聚丙烯酰胺凝胶电泳讲稿.ppt

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1、关于聚丙烯酰胺凝胶电泳关于聚丙烯酰胺凝胶电泳第一页，讲稿共三十页哦 一、一、PAG PAG 的的 组成组成 PAG是是由由丙丙烯烯酰酰胺胺（acrylamide，Acr）单单体体和和N，N-亚亚甲甲双双丙丙烯烯酰酰胺胺（N，N，N，N-methylene bixacrylamide，Bis）交交联联剂剂通通过过自自由基聚合而成的一种多孔三维网状结构。由基聚合而成的一种多孔三维网状结构。Acr+Bis-多孔三维网状结构多孔三维网状结构 第二页，讲稿共三十页哦l（1）丙烯酰胺结构式第三页，讲稿共三十页哦（2）亚甲双丙烯酰胺）亚甲双丙烯酰胺第四页，讲稿共三十页哦第五页，讲稿共三十页哦 二、二、PAG

2、 PAG 的的 聚聚 合合 需要催化剂需要催化剂氧化还原系统作用，使氧化还原系统作用，使AcrAcr单单体带有游离基，从而与体带有游离基，从而与BisBis进行聚合。进行聚合。第六页，讲稿共三十页哦 （一）化学聚合：（一）化学聚合：AP-TEMED系统系统 过硫酸胺过硫酸胺(NHNH4 4)2 2S S2 2O O8 8（Ammonium persulfateAmmonium persulfate，APAP）作为催化剂，四甲基乙二胺作为催化剂，四甲基乙二胺（TEMEDTEMED）为加为加速剂。速剂。第七页，讲稿共三十页哦 APAP在在水水溶溶液液中中能能产产生生游游离离基基SOSO4 42-2

3、-，使使丙丙烯烯酰酰胺胺单单体体的的双双键键打打开开，活活化化形形成成自自由由基基丙丙烯烯酰酰胺胺，然然后游离后游离AcrAcr和和BisBis作用就能聚合形成凝胶。作用就能聚合形成凝胶。TEMEDTEMED的游离碱基能促进的游离碱基能促进APAP的形成的形成SOSO4 42-2-。注意：注意：TEMEDTEMED量量多多少少都都会会影影响响催催化化作作用用，须须在在碱碱性性条件下聚合条件下聚合 分分子子氧氧存存在在，聚聚合合不不完完全全，须须去去除除分分子子氧氧，隔绝氧隔绝氧 升升高高温温度度能能提提高高聚聚合合，降降低低温温度度能能延延迟迟聚聚合合第八页，讲稿共三十页哦 （二）光聚合：核黄

4、素（二）光聚合：核黄素-TEMED系统系统核核黄黄素素（riboflavinriboflavin）在在光光照照下下（可可见见光光或或紫紫外外光光）分分解解，其其黄黄素素部部分分被被还还原原成成无无色色型型，但但在在有有氧氧条条件件下下无无色色型型又又被被氧氧化化成成带带有有游游离离基基的的黄黄素素，其也能使其也能使AcrAcr和和BisBis聚合形成凝胶。聚合形成凝胶。注意：注意：分分离离胶胶的的合合成成一一般般采采用用化化学学聚聚合合。因因为为若若用用光光聚聚合合，凝凝胶胶的的孔孔径径受受光光照照强强度度与与时时间间的的影影响响，导导致致孔径大小不同，从而影响蛋白质的分离。孔径大小不同，从而

5、影响蛋白质的分离。第九页，讲稿共三十页哦 三、三、PAGPAG的浓度与孔径的关系的浓度与孔径的关系 PAGPAG孔孔径径的的大大小小主主要要由由AcrAcr和和BisBis这这两两种种单单体体的的浓浓度度决决定定。可可以以根根据据要要分分离离物物质质分分子子的的大大小小，选选择择合适的单体浓度。合适的单体浓度。Acr/BisAcr/Bis：2040 2040 完全透明且有弹性；完全透明且有弹性；10 10 很脆，易碎，不透明；很脆，易碎，不透明；100 100 糊状不成形，易破碎。糊状不成形，易破碎。第十页，讲稿共三十页哦 凝胶总浓度凝胶总浓度T100mlT100ml凝胶溶液中含有凝胶溶液中含

6、有AcrAcr和和 Bis Bis的总克数。的总克数。T=T=（a+ba+b）/m/m100%100%T T越大，凝胶孔径越小，适用于分离分子量较越大，凝胶孔径越小，适用于分离分子量较小的物质。小的物质。T T越小，凝胶孔径越大，适用于分离分子量较越小，凝胶孔径越大，适用于分离分子量较大的物质。大的物质。第十一页，讲稿共三十页哦CCBisBis占单体与交联剂总量的百分比。占单体与交联剂总量的百分比。C=b/C=b/（a+ba+b）100%100%当当T T固定时，固定时，BisBis浓度在浓度在5%5%时孔径最小。时孔径最小。第十二页，讲稿共三十页哦 四、不四、不 连连 续续 PAGEPAGE

7、 按具体操作分按具体操作分 垂直板形电泳垂直板形电泳 圆盘电泳圆盘电泳按凝胶系统的均匀性分按凝胶系统的均匀性分 连续连续PAGEPAGE 不连续不连续PAGE PAGE 第十三页，讲稿共三十页哦 Disc-PAGE Disc-PAGE 成分成分 作用作用样品样品胶胶 T=3%C=20%单体单体欲分离的样品溶液欲分离的样品溶液pH6.7 Tris-HCl缓冲液缓冲液混在一起，用光聚合方法混在一起，用光聚合方法聚合而成的大孔凝胶聚合而成的大孔凝胶有防对流作用有防对流作用 电极槽缓冲液通常为电极槽缓冲液通常为pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液甘氨酸缓冲液第十四页，讲稿共三十页哦 Disc-PAGED

8、isc-PAGE成分成分 作用作用浓浓缩缩胶胶除除不不加加样样品品外外，其其余余组组成成分同样品胶相同成成分同样品胶相同样品在此胶样品在此胶中被浓缩中被浓缩 第十五页，讲稿共三十页哦 Disc-PAGEDisc-PAGE成分成分 作用作用分分离离胶胶 T=7%C=2.5%T=7%C=2.5%单体溶液单体溶液pH8.9 pH8.9 Tris-HClTris-HCl缓缓冲冲液液化化学学聚聚合合法法聚聚合合成成小小孔孔胶胶主要的电泳主要的电泳分离部分分离部分 第十六页，讲稿共三十页哦 分分 离离 原原 理理1.1.浓缩效应浓缩效应1 1）凝胶层的不连续性）凝胶层的不连续性 两层凝胶两层凝胶T T与与

9、C C不同不同孔径不同孔径不同 浓缩胶孔径大，分离胶孔径小，蛋白质在大孔径浓浓缩胶孔径大，分离胶孔径小，蛋白质在大孔径浓缩胶中移动，受阻力小，移动速度快。缩胶中移动，受阻力小，移动速度快。第十七页，讲稿共三十页哦 2 2）缓冲液离子成分的不连续性）缓冲液离子成分的不连续性甘氨酸甘氨酸（pI=6.0pI=6.0）在在pH8.3pH8.3带负电，朝正极移动，带负电，朝正极移动，进入浓缩胶（进入浓缩胶（pH6.7pH6.7），），甘氨酸解离度（甘氨酸解离度（）很）很小，有效迁移率（小，有效迁移率（M M ）很低，移动速度较慢，很低，移动速度较慢，称为称为慢离子慢离子。HClHCl 是强电解质，是强电

10、解质，=1=1，ClCl-有效迁移率大，移动有效迁移率大，移动速度快，称速度快，称快离子快离子。蛋白质蛋白质（pIpI6.06.0）带负电荷，带负电荷，有效迁移率介于两有效迁移率介于两者之间。者之间。第十八页，讲稿共三十页哦pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液甘氨酸缓冲液甘氨酸甘氨酸甘氨酸甘氨酸HClHClHClHCl蛋白质蛋白质蛋白质蛋白质样品胶样品胶浓缩胶浓缩胶分离胶分离胶样品样品样品样品低低电电导导区区第十九页，讲稿共三十页哦 3 3）pHpH值的不连续性值的不连续性 为为了了控控制制慢慢离离子子的的解解离离度度，从从而而控控制制其其有有效效迁迁移移率率，必必须须使使浓浓缩缩胶胶与与分分离

11、离胶胶之之间间pHpH值值有有所所区区别。别。第二十页，讲稿共三十页哦 3.3.分子筛效应与电荷效应分子筛效应与电荷效应 进入分离胶后，进入分离胶后，GlyGly-成为快离子成为快离子 分分离离胶胶只只有有电电荷荷效效应应和和分分子子筛筛效效应应，根根据据各蛋白质所带电荷不同、分子大小不同而分离各蛋白质所带电荷不同、分子大小不同而分离第二十一页，讲稿共三十页哦第二十二页，讲稿共三十页哦第二十三页，讲稿共三十页哦第二十四页，讲稿共三十页哦第二十五页，讲稿共三十页哦 五、五、PAGE PAGE 的的 特特 点点1.1.具有分子筛效应，分辨率高具有分子筛效应，分辨率高2.2.样品不易扩散，用量少，灵

12、敏度可达样品不易扩散，用量少，灵敏度可达1010-6-6g g3.3.化学性质稳定，分子结构中富含酰胺基具有稳定化学性质稳定，分子结构中富含酰胺基具有稳定的亲水基团的亲水基团4.4.凝胶不带电荷，消除了电渗现象凝胶不带电荷，消除了电渗现象5.5.机械强度好，有弹性，在一定浓度范围内无色透机械强度好，有弹性，在一定浓度范围内无色透明明6.6.网孔可调节网孔可调节 第二十六页，讲稿共三十页哦 小小 结结1.掌握（不连续）掌握（不连续）PAGE的原理的原理2.掌握影响掌握影响PAGE迁移率的因素迁移率的因素3.掌握掌握PAGE的操作注意点、试剂作用的操作注意点、试剂作用4.熟悉熟悉PAG的聚合的聚合第二十七页，讲稿共三十页哦思思 考考 题题名词解释名词解释1.凝胶总浓度凝胶总浓度2.凝胶交联度凝胶交联度问答题问答题1.与与CAME相比，相比，PAGE有哪些特点。有哪些特点。2.试比较试比较CAME与与PAGE操作的区别。操作的区别。3.简述不连续简述不连续PAGE的原理。的原理。第二十八页，讲稿共三十页哦第二十九页，讲稿共三十页哦感感谢谢大大家家观观看看第三十页，讲稿共三十页哦