全等级、或级第四步确定遗传工程产品的安全等级安全等级、或级第五步确定接受环境对安全性的影响第六步确定监控措施的有效性第七步提出综合评价和建议第42页/共56页 二、转基因生物安全性评价 （三）安全性评价的主要内容 生物安全性评价的内容包括对人类健康的影响和对生态环境的影响两个方面，而在每一个方面的具体评价内容则取决于对安全性的理解和要求，同时也

24、与当前生物技术研究与应用的发展认识水平是分不开的，不同国家、不同行业的要求各不相同。第43页/共56页 1受体生物的安全等级 第44页/共56页 2基因操作对受体生物安全性的影响 第45页/共56页 3遗传工程体的安全等级 第46页/共56页 二、转基因生物安全性评价 （三）安全性评价的主要内容 4遗传工程产品的安全等级 遗传工程产品的安全等级一般是根据其与遗传工程体的特性和安全性进行比较来确定的，其分级标准与受体生物的分级标准相同。主要评价与遗传工程体比较，遗传工程产品的安全性有何改变。5基因工程工作安全性的评价和建议 在综合考察遗传工程体及其产品的特性、用途、潜在接受环境的特性、监控措施的

25、有效性等相关资料的基础上，确定遗传工程体及其产品的安全等级，形成对基因工程工作安全性的评价意见，提出安全性监控和管理的建议。第47页/共56页 二、转基因生物安全性评价 （四）国内外生物安全性法规与管理 1、美国生物安全法规及管理 美国是世界上最早制定生物技术安全管理法规的国家，其生物技术安全管理法规体系和管理体制都比较完善。(1)安全法规 (2)管理体制 第48页/共56页 1、美国生物安全法规及管理 美国生物安全管理法规 第49页/共56页 1、美国生物安全法规及管理遗传工程体及其产品的管理部门 第50页/共56页 2、欧盟生物安全法规及管理 (1)法规体系 (2)管理机构 欧盟生物安全相

26、关法规第51页/共56页3中国的生物技术(转基因生物)安全管理 (1)相关法规重组DNA工作安全管理条例基因工程安全管理办法农业生物基因工程安全管理实施办法新资料食品卫生管理办法人用重组DNA制品质量控制要点兽用新生物制品管理办法 第52页/共56页3中国的生物技术(转基因生物)安全管理 (2)管理体制 根据基因工程体及其产品的研究、开发和应用的领域与范围，相关的管理机构主要是国家科学技术委员会、农业部、卫生部、国家环境保护总局与中国科学院等。第53页/共56页3中国的生物技术(转基因生物)安全管理 (3)我国生物安全管理的原则 生物安全管理体现国家意志，展示国家形象，关系国家综合国力的增长，我国生物安全管理实施遵循的根本原则是：研究开发与安全防范并重的原则；贯彻预防为主的原则；有关部门协同合作的原则；公正、科学的原则；公众参与的原则；个案处理和逐步完善的原则。第54页/共56页 作业 1、影响外源基因表达的因素主要有哪些?可以通过哪些途径进行调控?2、生物安全性评价的目的是什么？第55页/共56页感谢观看！感谢观看！第56页/共56页