薄层分析酶抑制技术和荧光技术.pptx

《薄层分析酶抑制技术和荧光技术.pptx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《薄层分析酶抑制技术和荧光技术.pptx（64页珍藏版）》请在淘文阁 - 分享文档赚钱的网站上搜索。

1、近代薄层色谱发展的类别简介薄层板法（略）圆筒色谱（管状色谱）法 将固定相涂渍在管的外壁上，可以减少横向扩散，宜于制备色谱用。如果为小孔径管就为色谱棒。锥形薄层色谱法 将薄层板制作成倒圆锥体。展开时可以使溶剂前沿扩大，展开剂向前沿扩散时形成速度梯度，结果抵消了谱带扩展，使试样再度浓缩。第1页/共64页径向薄层色谱法两种类型：一种与圆形纸上色谱方法相似，分离效果可以提高1.5倍；另一种是将普通薄层板点样处固定相刮去，使展开剂只能通过点样处狭窄部分向前方弧形展开。连续展开法在密闭槽中进行上行展开，展开剂移动一定距离后即终了。顶板蒸发展开用盖带有槽孔的展开槽，使部分薄层板露出槽外。展开时，槽里的展开剂

2、不能蒸发，当上升到槽外时就蒸发。这种展开法能够缩短展开剂移动满的斑点之间的距离，不能够提高分离效能。第2页/共64页开口槽展开法薄层板在没有上盖的展开槽中展开。展开过程中展开剂随时可以蒸发。越往上蒸发越快。当展开剂到达一定高度时，上行展开剂与蒸发展开剂速率相等，此时形成了负的速度梯度，提高了移动慢的组分的分离度，而降低了移动快的组分的分离度。第3页/共64页热板展开法在薄层板的背面用热块加热。在高分离度区域加热，形成溶剂速度梯度和溶剂极性梯度，从而改善分离度并可使斑点高度浓缩，提高痕量组分的检测灵敏度。连续展开是分离结构相似的多组分的有效方法。为了防止蒸发时色谱条件受槽外条件影响和展开剂污染空

3、气，可以用在薄板顶端加吸附剂（多层滤纸）吸附展开剂的方法。第4页/共64页梯度展开法与双向展开法梯度展开法展开过程中不断按照一定比例改变展开剂中溶剂的组成。这种方法有时能够提高分离效果，特别是反相薄层色谱中常用。双向展开法将试样点在薄层板的一角，先沿一个方向展开。取出薄层板，干燥后旋转90 o，然后再用同一种展开剂或换另一种展开剂沿另一方向展开。使前一次展开后的重叠斑点得以分离。第5页/共64页双向展开法特点双向展开法还可以用以检测对光、热、酸、碱不稳定的组分。试样斑点经第一次展开后用光照或加热或用酸碱处理，旋转90 o，再用相同的展开剂在相同条件下展开，凡是在对角线上的斑点都是稳定的，凡是不

4、在对角线上的点都是分解产物或反应产物。第6页/共64页多次展开法试样经一次展开不能的到很好的分离结果时，是薄层板上的溶剂挥发后重新用展开剂展开。如此反复多次，直到有满意分离结果为止。第7页/共64页单向或双向多次展开同一种展开剂单向或双向多次展开，反复展开时由于后沿比前沿移动快，可以使散开的斑点合拢，提高检测灵敏度。用两种或两种以上不同的展开剂分别进行多次展开，可以将不同的的组分分开，称为阶梯式展开或多极展开。第8页/共64页薄层色谱分析方法薄层色谱主要用于定性分析，重要的指标是Rf i。Rf i=xi/Y Xi：溶质i从点样点所行距离；Y：溶剂所行距离Rf影响因素：溶剂极性，吸附剂活度，薄层

5、厚度，层析缸中溶剂蒸汽饱和度，空气湿度。固相选择：如前所述。操作：制板、晾干、活化、点样、展开、显色（计算Rf）第9页/共64页溶剂（展开剂）选择溶剂（展开剂）选择：略。一般情况下用用混合溶剂剂调节极性。弱极性溶剂：石油醚、烃、卤烃中等极性：乙醚、丙酮、醇，强极性：水，吡啶 酸商品农药和已知种类的残留农药一般都选定了薄层条件。第10页/共64页25种常见有机磷农药展开系统 吸附剂/展开剂1.硅胶/：甲苯2.硅胶/乙酸乙酯与CH2Cl2(1:1)3.硅胶/己烷丙酮（4：1）4.聚酰胺/己烷丙酮（4：1）5.聚酰胺/己烷醋酸（19：1）6.聚酰胺/甲醇水（1：1）7.聚酰胺/乙醇水氨水（4：4：2

6、）第11页/共64页聚酰胺薄板制备与展开实例1g吸附剂加入50mL带磨口塞的三角瓶中，再依次加入2mL甲醇、1mLCHCl3和2mL乙酸乙酯。每加一种溶剂充分振摇，使十分均匀。取待涂片放在大玻璃片上，排一条。两边放等厚玻片下垫厚片（厚度与薄层同）将浆倒在装好的玻璃片上，用玻璃棒推均匀。通风干燥后可用。展开注意事项（色谱过程）点样后一定要使溶剂挥发至干；缸内蒸汽一定要饱和，二次展开一定要将薄板晾干后再展开。第12页/共64页薄层分析的显色的一般要求显色要求显色，少干扰或易排除物质组成恒定，符合一定化学式，待测物含量与色斑大小、的深浅有定量灵敏度好高，检出限量足够小。有色物要足够稳定显色条件显色尽

7、可能完成，可以加入过量显色剂酸度调节适宜温度显色时间要求短第13页/共64页几种显色记剂及显色方法显色：不同显色剂有不同显色法 色谱分析关键措施之一是显色显色剂 被显色物质 显 色 方 法 色 斑AgNO3/NH3 有机Cl.Br 1.0ml1MagNO3+5mol/L NH3丙酮185ml。灰或棕 日光或紫外光照5minPdCl2 含硫有机物 0.1gPdCl2+1MH2SO4 5ml.溶解后+100ml H2O.黄色 I2 多数农药 加热固体碘，使汽化 熏薄板510min。黄色 荧光硅胶 有紫外吸收农药 GF254.HF254制版，展开后挥发干溶剂，紫外照射下观察 紫色斑第14页/共64页

8、AgNO3显色方法应用实例亦有涂板时将AgNO3深入吸附剂内。方法1：0.1 g AgNO3溶于20mL苯氧乙醇，加丙酮至200mL,加3%H2O2于暗处保存。喷到板上后紫外照10min。浅棕色背景上有紫斑。检出限量0.05ug0.1ug。方法2：0.17g AgNO3+1mLH2O+5mL浓NH3H2O使用方法及色斑同上，检出极限0.05ug0.1ug第15页/共64页AgNO3显色方法与原理方法3：1g AgNO3+1mL水+95%乙醇至100mL，喷薄板。检出极限0.05ug。显色原理：农药中的-x与Ag+在吸附表面，紫外照射下生成Ag3 Cl2AgClnAg2Cl和AgClO,Ag;A

9、g2O,AgCl苯氧乙醇作用：加速AgNO3 与R-X的反应。H2O2防背景过深，紫外加速AgCl分解，亦可加速农药分解，故可以先照薄板10-15min后再喷AgNO3，再照2-3min。此法特点是显色快，防背景变黑。NH3水和苯氧乙醇同用效果更好第16页/共64页芳香胺显色法六种芳胺可以用于薄层显色：N，N-二甲苯胺、对苯二胺、联苯胺、联（邻甲苯胺）、二苯胺、乙基苯胺。在硅胶板上喷10%联苯胺/丙酮后 经日光或紫外照射显色。芳香胺显色其不足之处是灵敏度不高，色调不稳，只作定性或半定量分析。第17页/共64页芳胺显色的结果农药种类检出限量/g0.020.20.22.52.510DDE无色浅土黄

10、深土黄DDT黄色绿黄叶绿DDD无色弱棕明棕林丹浅蓝鲜蓝深蓝第18页/共64页芳胺显色的结果农药种类检出限量/g0.020.20.22.52.510艾氏剂无色极弱黄绿浅黄绿异狄氏剂无色极弱粉红粉红六六六极浅蓝鲜蓝深蓝克菌丹极浅酒瓶绿鲜酒瓶绿深酒瓶绿第19页/共64页一般显色剂的不足一般显色剂对同类农药缺乏选择性。例：硫代磷酸酯用pH（刚果红）指示剂显色机理是硫元素被氧化剂氧化成硫酸或水解成硫代磷酸而显色。显色灵敏性 二硫代硫醇型硫酮型不含硫的农药不显色第20页/共64页常用PH指示剂显色种类及颜色刚果红；3.0（蓝）5.2（红）溴酚蓝：3.1（黄）4.6（蓝）溴甲酚绿：4.0（黄）5.6（蓝)第

11、21页/共64页4-对硝基苄基吡啶作显色剂4-对硝基苄基吡啶是灵敏的烃化剂在一定PH条件下显色。其显色机理如下：兰色第22页/共64页其它显色法四乙撑五胺或吗啉在控制一定酸度下使平衡向有色物方向移动。HgNO3(亚汞)-NH3显色法中，含硫有机水解成活性S，生成HgS和Hg，显黑斑，显色中辅助试剂不可少第23页/共64页常见薄层显色法灵敏度及其范围指示剂斑点底色检出限量（ug）农药种类柠檬酸/硝酸亚汞/氨黑色浅灰0.020.03含S的磷酸酯苯氧乙醇/硝酸银/氨黑色浅灰0.020.1有机氯二苯胺/氯化锌绿/橙/紫蓝520有机氯磷酸酯第24页/共64页常见薄层显色法灵敏度及其范围指示剂斑点 底色

12、检出限量（ug）农药种类溴/刚果红蓝红0.20.5含S的磷酸酯NBP四乙撑五胺蓝白0.20.5磷酸酯（二嗪红色）溴/溴酚蓝黄蓝0.10.5含S的磷酸酯四溴苯酚磺酸乙酯/硝酸银蓝紫 黄0.051.0含S的磷酸酯第25页/共64页常见薄层显色法灵敏度及其范围指示剂斑点底色 检出限量（ug）农药邻联苯胺/碘化钾黄绿蓝白0.20.5有机氯、有机氟对硝基偶氮氟硼酸盐蓝紫橙0.0110 磷酸酯/氨基甲酸酯双硫腙黄红浅绿 0.02有机汞二氯化钯蓝/黄/褐 白0.53.0 含S、P氯的酯类化合物第26页/共64页常见薄层显色法灵敏度及其范围指示剂斑点底色 检出限量（ug）农药N2，6二氯对苯并醌亚胺蓝无微克级

13、氨基甲酸酯氨基安替比林/铁氰化钾红紫/黄 微克级氨基甲酸酯磷酸/鞣酸/丙酮洋红 无1.0天然除虫菊酯其它显色剂：碘蒸汽；硝酸银/溴甲酚绿；氯亚明丁；亮绿；孔雀绿；二氯醌亚胺；邻联二茴香胺；靛红/硫酸等显色剂（法）。第27页/共64页薄层-酶抑制技术薄层-酶抑制技术是薄层显色技术的特殊方法。特点：灵敏度高，适应性广，可以检出化学显色检不出的物质显色原理：有机磷与氨基甲酸酯农药对辅乳动物毒性在于抑制中枢和周围神经系统胆碱酯酶。胆碱酯酶分解乙酰胆碱和醋酸，其它酯类也会水解成显色物质。而农药所在之处，由于胆碱酯酶被抑止则基质物质不能水解显色，所以在有色背景上出现无色斑点。故酶抑制技术实际上是酶水解基质

14、显色而非农药显色。第28页/共64页酶种来源1、动物肝脏酯酶2、人血浆或血清3、马血清或黄鳝胆碱酯酶4、蜜蜂或蝇头的脑酯酶5、牛胰腺酵素或酸性磷酸酯酶6、动物羧酸酯酶第29页/共64页酶基质各种乙酰胆碱、乙酸萘酯、羧酸酯、乙酰羟基吲哚等1、乙酸羟基吲哚及其衍生物2、乙酸-萘酯及其衍生物3、卤化乙酰胆碱4、乙酸靛酯5、磷酸硝基苯酯6、-N-苯甲酰基-DL赖氨酸-对硝基苯胺盐酸盐（CBAPNA）只适用于胰酶第30页/共64页 乙酰胆碱-溴百里酚蓝显色法显色原理：乙酰胆碱被酶分解出胆碱与乙酸，然后用溴百里酚蓝显色；pH6.2（黄色）7.6（兰色）。反应方程式如下：第31页/共64页乙酸-萘酯固蓝B盐

15、显色法 酶分解出-萘酚与固蓝盐B显紫红色乙酰羟基吲哚显色法利用水解产生-羟基吲哚与氧气产生靛蓝（蓝底白斑）。第32页/共64页醋酸靛酯显色法利用醋酸靛酯水解产生靛酚蓝显色。靛酚蓝（兰色）第33页/共64页TCL-EI技术基质显色情况酶机质斑点底色乙酸-萘酯固蓝B盐白紫红吲哚乙酸酯白蓝5溴吲哚乙酸酯白蓝/紫红5溴6氯吲哚乙酸酯 白粉红乙酰胆碱+溴百里酚蓝蓝黄第34页/共64页TCL-EI技术基质显色情况酶机质斑点底色5溴4氯吲哚乙酸酯白蓝绿吲哚酚+固蓝RR白粉红5溴4氯吲哚乙酸酯+固蓝RR白粉红第35页/共64页酶液制备从动物肝制取酶液动物肝 一份3(去筋膜;脂)加三份蒸馏水,匀浆离心分离,取清

16、液-备用.用时5-20倍稀释。从动物血清制取酶液刚抽出马血,不加抗凝剂练凝，取清液备用。用时加1-5倍水稀释(保质1年)。将清液加如22%Na2SO4 溶液(1:22)，于37静置24小时,去沉降,可以延长储存期，还可改善斑点模糊的情况。第36页/共64页机质及显色剂基质1、乙酸萘脂10mg 溶于5-6 mL无水乙醇2、乙 酸 羟 基 吲 哚 15mg溶 于 5 mL无 水 乙 醇(或 20mg加 2mL 无 水 乙 醇,用 时 加8mLPH=9.4的硼酸液混合).3、乙酸靛酯1.5 mg溶于15mL无水乙醇.显色剂：20-25mg固蓝盐B溶于16mL 蒸馏水1.65gK3Fe(CN)6+1.

17、84 g K4Fe(CN)6溶于100mL 蒸馏水缓冲溶液：0.2M三羟甲基氨基甲烷(Tris)25 mL+20mL0.1MHCl蒸馏水至100mL(pH=8.32).第37页/共64页显色方法展开后的薄板,喷酶工作液至湿润状态,调恒温箱温度37-38 相对湿度80-90%,酶活化30分钟,取出喷基质,数十分钟显色衬斑.酶液与基质液配比酶:鼠肝酯酶或马血清工作液,B盐16mL与酯液6mL 混合乙酸萘酯固盐B显色法.乙酸羟基吲哚牛肝酯酶或马血清工作液Tris/HCl 4 mL +2mol/LNaCl5mL+1mol/LCaCl2 0.2mL +K3Fe(CN)6 与K4Fe(CN)6 2 mL+

18、蒸馏水13mL+5mL乙酸羟基吲哚或乙酸靛酯混合。第38页/共64页基质应用条件 乙酸5溴羟基吲哚基质动物肝酶与 Tris/HCl 1:8稀释成工作液对多种氨基甲酸酯农药检出限量为0.1-10毫微克.乙酸 靛酯基质基质15mL与K3Fe(CN)6 与K4Fe(CN)6 2 5mL混合 蜜蜂脑酶与 Tris/HCl 1:25混合牛肝酯酶和胰酶素用于TCL-E1检测有机氯农药,许多酶抑制剂在生物体内是弱作用,有时转化成它们的氧化类同物可能有强抑制作用,可能足够的抑制能力.第39页/共64页酶抑制剂转化剂和薄层厚度发烟HNO3，稀溴/水，溴蒸汽，溴代琥珀酰亚胺(NBS)，双氧水/乙酸，间氯过氧苯甲酸

19、，紫外光,双氧水/氨。酶抑制剂的薄层比一般薄层厚一些,一般为350-500 毫微米,为酶基质提供较充分的支持介质,可获得低色与抑制斑较强的反差。酶浓度过大或过多会覆盖抑制部分,会使斑点被显色物所盖.第40页/共64页薄层荧光分析技术荧光产生原理荧光：一个电子从最低激发单线态回到基态时发射的光子。其放出量子的能量低于吸收量子的能量。薄层原位荧光测定技术中以近紫外和可见光作激发光，荧光侧在可见光区。农药测定技术中可以用以下方法：1、薄 层背景猝灭，斑点荧光；2、背景荧光，斑点猝灭。第41页/共64页物质结构与荧光的关系一般刚性、平面 芳香结构有利于发生荧光;给电子基，如-OH、-NH2 倾向于增强

20、荧光.空间张力和吸电子基使荧光 熄灭或减弱，可旋转弯曲的分子有损于受激能量。有些农药分子本身具备荧光特性，有些要经过处理才有荧光。第42页/共64页农药预处理方法本身不产生荧光的农药分子经过化学反应，使之转变成产生荧光的分子。水解使农药生成荧光离子或化合物.。如羟基苯并 吡喃(蝇毒磷)；含氨基苯甲酸(谷硫磷)。2-氨基苯并咪唑 (苯莱特)N-羟基萘甲酰胺。西维因及其代谢物水解成萘酚阴离子。第43页/共64页配位基基交换产生荧光配位基基交换产生荧光是指农药水解产物与金属配合物反应，交换出金属鳌合物中可以产生荧光的配体阴离子。如脱叶磷水解产生丁硫醇，丁硫醇可以把8 羟基喹啉磺酸的 钯 螯合物中的8

21、 羟基喹啉交换出来,而显荧光(在氯化镁存在下)。含硫有机磷化合物经溴活化处理生成溴化氢，溴化氢置换 螯合物中配体而显荧光。钙黄绿素金属鳌合物与某些农药配基交换。第44页/共64页影响荧光的因素吸附剂上的溶剂可以显著影响荧光强度和波长。极性溶剂比烃类溶剂更能增强荧光。如5无取代的黄酮，在非极性溶剂中无荧光,而在极性溶剂中强荧光。在薄层上喷上非瑟酮，能在弱荧光或非荧光底板上显农药光斑。用于氨基甲酸酯极性农药最小检出限量为10-60微克.第45页/共64页PH值和温度对荧光的影响PH值改变往往使荧光明显改变。如含硫有机物磷农药经Br2 处理，产生HBr，在农药斑点的酸性条件下，喷上DDQ(2，3-二

22、氯-5，6-二氰基对苯醌)的中性溶液,在农药斑的酸性条件下DDQ强烈发荧光。热处理：某些原有荧光的农药经热处理,使荧光激发和发射峰显著向长波方向移动。并增加强度，其结果是使检出限量更小。如2-（2吡喃）-苯并咪唑，在薄层上加热处理后最小检出限量从1000微克提高到2微克.第46页/共64页荧光标记荧光标记是荧光试剂取代无荧光农药分子中一个简单原子，形成有荧光化合物的过程。许多含羰基官能团的农药,通常用2-（二苯乙酰）-1，3-茚满二酮-1-腙和2-羟-5-甲氧基苯甲酰肼或5-甲氧基-2-硝基水杨酰肼标记。用于标记含羰基农药分子的荧光试剂第47页/共64页含伯仲叔胺的农药的荧光标记经还原或水解生

23、成伯仲叔胺的农药一般用DS氯化物，NBD氯化物（4-氯-7-硝基-2-1，3-恶二唑）和荧光胺等标记形成了强荧光衍生物。如甲氨基酸脂农药水解产物酚和甲胺,苯胺基甲酰脂和取代脲除草剂产生苯胺等.荧光胺只与伯胺产生衍生物。标记伯、仲、叔胺农药分子的荧光试剂第48页/共64页荧光显色技术实例氯化钯钙黄叶绿素显色：农药斑显色法适用范围：含硫有机磷农药原理：在盐酸介质中Pd2+与二硫代或硫代物型磷酸分别形成1:1型或者1：2型螯合物，在白色薄底上现黄褐斑.检测出限量为微克级。加钙黄绿素和钙黄绿素蓝，金属荧光试剂所发荧光可被副族金属离子猝灭。猝灭的荧光试剂喷于活性硫的农药斑上。游离出钙黄绿素，荧光很强，检

24、出限量可达10-150毫克级.第49页/共64页试剂配制取PdCl2溶于浓盐酸配成5%的溶液，用0.1MHCl稀释成0.05mol/L(PdCl2 MW=177.31)。取一定的钙黄绿素(MW=622.54)，用0.1mol/L NaOH配成0.02M溶液.取 两 溶 液 按 一 定 比 例 混 合,加 入 数 滴 5mol/LNaOH溶 液,用 0.05mol/L的 H3PO4调 至pH=7.2，并稀释成2.0 10-4 mol/LPd2+和1.6 10-4mol/L钙黄绿素，或6.010-4 mol/L钙黄绿素。贮存数小时，可保最大猝灭。临用前用1:1丙酮和水稀释成工作液。第50页/共64

25、页工作液的浓度要求工作液的浓度要求如下:1.010-4 mol/LPd2+和8.010-5mol/L钙黄绿素5.010-5mol/LPd2+和4.0 10-5mol/L钙黄绿素1.010-4mol/LPd2+和3.0 10-4mol/L钙黄绿素显色:上述工作液喷展开后的薄板呈透明状,二硫代磷酸酯干后一小时可在紫外光下检出。硫代磷酸酯的薄板放在存饱和硝酸钙溶液的密闭容器中(相对湿度57%)18-24小时.或在洁净的空气中同样长的时间，用3650nm 照射，粉红底上出现蓝色荧光。第51页/共64页荧光显色剂与罗丹明B显色法不同的荧光物质中具有N-甲基和N-乙基者，对有机氮显色快,灵敏度大，Cl-干

26、扰小,如：N，N，N，N四乙基联苯胺；N，N二甲基荧光蒽；N甲基咔唑，3氨基芘；罗丹明B和试卤灵。第52页/共64页罗丹明B溶液的配制取罗丹明B50mg溶于50ml 水作为储备液。使用时取储备液10mL，加于含0.3gKBr和0.6gKOH的80 mL水中，喷于展开后的薄板上。置薄板于254350nm下照1030min，趁薄板上有一定温度时观察，紫外背景上有黄红荧光，而农药斑点处荧光猝灭。板干后再喷丙酮/水（1：1），荧光再现。此显色液一天有效。第53页/共64页罗丹明显色(对有机氯较灵敏)A溶液：25 mg罗丹明B溶于于25ml 水中备用。.B溶液：取A溶液5 ml与含0.15 KBr 和0

27、.3g KOH的40 ml水溶液混合得。C溶液：B溶液与丙酮混合液(1:1)显色:展上喷B液后在250或350nm紫外光 照1-30分钟，底板红荧光，斑点猝灭。干后再喷C液，斑点再现。有机氯农药可检出至20微克。第54页/共64页薄 色谱定量方法简介原位斑点定量法有直接法与间接法。直接法：面积、色阶、工作曲线。间接法：色谱扫描仪与光密度计。溶出定量：与光度计、光谱、气谱、液谱、质谱、极谱联用。称重法:将色斑标记，在Xe 或X复写机获得色谱斑复本，剪下斑点纸片，在分析天平称重；或把色谱斑吸附剂剥下称重。沿半对数纸的横坐标对农药称量(纵坐标)作图，绘制工作曲线以斑点重查典线得样品农药重.第55页/

28、共64页色谱色阶比色法 将标准系列与待测样的一定量点在同一薄 层板上展开显色。依面积大小，色度深浅概括样品定量。此法实际上只是半定量。溶出1法:将斑点剥离后用溶剂浸出,经适当处理，配合仪器联用。此法实际上是只用薄 层分离提纯。含磷农药浸出后用硫酸/高氯酸变成磷酸。然后与 钼酸铵作用生成磷 钼酸。PO43-+12MoO42-+27H+=H7P（Mo2O7）6+10H2O磷钼酸还原成磷钼酸蓝：H7P（Mo2O7）6+2 SnCl2+4HCl=H7P（Mo2O7）5+Mo2O5+SnCl4+2H2O第56页/共64页分析过程 取下有机磷药斑于离心试管中，加如少量丙酮或甲酸浸出，离心分离，反复三次。合

29、并浸取液，挥发溶剂，加50%硫酸 6滴，4滴高氨酸。小心加热 至 澄 清，加 1滴 酚 酞，NaOH中 和 至 微 红，1mol/L的硫酸中和至无色，得样品液。称取KH2PO40.4394g，少量蒸馏水溶解后定容至100mL，取10ml 稀释至100mL，得含磷10g的工作液。加1%的（NH4）2MoO4/1mol/L硫酸3mL，加水至10mL，摇匀后加一滴 SnCl2/HCl,再摇匀用650nm波长测吸光度A。如此制作工作曲线,用样品液照工作液方法处理得A样,从而查出样品农药含量（g/mL）。第57页/共64页农药含量计算与影响因素农药含量=含磷量（g）k 提取液体积/点样体积样重 注意:用

30、农药标准样代替 KH2PO4时 误差较小 反 应 时 的 酸 度(生 成 钼 蓝 时)0.48)0.481.441.44mol/LHmol/LH+薄层吸附剂含P有干扰用盐酸浸泡含吸附剂，反复漂洗;Fe3+与钼蓝形成混合物，降低吸光度，可以加NaF消除。SiO32-与钼酸铵形成黄色 H9Si（Mo2O7）6还原时也生成硅钼蓝,可以用柠檬酸或酒石酸来-控制 MoO42浓度从而达到控制 MoO42-与 SiO32-作用；AsO43-与 MoO42-作用可用Na2SO3除去。第58页/共64页斑点面积计算法:色斑面积计算法主要是依S.T Purdg原理：A1/2=mlgw+C其中A为斑点面积，C为常数

31、，m为待定系数，w为农药质量。对每种农药定量线性范围应由多次实验测出.对于农药标准品：A1/2s=mlgws +C对于稀释农药的标准品：A1/2d=mlgwd +C。d为稀释倍数。第59页/共64页常数m，c的确定联立两方程，解出 m，c。m=（A1/2s A1/2d）/（lgws lgwd）m=（A1/2s A1/2d）/lg（ws/wd）分析式样：A1/2=mlgw+CA1/2=A1/2s+（lgw lgws）（A1/2s A1/2d）/（lgws-lgwd）lgw=（lgws lgwd）（A1/2 A1/2s）/（A1/2s A1/2d）+lgws lgw=lgd（A1/2 A1/2s）

32、/（A1/2s A1/2d）+lgws第60页/共64页薄层色谱扫描定量法对已分离的斑点类似于分光光度法，只是扫描测定在薄层上进行。其准确度受吸附剂粒度、形状、厚度、显色条件、斑点大小、边缘清晰度的影响。扫描测定时，光束射到一个非匀相表面，散射光作用使光电倍增管作用的消光值与被测物质含量不符合Lambert-Beer定律。为此在一般扫描仪中（岛津-910型双波段扫描仪）设计了一系列如双波段，曲线扫描，校正曲线直线法，背景校正等技术。使测定达预期效果。第61页/共64页扫描光波选择1.对可见光有吸收的斑点直接用可见光扫描。2.对紫外光有吸收的斑点，直接用紫外光扫。3.具有激发荧光的物质，直接用发

33、射荧光扫4.上述均没有的，化学处理（显色）后扫此法分两步：1、按薄层色谱要求和程序处理，分离显色后直接上机扫2、配制待测标准系列，与待测样相同条件下展开，分离显色后扫描测定，作校正仪器用。第62页/共64页薄层扫描仪工作流程 流程：光源 光路系统 检测光电信号 前置放大 背景校正 曲线校正 放大 模拟积分 记录仪或计算机操作：将待测薄层置于工作台，使斑点处于被扫描测定位置接通线性化仪和背景补偿仪。随扫描进行，记录器纸上将被扫描斑点对应波峰和积分值图象用打印机打出；配有ETA色谱仪数值处理仪，扫描结束。打印出农药实际含量，且精确性高，重现性好。CS110扫描仪对同一样品连续扫60次，误差只有0.5%。对分离后图形不规则，边缘不清晰的点，扫描定量，可以得满意结果。一般2020cm板上十多个点，10分钟可完成。第63页/共64页感谢您的观看！第64页/共64页