酶及细胞固定化讲稿.ppt

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1、关于酶及细胞固定化第一页，讲稿共七十一页哦什么是固定化酶？什么是固定化酶？水溶性酶水溶性酶水不溶性载体水不溶性载体水不溶性酶水不溶性酶（固定化酶）（固定化酶）固定化技术固定化技术第二页，讲稿共七十一页哦随着固定化技术的发展，作为固定化的对象不一定是酶，随着固定化技术的发展，作为固定化的对象不一定是酶，也可以是也可以是微生物细胞微生物细胞、植物细胞植物细胞、动物细胞动物细胞或或细胞器细胞器。此外，固定化生物催化剂的研究还发展到此外，固定化生物催化剂的研究还发展到多酶体系多酶体系的固定化，以及带有的固定化，以及带有ATPATP、NAD(P)NAD(P)这一类这一类辅酶辅酶的复合酶的复合酶反应系的固

2、定化。反应系的固定化。第三页，讲稿共七十一页哦第一节第一节 概述概述一、一、固定化酶的优缺点固定化酶的优缺点优点优点：多次使用多次使用 可以装塔连续反应可以装塔连续反应 纯化简单纯化简单 提高产物质量提高产物质量 应用范围广应用范围广缺点缺点：首次投入成本高首次投入成本高 大分子底物较困难大分子底物较困难第四页，讲稿共七十一页哦 二、二、固定化的原则固定化的原则酶酶催催化化作作用用依依靠靠它它的的高高级级结结构构及及活活性性中中心心，固固定定化化时时活活性中心的必需基团应避免参加反应；性中心的必需基团应避免参加反应；避避免免高高温温、强强碱碱、有有机机溶溶剂剂以以及及高高浓浓度度盐盐的的处处理

3、理，保保护护靠靠氢氢键键、离离子子键键、疏疏水水键键等等弱弱键键维维系系的的酶酶蛋蛋白白质质的的高高级级结构。结构。尽可能在尽可能在温和条件温和条件下进行固定化反应。下进行固定化反应。第五页，讲稿共七十一页哦三、固定化酶的性质及其影响因素三、固定化酶的性质及其影响因素(一一)影响固定化酶性质的因素影响固定化酶性质的因素1 酶本身的变化，主要是由于活性中心的氨基酸残基、高级结构和电酶本身的变化，主要是由于活性中心的氨基酸残基、高级结构和电荷状态等发生了变化。荷状态等发生了变化。2 载体的影响载体的影响（1）分配效应分配效应（2）空间障碍效应空间障碍效应（3）扩散限制效应扩散限制效应3.固定化方法

4、的影响固定化方法的影响第六页，讲稿共七十一页哦(二二)固定化后酶性质的变化固定化后酶性质的变化1.酶活性下降酶活性下降：(1)酶活性中心的重要氨基酸与水不溶酶活性中心的重要氨基酸与水不溶性载体相结合；性载体相结合；(2)当酶与不溶性载体相结合时，它当酶与不溶性载体相结合时，它的结构起了变化；的结构起了变化；(3)酶被结合后虽不失活，但酶与底酶被结合后虽不失活，但酶与底物的相互作用受到空间位阻。物的相互作用受到空间位阻。前二种可用适当条件加以克服，而第三中则无法克服了。至前二种可用适当条件加以克服，而第三中则无法克服了。至于包埋法固定化酶的活性下降，可能是因为固定化过程中酶有些于包埋法固定化酶的

5、活性下降，可能是因为固定化过程中酶有些变化或者底物和产物对凝胶的渗透力较小之故。变化或者底物和产物对凝胶的渗透力较小之故。第七页，讲稿共七十一页哦2 对酶对酶稳定性稳定性的影响的影响操作稳定性提高操作稳定性提高贮存稳定性比游离酶大多数提高。贮存稳定性比游离酶大多数提高。对热稳定性，大多数升高，有些反而降低。对热稳定性，大多数升高，有些反而降低。对分解酶的稳定性提高。对分解酶的稳定性提高。对变性剂的耐受力升高对变性剂的耐受力升高原因原因:固定化后酶分子与载体多点连接。固定化后酶分子与载体多点连接。酶活力的释放是缓慢的。酶活力的释放是缓慢的。抑制自降解，提高了酶稳定性。抑制自降解，提高了酶稳定性。

6、第八页，讲稿共七十一页哦3固定化酶固定化酶pH的变化的变化载体带负电荷，载体带负电荷，pH向碱性方向移动向碱性方向移动；载体带正电荷，载体带正电荷，pH向酸性方向移动。向酸性方向移动。产物性质对产物性质对pH的影响的影响催化反应的产物为酸性时，固定化酶的催化反应的产物为酸性时，固定化酶的pH值比游离酶的值比游离酶的pH值高；值高；反之则低反之则低第九页，讲稿共七十一页哦4 最适温度最适温度变化变化一般与游离酶差不多，但有些会有较明显的变化。一般与游离酶差不多，但有些会有较明显的变化。5 底物特异性底物特异性变化变化作用于低分子底物的酶作用于低分子底物的酶 特异性没有明显变化特异性没有明显变化既

7、可作用于低分子底物又可作用于大分子低物的酶既可作用于低分子底物又可作用于大分子低物的酶 特异性特异性往往会变化。往往会变化。第十页，讲稿共七十一页哦6 米氏常数米氏常数Km随载体性质变化随载体性质变化由于分配效应：由于分配效应：=Si微环境微环境/S宏观环境宏观环境 Km=Km/(表观米氏常数表观米氏常数)（1）载体与底物带相同电荷，载体与底物带相同电荷，SiS,Km固固 定化酶降低了酶的亲和力。定化酶降低了酶的亲和力。（2）载体与底物电荷相反，静电作用，载体与底物电荷相反，静电作用，SiS，则，则 1,KmKm对简单的固定化酶系统，其动力学性质一般服从米氏方程：对简单的固定化酶系统，其动力学

8、性质一般服从米氏方程：第十一页，讲稿共七十一页哦四、评价固定化酶的指标四、评价固定化酶的指标1酶活定义（酶活定义（IU)：在特定条件下，每分钟催化一微摩尔：在特定条件下，每分钟催化一微摩尔底物转化为产物的酶量定义为底物转化为产物的酶量定义为1个酶活单位。个酶活单位。计量单位计量单位2.酶比活定义（游离）：每毫克酶蛋白或酶酶比活定义（游离）：每毫克酶蛋白或酶RNA（DNA)3.所具有的酶活力单位所具有的酶活力单位 品质的体现品质的体现第十二页，讲稿共七十一页哦1.固定化酶的比活：每（克）干固定化酶所具有的酶活力单位。固定化酶的比活：每（克）干固定化酶所具有的酶活力单位。或：单位面积（或：单位面积

9、（cm2）的酶活力单位表示（酶膜、酶管、酶板）。）的酶活力单位表示（酶膜、酶管、酶板）。2.操作半衰期：衡量稳定性的指标。连续测活条件下固定化酶活力下降为操作半衰期：衡量稳定性的指标。连续测活条件下固定化酶活力下降为最最初活力一半初活力一半所需要的时间（所需要的时间（t1/2）3.4.或称偶联效率，活力保留百分数。或称偶联效率，活力保留百分数。5.相对酶活力：具有相同酶蛋白（或相对酶活力：具有相同酶蛋白（或RNA）量的固定化酶活力与游）量的固定化酶活力与游离酶活力的比值称为相对酶活力离酶活力的比值称为相对酶活力第十三页，讲稿共七十一页哦五、五、固定化酶的活力测定方法固定化酶的活力测定方法1.振

10、荡测定法：称取一定量的固定化酶振荡测定法：称取一定量的固定化酶 加入一定量的底物溶液，加入一定量的底物溶液，一边振荡或搅拌，一边进行催化反应一边振荡或搅拌，一边进行催化反应 取出一定量的反应液进行酶取出一定量的反应液进行酶活力测定。活力测定。2.酶柱测定法：将一定量的固定化酶装进具有恒温装置的反应柱中酶柱测定法：将一定量的固定化酶装进具有恒温装置的反应柱中 让底物溶液以一定的流速流过酶柱让底物溶液以一定的流速流过酶柱 收集流出的反应液收集流出的反应液 测定其测定其中产物的生成量或底物的消耗量。中产物的生成量或底物的消耗量。3.连续测定法：利用连续分光光度法等测定方法可以对固定连续测定法：利用连

11、续分光光度法等测定方法可以对固定化酶反应液进行连续测定，从而测定固定化酶的酶活力。化酶反应液进行连续测定，从而测定固定化酶的酶活力。第十四页，讲稿共七十一页哦第二节第二节 固定化酶的制备固定化酶的制备（一）吸附法（一）吸附法（二）结合法（二）结合法（三）交联法（三）交联法（四）包埋法（四）包埋法（entrapping method）第十五页，讲稿共七十一页哦第十六页，讲稿共七十一页哦（一）（一）吸附法吸附法-物理吸附法物理吸附法（1 1）常用载体）常用载体无机物无机物有机物有机物高分子化合物高分子化合物活性炭、白陶土、活性炭、白陶土、氧化铝、多孔玻璃、氧化铝、多孔玻璃、硅胶、碳酸钙凝胶硅胶、碳

12、酸钙凝胶淀粉麸质、大孔树脂、淀粉麸质、大孔树脂、DEAEDEAE纤维素、纤维素、DEAEDEAE葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶（2 2）固定化酶的制备机理）固定化酶的制备机理所用载体具有活性，可将酶吸附到载体上。所用载体具有活性，可将酶吸附到载体上。（3 3）优缺点）优缺点 优点优点：酶蛋白活性中心不易被破坏，完整保持酶的：酶蛋白活性中心不易被破坏，完整保持酶的 高级结构高级结构;方法简单，成本低。方法简单，成本低。缺点缺点：酶吸附不牢固，易脱落；：酶吸附不牢固，易脱落；防止吸附酶的蛋白质与载体发生变性反应防止吸附酶的蛋白质与载体发生变性反应第十七页，讲稿共七十一页哦（一）（一）吸附法吸附法-离子键结合

13、法离子键结合法酶与具有离子交换基团的不溶性载体结合形成固定化酶酶与具有离子交换基团的不溶性载体结合形成固定化酶（1 1）所用载体）所用载体纤维素的衍生物，离子交换树脂纤维素的衍生物，离子交换树脂（2 2）固定化酶的制备机理）固定化酶的制备机理酶蛋白的带电基团和含有离子交换基团的固相载体酶蛋白的带电基团和含有离子交换基团的固相载体之间由于静电相吸而形成络合物，使酶吸附到离子之间由于静电相吸而形成络合物，使酶吸附到离子交换剂上。交换剂上。（3 3）优缺点）优缺点优点：操作简便，处理条件温和，酶的高级结构优点：操作简便，处理条件温和，酶的高级结构 和活性中心不易破坏，有利于制备高活性酶和活性中心不易

14、破坏，有利于制备高活性酶缺点：载体与酶的结合力较弱，在高离子强度下缺点：载体与酶的结合力较弱，在高离子强度下 酶易从载体上脱落酶易从载体上脱落第十八页，讲稿共七十一页哦(二二)共价键结合法共价键结合法 酶与不溶于水的载体以共价键形式结合制备固定化酶的方酶与不溶于水的载体以共价键形式结合制备固定化酶的方法。即，通过法。即，通过化学共价键化学共价键，把与，把与酶蛋白活性无关的氨基酸功酶蛋白活性无关的氨基酸功能基团能基团连接在不溶于水的连接在不溶于水的载体载体上。上。1.1.酶与载体反应的主要功能基团酶与载体反应的主要功能基团游离羟基：肽链游离羟基：肽链C C末端的末端的羧基、天门冬酰氨酸、羧基、天

15、门冬酰氨酸、谷氨酸的谷氨酸的羧基羧基 游离氨基：肽链游离氨基：肽链N N末端的末端的氨基、赖氨酸氨基、赖氨酸氨基氨基巯基：半胱氨酸巯基：半胱氨酸羟基：丝氨酸、苏氨酸羟基：丝氨酸、苏氨酸酚基：酪氨酸酚基：酪氨酸咪唑基：组氨酸咪唑基：组氨酸第十九页，讲稿共七十一页哦2.2.载体活化的方法载体活化的方法A A重氮法重氮法B B叠氮法叠氮法C C烷基化反应法烷基化反应法D D硅烷化法硅烷化法E E溴化氰法溴化氰法第二十页，讲稿共七十一页哦A A重氮法重氮法反应示意式如下：反应示意式如下：亚硝酸重氮化亚硝酸重氮化与酪蛋白反应与酪蛋白反应第二十一页，讲稿共七十一页哦A A重氮法重氮法目前在我们国内用的较多

16、的载体是目前在我们国内用的较多的载体是对氨基苯磺酰乙基（对氨基苯磺酰乙基（ABSEABSE）纤维）纤维素素、琼脂糖琼脂糖，葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶和和琼脂琼脂等等该方法需要载体具有该方法需要载体具有芳香族氨基芳香族氨基反应式及原理：反应式及原理：第二十二页，讲稿共七十一页哦A A重氮法例重氮法例5-磷酸二酯酶的固定化磷酸二酯酶的固定化此酶用来降解核酸，可分离得到四个此酶用来降解核酸，可分离得到四个5-单核苷酸；单核苷酸；对对-硫酸酯乙砜基胺（硫酸酯乙砜基胺（SESA）作为双功能试剂，将酶共）作为双功能试剂，将酶共价结合到多糖载体上；价结合到多糖载体上；本成果荣获国家发明三等奖，中国科学院上海生化研

17、究所袁本成果荣获国家发明三等奖，中国科学院上海生化研究所袁中一等，我国第一个用于工业生产的固定化酶）中一等，我国第一个用于工业生产的固定化酶）第二十三页，讲稿共七十一页哦B 叠氮法叠氮法例：用例：用羧甲基纤维素叠氮衍生物羧甲基纤维素叠氮衍生物制备固定化制备固定化葡萄糖淀粉酶葡萄糖淀粉酶步骤如下：步骤如下：酯化酯化：CM-纤维素先洗涤干燥，然后悬于无水甲醇中，在冰浴中通入纤维素先洗涤干燥，然后悬于无水甲醇中，在冰浴中通入HCl气体，进行酯化反应；然后洗涤，空气干燥。气体，进行酯化反应；然后洗涤，空气干燥。肼解肼解。把酯化后的。把酯化后的CM-纤维素悬于甲醇中，再加入纤维素悬于甲醇中，再加入80%

18、水合肼回流反应水合肼回流反应1小小时，过滤，洗涤干燥。时，过滤，洗涤干燥。叠氮化叠氮化。肼解后的。肼解后的CM-纤维素（纤维素（1g）加入）加入150ml 2%HCl在冰浴中混合，搅在冰浴中混合，搅拌滴加拌滴加9ml 3%NaNO2反应反应20min，过滤用冷蒸馏水洗涤，同时加酶。，过滤用冷蒸馏水洗涤，同时加酶。(4)偶联偶联：经叠氮化后的载体加入：经叠氮化后的载体加入0.05N pH 8.0 磷酸缓冲液（内含磷酸缓冲液（内含250-500mg酶），酶），5搅拌搅拌2-3小时，过滤，用小时，过滤，用 0.001N HCl，水洗涤，即为固定化葡萄糖淀粉酶，水洗涤，即为固定化葡萄糖淀粉酶（冻干保存

19、）。（冻干保存）。第二十四页，讲稿共七十一页哦将与载体反应的功能基将与载体反应的功能基团与各种重氮化剂、烷团与各种重氮化剂、烷化剂等反应形成共价键化剂等反应形成共价键制备固定化酶。制备固定化酶。纤维素纤维素+盐酸甲醇盐酸甲醇CMCCMC甲酯甲酯肼肼CMCCMC酰肼酰肼CMCCMC叠氮化物叠氮化物NHNH2 2酶酶亚硫酸钠亚硫酸钠盐酸盐酸固定化酶固定化酶 CHCH2 2CO-NHCO-NH酶酶CMCCMCCHCH2 2COOHCOOH制备酰肼制备酰肼叠氮化物叠氮化物羧甲基纤维素叠氮法制备固定化葡萄糖淀粉酶程序羧甲基纤维素叠氮法制备固定化葡萄糖淀粉酶程序纤维素羧甲基化纤维素羧甲基化羧甲基纤维素羧甲

20、基纤维素第二十五页，讲稿共七十一页哦C烷基化反应法烷基化反应法第二十六页，讲稿共七十一页哦D硅烷化法硅烷化法一般常用的载体：多孔玻璃，多孔陶瓷。一般常用的载体：多孔玻璃，多孔陶瓷。多孔玻璃特点：多孔玻璃特点：机械强度好，表面积大。机械强度好，表面积大。耐有机溶剂和微生物破坏。载体可以再生，寿命长等。耐有机溶剂和微生物破坏。载体可以再生，寿命长等。第二十七页，讲稿共七十一页哦E 溴化氰法溴化氰法本方法主要用溴化氰（本方法主要用溴化氰（CNBr）活化多糖类物质。如纤维素、）活化多糖类物质。如纤维素、葡聚糖、琼脂糖等。葡聚糖、琼脂糖等。第二十八页，讲稿共七十一页哦（三）（三）交联法制备固定化酶概念概

21、念：双功能试剂或多功能试剂与酶蛋白质中的氨：双功能试剂或多功能试剂与酶蛋白质中的氨 基酸残基作用，使酶与酶之间交联成网，基酸残基作用，使酶与酶之间交联成网，凝集成固定化酶凝集成固定化酶1 1、发生作用的氨基酸残基、发生作用的氨基酸残基：酪氨酸的酚基酪氨酸的酚基 胱氨酸的胱氨酸的SHSH巯基巯基 N N末端的末端的a a氨基。氨基。2 2、常用的双功能或多功能试剂、常用的双功能或多功能试剂：戊二醛戊二醛 聚甲叉双碘乙酰胺聚甲叉双碘乙酰胺 双重氮联苯胺双重氮联苯胺第二十九页，讲稿共七十一页哦 先将酶吸附在不溶于水的载体上，再用双功能试剂先将酶吸附在不溶于水的载体上，再用双功能试剂 戊二醛与酶蛋白的

22、氨基之间交联起来，形成酶网包围在戊二醛与酶蛋白的氨基之间交联起来，形成酶网包围在 载体表面。载体表面。常用载体常用载体：硅胶、离子交换树脂。：硅胶、离子交换树脂。第三十页，讲稿共七十一页哦（四）包埋法制备固定化酶 酶本身不参与反应，仅用物理方法把酶包埋在凝胶细小酶本身不参与反应，仅用物理方法把酶包埋在凝胶细小的格子中，或包围在半透膜或聚合物中。的格子中，或包围在半透膜或聚合物中。包埋方法有两种包埋方法有两种：1 1 格子型固定化酶格子型固定化酶2 2 微型胶囊法微型胶囊法（1 1）原理）原理 以丙烯酰胺、硅胶、淀粉琼脂等材料，在酶以丙烯酰胺、硅胶、淀粉琼脂等材料，在酶存在下聚合成凝胶，酶被包埋

23、在聚合物的细小多孔的网状存在下聚合成凝胶，酶被包埋在聚合物的细小多孔的网状格子中。反应为厌氧反应。格子中。反应为厌氧反应。第三十一页，讲稿共七十一页哦酶酶液液丙烯酰丙烯酰胺胺N N，N N双丙烯双丙烯酰胺酰胺氢气氢气催化剂：四甲基催化剂：四甲基乙二胺、明矾胺乙二胺、明矾胺引聚剂：引聚剂：过硫酸钾、核黄素过硫酸钾、核黄素光光照照聚合反应聚合反应凝胶酶块凝胶酶块固定固定化酶化酶切切割割（2 2）方法（以丙烯酰胺为材料是最常用的方法）方法（以丙烯酰胺为材料是最常用的方法）方法（以丙烯酰胺为材料是最常用的方法）方法（以丙烯酰胺为材料是最常用的方法）第三十二页，讲稿共七十一页哦第三十三页，讲稿共七十一页

24、哦2 微型胶囊法（1 1）原理）原理 把酶包在超薄半透性的把酶包在超薄半透性的聚合物膜中，制成球状含聚合物膜中，制成球状含酶微型胶囊。酶微型胶囊。（2）特点微囊直径几微米几百微米。微囊直径几微米几百微米。低分子底物可以自由通过并进入微囊内。低分子底物可以自由通过并进入微囊内。与酶反应后的生成物被排除在微囊外，与酶反应后的生成物被排除在微囊外，酶本身是高分子物质不能通过微囊而被留在微囊中，酶本身是高分子物质不能通过微囊而被留在微囊中，外部的蛋白分解酶、抗体等高分子物质也无法进入微囊内外部的蛋白分解酶、抗体等高分子物质也无法进入微囊内第三十四页，讲稿共七十一页哦以亲水性单体和疏水性单体在表面发生聚

25、合反应将酶以亲水性单体和疏水性单体在表面发生聚合反应将酶包围起来，形成微型胶囊酶。分三步：包围起来，形成微型胶囊酶。分三步：常用形成胶囊的材料和生成的聚合物种类：常用形成胶囊的材料和生成的聚合物种类：亲水性单体亲水性单体疏水性单体疏水性单体生成的聚合物生成的聚合物聚胺聚胺聚异氰衍生物聚异氰衍生物聚胺、聚酯聚胺、聚酯乙二醇、多元醇乙二醇、多元醇聚异氰衍生物聚异氰衍生物聚胺、聚酯聚胺、聚酯3.表面聚合法制备微型胶囊表面聚合法制备微型胶囊第三十五页，讲稿共七十一页哦A A 乳化分散：取含有酶和亲水性单体的水溶液，在不溶乳化分散：取含有酶和亲水性单体的水溶液，在不溶于水的有机溶媒中充分乳化。于水的有机

26、溶媒中充分乳化。B B 表面聚合：将含有疏水性单体的有机溶媒加入到上述乳化液表面聚合：将含有疏水性单体的有机溶媒加入到上述乳化液中，发生聚合反应，生成的薄膜把酶包围起来形成微型胶囊球。中，发生聚合反应，生成的薄膜把酶包围起来形成微型胶囊球。三步三步：C C 清洗：反应完成后，用有机溶剂洗去未反应的剩余单体清洗：反应完成后，用有机溶剂洗去未反应的剩余单体1 1表表面面聚聚合合法法第三十六页，讲稿共七十一页哦各类固定化方法的特点比较各类固定化方法的特点比较:比较项目比较项目吸附法吸附法结结合法合法 交联法交联法包埋法包埋法物理吸附物理吸附.共价键结合共价键结合离子键结合离子键结合 制备难易制备难易

27、易易难难易易 较难较难较难较难固定化程度固定化程度弱弱强强中等中等 强强强强活力回收率活力回收率较高较高低低高高 中等中等高高载体再生载体再生可能可能不可能不可能可能可能 不可能不可能不可能不可能费用费用低低高高低低 中等中等低低底物专一性底物专一性不变不变可变可变不变不变 可变可变不变不变适用性适用性酶源多酶源多较广较广广泛广泛 较广较广小分子底小分子底物、药用物、药用酶酶第三十七页，讲稿共七十一页哦 第三节 固定化细胞固定化菌体概念固定化菌体概念：把菌体细胞中特定的酶不经过分离提纯：把菌体细胞中特定的酶不经过分离提纯 ，直接用适当的方法将菌体加以固定，直接用适当的方法将菌体加以固定 来催化

28、各种特定的生物化学反应。来催化各种特定的生物化学反应。优点优点：不需提制酶，可保持酶的活性。反复使用，成：不需提制酶，可保持酶的活性。反复使用，成 本低本低与固定化酶比较与固定化酶比较制备方法制备方法：与固定化酶相同，有包埋法、载体结合法：与固定化酶相同，有包埋法、载体结合法 、交联法、热处理法、射线处理法。、交联法、热处理法、射线处理法。其中其中包埋法包埋法是最理想的方法是最理想的方法。第三十八页，讲稿共七十一页哦一 包埋法1 1 原理原理 在菌体细胞本身不发生化学反应的情况下，将其在菌体细胞本身不发生化学反应的情况下，将其 包进半透性的多聚物膜内。小分子的底物和产物均可包进半透性的多聚物膜

29、内。小分子的底物和产物均可 自由出入，而菌体细胞却不会漏出。自由出入，而菌体细胞却不会漏出。2 2 方法方法常用的包埋材料是：聚丙烯酰胺凝胶、明胶、琼脂常用的包埋材料是：聚丙烯酰胺凝胶、明胶、琼脂以制备含天门冬氨酸的大肠杆菌细胞为例以制备含天门冬氨酸的大肠杆菌细胞为例将菌体细胞预先用生理盐水悬浮，向悬浮液中加入聚丙烯酰胺和甲将菌体细胞预先用生理盐水悬浮，向悬浮液中加入聚丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺，然后加入催化剂过硫酸胺和加速剂四甲基乙二胺，叉双丙烯酰胺，然后加入催化剂过硫酸胺和加速剂四甲基乙二胺，混匀后放置一定时间聚合。将得到的凝胶破碎即得到固定化细胞。混匀后放置一定时间聚合。将得到的凝胶破碎即

30、得到固定化细胞。收率达收率达72.572.5第三十九页，讲稿共七十一页哦二二 载体结合法（吸附法）载体结合法（吸附法）1 1 原理原理 微生物细胞表面带有电荷，在适当的条件下可以微生物细胞表面带有电荷，在适当的条件下可以 与载体的离子交换基团形成络合物或吸附在载体上。与载体的离子交换基团形成络合物或吸附在载体上。2 2 常用载体常用载体离子交换纤维素。阴离子树脂、离子交换纤维素。阴离子树脂、DEAEDEAE纤维素。纤维素。3 3 优缺点优缺点 优点：方法简单、载体易于再生。优点：方法简单、载体易于再生。缺点：结合力弱，菌体细胞易脱落。缺点：结合力弱，菌体细胞易脱落。第四十页，讲稿共七十一页哦研

31、究热点研究热点光交联树脂包埋法光交联树脂包埋法 例：相对分子量为例：相对分子量为1000-30001000-3000的光交联聚氨酯预聚物等，的光交联聚氨酯预聚物等，加入加入1%1%左右的光敏剂，加水配成一定浓度，加热至左右的光敏剂，加水配成一定浓度，加热至5050，然后与一定浓度的细胞悬浮液混合均匀，摊成，然后与一定浓度的细胞悬浮液混合均匀，摊成一定厚度的薄层，用紫外照射一定厚度的薄层，用紫外照射3min3min，就可制得，就可制得第四十一页，讲稿共七十一页哦第四节第四节 固定化原生质体和辅酶固定化原生质体和辅酶一一、原生质体固定化的方法、原生质体固定化的方法制备原生质体制备原生质体将原生质体

32、重新悬浮在含有渗透压稳定将原生质体重新悬浮在含有渗透压稳定剂的缓冲液中配成原生质体悬浮液剂的缓冲液中配成原生质体悬浮液包埋法固定化原生包埋法固定化原生质体。质体。关键：原生质体如何制备？关键：原生质体如何制备？第四十二页，讲稿共七十一页哦二、原生质体的制备二、原生质体的制备将对数生长期的细胞收集将对数生长期的细胞收集悬浮在含有渗透压稳定剂的悬浮在含有渗透压稳定剂的高渗缓冲液中高渗缓冲液中去细胞壁去细胞壁分离纯化分离纯化得到原生质得到原生质体体-活性鉴定活性鉴定第四十三页，讲稿共七十一页哦三、酶解注意要点三、酶解注意要点1、酶解前要预处理酶解前要预处理：主要是为了使酶渗透到细胞器中去。：主要是为

33、了使酶渗透到细胞器中去。采取的策略：先加入物质抑制或阻止某种细胞壁的成分合成，可以采取的策略：先加入物质抑制或阻止某种细胞壁的成分合成，可以使酶插入。使酶插入。一般加入：巯基乙醇，一般加入：巯基乙醇，Triton-100,甘氨酸、青霉素。甘氨酸、青霉素。2、酶系选择：、酶系选择：溶菌酶、蜗牛酶、溶菌酶、蜗牛酶、葡聚糖酶、纤维素、半纤维素和果胶酶葡聚糖酶、纤维素、半纤维素和果胶酶3、酶浓度选择（、酶浓度选择（0.5%-1%）4、酶解温度和、酶解温度和pH5、酶解终点确定、酶解终点确定第四十四页，讲稿共七十一页哦四、稳定剂（高渗溶液）要求四、稳定剂（高渗溶液）要求1.1.加入的化合物对细胞和原生质

34、体无毒性加入的化合物对细胞和原生质体无毒性2.2.不会影响水解酶的活性不会影响水解酶的活性3.3.对代谢产物无不良影响对代谢产物无不良影响四、稳定剂加入操作注意点四、稳定剂加入操作注意点1.1.一定一定pH pH（酶和菌体活性最高）（酶和菌体活性最高）2.2.一定的浓度（过高浓度原生质体易脱水皱缩）一定的浓度（过高浓度原生质体易脱水皱缩）3.3.种类：无机盐种类：无机盐-对细菌对细菌 有机物糖和糖醇有机物糖和糖醇-酵母酵母4.4.易于渗入质膜、易于被原生质体和菌体分解的物质易于渗入质膜、易于被原生质体和菌体分解的物质 不宜作为稳定剂不宜作为稳定剂第四十五页，讲稿共七十一页哦五、原生质体细胞活性

35、的检测五、原生质体细胞活性的检测1 荧光素双醋酸盐（荧光素双醋酸盐（FDA)染色法染色法2 酚藏花红染色法酚藏花红染色法3 伊文思兰染色法伊文思兰染色法第四十六页，讲稿共七十一页哦六、辅酶固定化六、辅酶固定化1、原因原因有机辅因子中具有某些特殊的化学基团，参与酶的催化反应有机辅因子中具有某些特殊的化学基团，参与酶的催化反应(递氢、递电子或递某递氢、递电子或递某些化学基团的作用）些化学基团的作用）有机辅因子在使用过程中要流失，并且不能自行再生有机辅因子在使用过程中要流失，并且不能自行再生有机辅因子价格昂贵有机辅因子价格昂贵工业上应用全酶的关键是有机辅因子的保留和再生工业上应用全酶的关键是有机辅因

36、子的保留和再生第四十七页，讲稿共七十一页哦辅酶固定化的方法：辅酶固定化的方法：2、固定化方法与酶相似、固定化方法与酶相似，一般采用溴化氰法，碳二亚胺法以一般采用溴化氰法，碳二亚胺法以及重氮偶联法等共价偶联，或将其进行适当的化学修饰后固定及重氮偶联法等共价偶联，或将其进行适当的化学修饰后固定在超滤器中。在超滤器中。3、辅酶固定化必须解决辅酶在多个酶之间传递的障碍。、辅酶固定化必须解决辅酶在多个酶之间传递的障碍。策略：先在辅酶的一定部位进行修饰策略：先在辅酶的一定部位进行修饰-引入功能团和间隔臂（形引入功能团和间隔臂（形成辅酶衍生物）成辅酶衍生物）-再与水溶性高分子结合再与水溶性高分子结合第四十八

37、页，讲稿共七十一页哦辅酶的固定化辅酶的固定化第四十九页，讲稿共七十一页哦辅酶的固定化辅酶的固定化第五十页，讲稿共七十一页哦辅酶再生的形式：辅酶再生的形式：辅酶和酶共固定辅酶和酶共固定 与酶分子偶联成辅酶与酶分子偶联成辅酶-酶复合物酶复合物第五十一页，讲稿共七十一页哦第四节 固定化技术的应用 生产果葡糖浆生产果葡糖浆生产果葡糖浆生产果葡糖浆 生产生产生产生产6-APA6-APA和抗生素和抗生素和抗生素和抗生素 生产乙醇和啤酒生产乙醇和啤酒生产乙醇和啤酒生产乙醇和啤酒 生产氨基酸生产氨基酸生产氨基酸生产氨基酸 生产苹果酸生产苹果酸生产苹果酸生产苹果酸 生产淀粉酶生产淀粉酶生产淀粉酶生产淀粉酶第五十

38、二页，讲稿共七十一页哦生产果葡糖浆l l利用葡糖异构酶是胞内酶的特性，可以直接将含酶的菌体细胞固定化，进利用葡糖异构酶是胞内酶的特性，可以直接将含酶的菌体细胞固定化，进利用葡糖异构酶是胞内酶的特性，可以直接将含酶的菌体细胞固定化，进利用葡糖异构酶是胞内酶的特性，可以直接将含酶的菌体细胞固定化，进行果葡糖浆行果葡糖浆行果葡糖浆行果葡糖浆(也称高果糖浆也称高果糖浆也称高果糖浆也称高果糖浆)的工业生产。与以前采用水溶状态的葡糖的工业生产。与以前采用水溶状态的葡糖的工业生产。与以前采用水溶状态的葡糖的工业生产。与以前采用水溶状态的葡糖异构酶或含有此酶的微生物菌体的分批法相比，固定化生物催化剂异构酶或含

39、有此酶的微生物菌体的分批法相比，固定化生物催化剂异构酶或含有此酶的微生物菌体的分批法相比，固定化生物催化剂异构酶或含有此酶的微生物菌体的分批法相比，固定化生物催化剂连续生产法具有以下优点：连续生产法具有以下优点：连续生产法具有以下优点：连续生产法具有以下优点：l l果葡糖浆质量均一；果葡糖浆质量均一；果葡糖浆质量均一；果葡糖浆质量均一；l l随着异构效率的提高，甜度也增强；随着异构效率的提高，甜度也增强；随着异构效率的提高，甜度也增强；随着异构效率的提高，甜度也增强；l l可以得到色浅、混浊度小的透明糖液；可以得到色浅、混浊度小的透明糖液；可以得到色浅、混浊度小的透明糖液；可以得到色浅、混浊度

40、小的透明糖液；l l可以制得灰分少、纯度高、风味佳的产品等。有关的固定化方法很多，曾可以制得灰分少、纯度高、风味佳的产品等。有关的固定化方法很多，曾可以制得灰分少、纯度高、风味佳的产品等。有关的固定化方法很多，曾可以制得灰分少、纯度高、风味佳的产品等。有关的固定化方法很多，曾报道过的有加热固定法、离子吸附法、絮凝法、包埋法、交联法等。报道过的有加热固定法、离子吸附法、絮凝法、包埋法、交联法等。报道过的有加热固定法、离子吸附法、絮凝法、包埋法、交联法等。报道过的有加热固定法、离子吸附法、絮凝法、包埋法、交联法等。l l例如加热法，将含葡糖异构酶的白色链霉菌的菌体细胞，在例如加热法，将含葡糖异构酶

41、的白色链霉菌的菌体细胞，在例如加热法，将含葡糖异构酶的白色链霉菌的菌体细胞，在例如加热法，将含葡糖异构酶的白色链霉菌的菌体细胞，在60606565加热加热加热加热处理处理处理处理10min10min，酶就固定在细胞内。此法简便，成本低廉，工业上容易，酶就固定在细胞内。此法简便，成本低廉，工业上容易，酶就固定在细胞内。此法简便，成本低廉，工业上容易，酶就固定在细胞内。此法简便，成本低廉，工业上容易采用。采用。采用。采用。第五十三页，讲稿共七十一页哦生产6-APA和抗生素l l6-APA6-APA6-APA6-APA即即即即6-6-6-6-氨基青霉烷酸，是半合成青霉素的重要原料。利用含青霉氨基青霉

42、烷酸，是半合成青霉素的重要原料。利用含青霉氨基青霉烷酸，是半合成青霉素的重要原料。利用含青霉氨基青霉烷酸，是半合成青霉素的重要原料。利用含青霉素酰胺酶的固定化细胞，可生产素酰胺酶的固定化细胞，可生产素酰胺酶的固定化细胞，可生产素酰胺酶的固定化细胞，可生产6-APA6-APA6-APA6-APA。例如，中国科学院微生物研究。例如，中国科学院微生物研究。例如，中国科学院微生物研究。例如，中国科学院微生物研究所和太原制药厂曾研究采用各种不同的方法制备含青霉素酰胺酶的固定所和太原制药厂曾研究采用各种不同的方法制备含青霉素酰胺酶的固定所和太原制药厂曾研究采用各种不同的方法制备含青霉素酰胺酶的固定所和太原

43、制药厂曾研究采用各种不同的方法制备含青霉素酰胺酶的固定化细胞。化细胞。化细胞。化细胞。l ll l抗生素是一大类重要的发酵产品，近年来在研究利用固定化菌体生抗生素是一大类重要的发酵产品，近年来在研究利用固定化菌体生抗生素是一大类重要的发酵产品，近年来在研究利用固定化菌体生抗生素是一大类重要的发酵产品，近年来在研究利用固定化菌体生产青霉素和杆菌肽方面也有所突破，引起了人们的注意。尤其是利产青霉素和杆菌肽方面也有所突破，引起了人们的注意。尤其是利产青霉素和杆菌肽方面也有所突破，引起了人们的注意。尤其是利产青霉素和杆菌肽方面也有所突破，引起了人们的注意。尤其是利用固定化细胞可以由单一营养物生成杆菌肽

44、，这是比传统发酵法用固定化细胞可以由单一营养物生成杆菌肽，这是比传统发酵法用固定化细胞可以由单一营养物生成杆菌肽，这是比传统发酵法用固定化细胞可以由单一营养物生成杆菌肽，这是比传统发酵法(用淀粉用淀粉用淀粉用淀粉-肉汤培养基肉汤培养基肉汤培养基肉汤培养基)优越的地方。优越的地方。优越的地方。优越的地方。第五十四页，讲稿共七十一页哦生产乙醇和啤酒l l(一一一一)生产酒精生产酒精生产酒精生产酒精l l酒精发酵需要大型发酵罐，不但设备繁杂，操作困难，而且耗费一部分糖酒精发酵需要大型发酵罐，不但设备繁杂，操作困难，而且耗费一部分糖酒精发酵需要大型发酵罐，不但设备繁杂，操作困难，而且耗费一部分糖酒精发

45、酵需要大型发酵罐，不但设备繁杂，操作困难，而且耗费一部分糖以供酵母生长之用。自从应用固定化细胞进行连续发酵日益发展后，酒精以供酵母生长之用。自从应用固定化细胞进行连续发酵日益发展后，酒精以供酵母生长之用。自从应用固定化细胞进行连续发酵日益发展后，酒精以供酵母生长之用。自从应用固定化细胞进行连续发酵日益发展后，酒精发酵时间由传统方法的发酵时间由传统方法的发酵时间由传统方法的发酵时间由传统方法的36h36h缩短至缩短至缩短至缩短至3h3h以下，乙醇生产能力每小时为以下，乙醇生产能力每小时为以下，乙醇生产能力每小时为以下，乙醇生产能力每小时为202050g/L50g/L，而传统方法仅为，而传统方法仅

46、为，而传统方法仅为，而传统方法仅为2g/L2g/L。l l例如，千田一郎等将酵母固定于例如，千田一郎等将酵母固定于例如，千田一郎等将酵母固定于例如，千田一郎等将酵母固定于K-K-角叉菜胶，利用这种固定化增殖酵母可角叉菜胶，利用这种固定化增殖酵母可角叉菜胶，利用这种固定化增殖酵母可角叉菜胶，利用这种固定化增殖酵母可稳定、连续生产一年以上，并且生产速率比以前的发酵法快稳定、连续生产一年以上，并且生产速率比以前的发酵法快稳定、连续生产一年以上，并且生产速率比以前的发酵法快稳定、连续生产一年以上，并且生产速率比以前的发酵法快1010多倍。多倍。多倍。多倍。l l另外，关于细菌固定化的研究也颇为活跃，据

47、另外，关于细菌固定化的研究也颇为活跃，据另外，关于细菌固定化的研究也颇为活跃，据另外，关于细菌固定化的研究也颇为活跃，据ArcuriArcuri等报道，将运动发酵等报道，将运动发酵等报道，将运动发酵等报道，将运动发酵单胞菌用玻璃纤维吸附，使用由葡糖单胞菌用玻璃纤维吸附，使用由葡糖单胞菌用玻璃纤维吸附，使用由葡糖单胞菌用玻璃纤维吸附，使用由葡糖5-20%5-20%及酵母膏及酵母膏及酵母膏及酵母膏0.5%0.5%配成的培养配成的培养配成的培养配成的培养基，连续发酵基，连续发酵基，连续发酵基，连续发酵28d28d，乙醇生产能力，乙醇生产能力，乙醇生产能力，乙醇生产能力152g/Lh(152g/Lh(

48、停留时间为停留时间为停留时间为停留时间为101015min)15min)，这，这，这，这要比固定化酵母的乙醇生产能力大得多。要比固定化酵母的乙醇生产能力大得多。要比固定化酵母的乙醇生产能力大得多。要比固定化酵母的乙醇生产能力大得多。第五十五页，讲稿共七十一页哦l l(二二二二)生产啤酒生产啤酒生产啤酒生产啤酒l l利用麦芽汁发酵生产啤酒，实际上是一种特殊类型的酒精发利用麦芽汁发酵生产啤酒，实际上是一种特殊类型的酒精发利用麦芽汁发酵生产啤酒，实际上是一种特殊类型的酒精发利用麦芽汁发酵生产啤酒，实际上是一种特殊类型的酒精发酵。近年来，利用固定化酵母细胞生产啤酒的研究已经很多。酵。近年来，利用固定化

49、酵母细胞生产啤酒的研究已经很多。酵。近年来，利用固定化酵母细胞生产啤酒的研究已经很多。酵。近年来，利用固定化酵母细胞生产啤酒的研究已经很多。l l例如，例如，例如，例如，whitewhite等人报道了一个利用海藻酸钙凝胶包埋非絮凝性细等人报道了一个利用海藻酸钙凝胶包埋非絮凝性细等人报道了一个利用海藻酸钙凝胶包埋非絮凝性细等人报道了一个利用海藻酸钙凝胶包埋非絮凝性细胞，连续生产啤酒的方法。胞，连续生产啤酒的方法。胞，连续生产啤酒的方法。胞，连续生产啤酒的方法。l lLinkoLinko等人将酵母细胞固定于海藻酸钙凝胶内，置于填充式柱式反应等人将酵母细胞固定于海藻酸钙凝胶内，置于填充式柱式反应等人

50、将酵母细胞固定于海藻酸钙凝胶内，置于填充式柱式反应等人将酵母细胞固定于海藻酸钙凝胶内，置于填充式柱式反应器内，用于由麦芽汁连续发酵生产啤酒，可维持几个月，其麦芽汁器内，用于由麦芽汁连续发酵生产啤酒，可维持几个月，其麦芽汁器内，用于由麦芽汁连续发酵生产啤酒，可维持几个月，其麦芽汁器内，用于由麦芽汁连续发酵生产啤酒，可维持几个月，其麦芽汁在柱式反应器内的停留时间为在柱式反应器内的停留时间为在柱式反应器内的停留时间为在柱式反应器内的停留时间为2h2h，啤酒的酒精含量可达到，啤酒的酒精含量可达到，啤酒的酒精含量可达到，啤酒的酒精含量可达到4.5%4.5%。l l我国上海工业微生物所从我国上海工业微生物