酶的分离和提纯等课件.ppt
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1、关于酶的分离和提关于酶的分离和提纯等纯等现在学习的是第1页,共34页上两次课的内容上两次课的内容 第一节第一节 酶是生物催化剂酶是生物催化剂第二节第二节 酶的结构与功能酶的结构与功能第三节第三节 酶的作用机制酶的作用机制第四节第四节 酶促反应动力学酶促反应动力学本次课的内容本次课的内容第五节第五节 酶的分离、提纯和活性测定酶的分离、提纯和活性测定第六节第六节 重要的酶类重要的酶类第七节第七节 酶在医学上的应用酶在医学上的应用第第五五章章 酶酶现在学习的是第2页,共34页第五节第五节 酶的分离、提纯和活性测定酶的分离、提纯和活性测定Section 5 the separation,purific
2、ation and measuration of activity of enzyme现在学习的是第3页,共34页一、一、酶的分离提纯酶的分离提纯 目的:目的:研究酶的理化性质。研究酶的理化性质。包括结构与功能、生物学作用。包括结构与功能、生物学作用。作为生化试剂及用作药物的酶要求纯度高作为生化试剂及用作药物的酶要求纯度高现在学习的是第4页,共34页根据酶在体内作用部位根据酶在体内作用部位胞外酶胞外酶-易分离易分离胞内酶胞内酶-须破碎须破碎cellcell分离提纯的原则分离提纯的原则选择酶含量丰富的材料选择酶含量丰富的材料目前多采用微生物发酵的方法来获取大量的酶制剂目前多采用微生物发酵的方法来
3、获取大量的酶制剂避免蛋白质变性:避免强酸、强碱,低温避免蛋白质变性:避免强酸、强碱,低温每一步骤,都要测定酶的总活力和比活力每一步骤,都要测定酶的总活力和比活力现在学习的是第5页,共34页a.a.选材选材动物、植物、微生物:含酶量高,易分离的酶动物、植物、微生物:含酶量高,易分离的酶分离提纯的步骤分离提纯的步骤选材选材-破碎细胞破碎细胞-抽提抽提-纯化纯化-保存保存现在学习的是第6页,共34页b b破碎细胞破碎细胞 动物动物 细菌细菌 植物植物 研磨研磨 超声波超声波 纤维素酶纤维素酶匀浆匀浆 溶菌酶溶菌酶 捣碎机捣碎机 化学溶剂化学溶剂 (甲苯甲苯)提取液提取液c c抽提抽提抽提条件的选取应
4、根据酶的溶解度和稳定性等。抽提条件的选取应根据酶的溶解度和稳定性等。(用稀盐、稀酸、稀碱溶液抽提)用稀盐、稀酸、稀碱溶液抽提)盐:盐:一般用等渗盐溶液,如一般用等渗盐溶液,如0.05mol/L 0.05mol/L 的的PBS,0.15mol/L的的NaCl等;等;T T:一般在一般在0 044;pHpH在其稳定范围内且远离其等电点。在其稳定范围内且远离其等电点。现在学习的是第7页,共34页 操作要求:操作要求:A.A.尽量减少酶活性的损失尽量减少酶活性的损失 B.B.低温低温 0 0 5 5 摄氏度摄氏度 有机溶剂:有机溶剂:-15-15 -20-20摄氏度摄氏度 C.C.抽提液加入抽提液加入
5、EDTAEDTA(络合金属)(络合金属)D.D.抽提液加入巯基乙醇(防止抽提液加入巯基乙醇(防止-SH-SH氧化失活)氧化失活)E.E.不能过度搅拌,以免产生大量泡沫,使酶不能过度搅拌,以免产生大量泡沫,使酶 变性变性 F.F.测定酶的比活力测定酶的比活力 现在学习的是第8页,共34页d.纯化纯化 小分子能自然去除小分子能自然去除,大分子中核酸用鱼精蛋白或大分子中核酸用鱼精蛋白或MnCl2沉淀去除沉淀去除,粘多糖用醋酸铅去除。粘多糖用醋酸铅去除。而主要工作则是去除杂蛋白。而主要工作则是去除杂蛋白。纯化方法与蛋白质基本相同纯化方法与蛋白质基本相同,此外常用选择性变性法此外常用选择性变性法如选择性
6、热变性法如选择性热变性法(某些酶耐热某些酶耐热).现在学习的是第9页,共34页纯化方法纯化方法选择性变性法选择性变性法盐析法盐析法有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法等电点沉淀方法等电点沉淀方法吸附分离方法吸附分离方法几种方法配合使用几种方法配合使用现在学习的是第10页,共34页 提纯的目的提纯的目的:含量含量+纯度纯度工艺的选择应权衡含量与纯度工艺的选择应权衡含量与纯度,根据酶的应用目的和经根据酶的应用目的和经济效益取得一个平衡点济效益取得一个平衡点.每一步都要测定酶的纯度每一步都要测定酶的纯度(比活力比活力)并计算纯化倍数和产并计算纯化倍数和产率以决定该步骤的效益和取舍率以决定该步骤的效益和取舍.
7、酶的比活力酶的比活力(纯度纯度)=)=活力单位数活力单位数/毫克蛋白毫克蛋白纯化倍数纯化倍数=每次比活力每次比活力/第一次比活力第一次比活力产率产率=(=(每次总活力每次总活力/第一次总活力第一次总活力)100%)100%现在学习的是第11页,共34页e e保存保存 将酶制品浓缩,结晶,以便保存(将酶制品浓缩,结晶,以便保存(-20-20)注意:注意:酶易失活,不可烘干。酶易失活,不可烘干。可用的方法:可用的方法:(1 1)保存浓缩的酶液:保存浓缩的酶液:(2 2)浓缩液加入等体积甘油浓缩液加入等体积甘油 -20-20长期保存长期保存现在学习的是第12页,共34页二、酶的活力测定二、酶的活力测
8、定(定量定量)酶的活力酶的活力:又称为酶活性,一般把酶催化一定化又称为酶活性,一般把酶催化一定化学反应的能力称为酶活力,酶的活力大小可用在一学反应的能力称为酶活力,酶的活力大小可用在一定条件下它所催化的某一化学反应的速度来表示定条件下它所催化的某一化学反应的速度来表示,即即可用单位时间内、单位体积中底物的减少量或产物可用单位时间内、单位体积中底物的减少量或产物的生成量来表示的生成量来表示.一般采用高底物浓度一般采用高底物浓度S100Km(S100Km(零级反应零级反应)测测定初速度来定量酶浓度定初速度来定量酶浓度.现在学习的是第13页,共34页 酶活力单位酶活力单位:最适条件下最适条件下,单位
9、时间内单位时间内,酶催化底物的酶催化底物的减少量或产物的生成量减少量或产物的生成量.1 1个个U U(1U1U):特定条件下特定条件下,1,1分钟内生成分钟内生成1 1微摩尔产物的微摩尔产物的酶量酶量(或转化或转化1 1微摩尔底物的酶量微摩尔底物的酶量).).Kat Kat:最适条件下最适条件下,每秒钟可使每秒钟可使1 1摩尔底物转化的酶量摩尔底物转化的酶量.即即1Kat=6101Kat=6107 7IUIU 习惯单位表示酶活力习惯单位表示酶活力现在学习的是第14页,共34页酶的转换数(酶的转换数(turnover numberturnover number)单位时间,每个催化中心所转换的底物
10、分子单位时间,每个催化中心所转换的底物分子数。通常指每秒钟每个酶分子转换底物的微数。通常指每秒钟每个酶分子转换底物的微摩尔数,在数值上,摩尔数,在数值上,KcatKcatK K3 3现在学习的是第15页,共34页第六节第六节 重要的酶类重要的酶类一、寡聚酶一、寡聚酶(oligomeric enzyme)(oligomeric enzyme)含有含有2 2个以上的亚基,分子量大(个以上的亚基,分子量大(3500035000以上)。以上)。可分为含相同亚基的寡聚酶和含不同亚基的寡聚酶。可分为含相同亚基的寡聚酶和含不同亚基的寡聚酶。寡聚酶普遍存在,单体酶的数量则较少。寡聚酶普遍存在,单体酶的数量则较
11、少。(含不同亚基的)寡聚酶的不同亚基执行不同的功能。(含不同亚基的)寡聚酶的不同亚基执行不同的功能。催化功能和底物载体的功能。催化功能和底物载体的功能。寡聚酶是代谢调节的方式之一。寡聚酶是代谢调节的方式之一。现在学习的是第16页,共34页二、同工酶二、同工酶(isoenzyme)(isoenzyme)概概念念:存存在在于于同同一一种种属属或或不不同同种种属属,同同一一个个体体的的不不同同组组织织或或同同一一组组织织、同同一一细细胞胞(位位置置),具具有有不不同同分分子子形形式式(结结构构)、理理化化性性质质和和免免疫疫学学性性质质,但但却却能能催催化化相相同同的的化化学学反反应应(功功能能)的
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