分子生物学分子克隆技术精选PPT.ppt

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1、关于分子生物学分子克隆技术1第1页，讲稿共83张，创作于星期一第2页，讲稿共83张，创作于星期一n基因工程是指在微观领域（分子水平）中，根据分子生物学和遗传学原理，设计并实施一项把一个生物体中有用的目的DNA(遗传信息)转入另一个生物体中，使后者获得新的需要的遗传性状或表达所需要的产物，最终实现该技术的商业价值。n基基因因工工程程的的基基本本特特点点是是，分分子子水水平平操操作，细胞水平表达。作，细胞水平表达。基因工程基因工程基因工程与建筑工程基因工程与建筑工程第3页，讲稿共83张，创作于星期一n重组DNA技术的重大突破带动了现代生物技术的兴起，并很快产生了许多生命科学的高技术产业。n重组DN

2、A技术，又称为基因或分子克隆技术，是基因工程的核心技术。该技术包括了一系列的分子生物学操作步骤。基因工程的核心技术是DNA重组技术第4页，讲稿共83张，创作于星期一n分子克隆技术分子克隆技术 又称为重组又称为重组DNA技术，是指将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，技术，是指将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的新性状的DNA体外操作程序。体外操作程序。供体、受体、载体是重组供体、受体、载体是重组DNADNA技术

3、的三大基本元件。技术的三大基本元件。第5页，讲稿共83张，创作于星期一重组DNA操作一般步骤：（1）获得目的基因；（2）与克隆载体连接，形成新的重组DNA分子；（3）用重组DNA分子转化受体细胞，并能在受体细胞中复制和遗传；（4）对转化子筛选和鉴定；（5）对获得外源基因的细胞或生物体通过培养，获得所需的遗传性状或表达出所需要的产物。第6页，讲稿共83张，创作于星期一获得需要的目的基因（外源基因）获得需要的目的基因（外源基因）n获得需要的目的基因常用的方法：（1）直接从生物体中提取总DNA，构建基因文库(gene library)，从中调用目的基因；（2）以mRNA为模板，反转录合成互补的DNA

4、片段；（3）利用聚合酶链式反应（PCR）特异性地扩增所需要的目的基因片段，等等。第7页，讲稿共83张，创作于星期一细胞内总DNA的提取分离与基因文库的构建细胞内总DNA的提取分离程序第8页，讲稿共83张，创作于星期一l紫外分光光度计测定DNA溶液的纯度和浓度。第9页，讲稿共83张，创作于星期一基因工程的工具酶基因工程的工具酶“手术刀手术刀”专司切割之职，内切酶专司切割之职，内切酶“缝纫针缝纫针”具有连接之功，连接酶具有连接之功，连接酶“复印机复印机”行使复制之责，行使复制之责，DNA聚合酶聚合酶第10页，讲稿共83张，创作于星期一(“交通工具车子交通工具车子”)载体载体n有有了了切切割割与与缝

5、缝合合（ligase）基基因因DNA的的工工具具，还还得得有有一一个个“车子车子”将重组将重组DNA送到宿主细胞中去。送到宿主细胞中去。第11页，讲稿共83张，创作于星期一逆转录酶逆转录酶使真核基因的制备成为可能。使真核基因的制备成为可能。（1）真核基因组庞大而复杂，不易制得基因图谱。）真核基因组庞大而复杂，不易制得基因图谱。（2）即即使使有有了了基基因因图图谱谱，因因为为真真核核基基因因有有内内含含子子，不不能能在在原原核核表表达达系系统剪接出统剪接出mRNA，没有成熟的，没有成熟的mRNA就不能得到相应得产物。就不能得到相应得产物。（3）经经过过逆逆转转录录mRNAcDNA(complem

6、entory DNA)得得到到的的cDNA文库要比基因组文库小得多，所以筛选阳性克隆就方便得多。文库要比基因组文库小得多，所以筛选阳性克隆就方便得多。第12页，讲稿共83张，创作于星期一四、分子克隆的技术支撑四、分子克隆的技术支撑n核酸凝胶电泳技术n核酸分子连接技术n细菌转化技术nDNA序列分析技术n寡核苷酸合成技术n基因定点突变技术n聚合酶链反应（PCR）技术nDNA序列测定技术第13页，讲稿共83张，创作于星期一核酸凝胶电泳核酸凝胶电泳第14页，讲稿共83张，创作于星期一细菌转化技术细菌转化技术（包括感受态细胞制备）（包括感受态细胞制备）第15页，讲稿共83张，创作于星期一聚合酶链反应（聚

7、合酶链反应（PCR）技术）技术第16页，讲稿共83张，创作于星期一大规模生产生物活性物质大规模生产生物活性物质野生细胞野生细胞分离工程酶分离工程基因工程蛋白质工程途径工程工程细胞发酵工程酶工程细胞工程生物活性物质第17页，讲稿共83张，创作于星期一第18页，讲稿共83张，创作于星期一 用携带了外源基因的农杆菌用携带了外源基因的农杆菌TiTi质粒转化植物原生质体，质粒转化植物原生质体，发育成具有新性状的完整植株发育成具有新性状的完整植株转基因植物。转基因植物。第19页，讲稿共83张，创作于星期一基因工程的工具酶基因工程的工具酶“手术刀手术刀”专司切割之职专司切割之职“缝纫针缝纫针”具有连接之功具

8、有连接之功“复印机复印机”行使复制之责行使复制之责内切酶内切酶连接酶连接酶聚合酶聚合酶第20页，讲稿共83张，创作于星期一内切酶内切酶“手术刀手术刀”专司切割之职专司切割之职“缝纫针缝纫针”具有连接之功具有连接之功“复印机复印机”行使复制之责行使复制之责内切酶内切酶连接酶连接酶聚合酶聚合酶第21页，讲稿共83张，创作于星期一内切酶第22页，讲稿共83张，创作于星期一同裂酶(Isoschizomers）第23页，讲稿共83张，创作于星期一同尾酶第24页，讲稿共83张，创作于星期一星活性*n所谓星活性又称Star活性。是指由于反应条件不同而产生的切断与原来认识序列不同的位点的现象，也就是说产生St

9、ar活性后，不但可以切断特异性的识别位点，还可以切断非特异性的位点。产生Star活性的结果是酶切条带增多。nDifferenceswhichcanleadtostaractivityincludelowionicstrength,highpH,andhigh(5%v/v)glycerolconcentrations.nHighFidelity(HF)RestrictionEnzymescanbeusedtoreducestaractivity.第25页，讲稿共83张，创作于星期一第26页，讲稿共83张，创作于星期一DNA聚合酶nTaq酶用Taq酶扩增DNA时常使片段3端凸出一个A。nPfu酶产

10、生平末端产物。第27页，讲稿共83张，创作于星期一连接酶nT4DNALigase(invitrogen)16C过夜或者室温1-2个小时了连接即可。第28页，讲稿共83张，创作于星期一基因工程的载体-用于扩增第29页，讲稿共83张，创作于星期一克隆载体必备条件克隆载体必备条件（1）具有复制起点（2）具有抗菌素抗性基因（3）具有若干限制酶单一识别位点（4）具有较小的相对分子质量和较高的拷贝数。第30页，讲稿共83张，创作于星期一表达型基因工程的载体-以PET32为例第31页，讲稿共83张，创作于星期一多克隆位点第32页，讲稿共83张，创作于星期一宿主n要考虑宿主菌对密码子的偏爱性大肠杆菌不同密码子

11、的偏爱性问题，将64组密码子分为强、中、弱密码子第33页，讲稿共83张，创作于星期一目的产物目的产物目的基因不溶性的高效表达n过程：目的基因编码的真核蛋白质与宿主基因编码的原核多肽或或其它基因编码的具有其它功能的多肽和结合在一起，这种结合在一起的形成的不溶性无活性的包涵体，又叫为融合蛋白。n举例：胰岛素与-半乳糖苷酶形成包涵体n优点：避免细菌蛋白酶破坏，提高目的基因表达产物产量。n缺点：需要经过溶解和复性才能获得有活性的n适合：不需要翻译后修饰的蛋白质产物第34页，讲稿共83张，创作于星期一目的基因的高效分泌表达n概念：目的蛋白分泌到细胞周质和目的蛋白转运到细胞周质后再分泌到细胞外n优点：防止

12、宿主菌对表达产物的降解；有利于蛋白质正确折叠，形成天然构象减轻宿主细胞代谢负荷有利于分离n需要在质粒设计时加入一段信号肽基因第35页，讲稿共83张，创作于星期一基因克隆操作过程第36页，讲稿共83张，创作于星期一克隆示意图第37页，讲稿共83张，创作于星期一克隆示意图第38页，讲稿共83张，创作于星期一克隆技术流程n分n切n连n转n筛第39页，讲稿共83张，创作于星期一分n分离（来自生物组织）、扩增（设计引物，PCR扩增）nmRNA-DNA-扩增第40页，讲稿共83张，创作于星期一引物设计与订购n酶切位点双酶切、保护碱基、最合适的缓冲液。n引物订购第41页，讲稿共83张，创作于星期一保护碱基第

13、42页，讲稿共83张，创作于星期一1.用限制性酶消化限制性酶消化DNA 样品样品第43页，讲稿共83张，创作于星期一单酶切第44页，讲稿共83张，创作于星期一双酶切第45页，讲稿共83张，创作于星期一选择合适的双酶切缓冲液第46页，讲稿共83张，创作于星期一2.用限用限制性内制性内切酶消切酶消化化质粒DNA 第47页，讲稿共83张，创作于星期一3.连接样品DNA和质粒DNA的消化产物第48页，讲稿共83张，创作于星期一连接前最好要定量n连接比例摩尔比例为：插入片度：质粒=10:1-5:1为佳。n质粒几十个ng为佳。第49页，讲稿共83张，创作于星期一双酶切双酶切Eco R切割位点切割位点Bg

14、l切割位点切割位点+EcoR+Bg l双酶切双酶切Eco R+Bg l双酶切双酶切T4 DNA连接酶连接酶15C重组体重组体配伍末端的配伍末端的连接情况和同一连接情况和同一限制酶切位点连限制酶切位点连接相似。接相似。第50页，讲稿共83张，创作于星期一冷循环器第51页，讲稿共83张，创作于星期一4.用连接产物转化大肠杆菌感受态细胞n转化细菌有两个基本方法。一是化学法，即用CaCl2处理并加热激以促进DNA进入菌体；二是电激法，即 施加短脉冲的电荷以促进施加短脉冲的电荷以促进DNA吸收。第52页，讲稿共83张，创作于星期一用氯化钙化学转化用氯化钙化学转化第53页，讲稿共83张，创作于星期一用氯化

15、钙化学用氯化钙化学转化第54页，讲稿共83张，创作于星期一电激转化电激转化第55页，讲稿共83张，创作于星期一一个电激转化程序n加50-200ngDNA到40ul电激感受态细菌中n将混合物放入一个预冷的电激杯中n施以脉冲电处理，脉冲长度预期值为8to12msn立即加1mlLB培养液，在室温下振荡2-4小时。分别取10ul和100ul涂布在到两个加有抗菌素的LB琼脂平板上，保温培养1天。第56页，讲稿共83张，创作于星期一5.细菌在加有在加有Amp+X-Gal的培养基上生长以进行筛选n连接会有三种结果，一是要插入的序列自连；二是切开的质粒重连；三是要插入的序列与质粒相连。第一种连接结果没有菌落形

16、成。第二种连接结果表现为蓝色菌落。只有后一种结果是符合需要的，产生白色的抗氨苄青霉素菌落。第57页，讲稿共83张，创作于星期一灭菌器第58页，讲稿共83张，创作于星期一加IPTG和X-GAL第59页，讲稿共83张，创作于星期一倒平板第60页，讲稿共83张，创作于星期一 互互补补利用利用互补原理筛选重组体互补原理筛选重组体pUC18 第61页，讲稿共83张，创作于星期一筛选结果n蓝菌落代表含有质粒的耐药菌，表达出由完好的蓝菌落代表含有质粒的耐药菌，表达出由完好的 LacZ序列编码的功功能性的能性的 片段。片段。n白菌落代表含有质粒的耐氨苄青霉素菌，质粒上白菌落代表含有质粒的耐氨苄青霉素菌，质粒上

17、 LacZ序列上有插入片上有插入片段。段。第62页，讲稿共83张，创作于星期一乳糖和诱导物IPTG的化学结构isopropyl-beta-D-isopropyl-beta-D-thiogalactopyranosidethiogalactopyranoside第63页，讲稿共83张，创作于星期一X-galnX-Gal是-半乳糖苷酶(-galactosidase)的显色底物，在-半乳糖苷酶的催化下会产生蓝色产物。常用于-半乳糖苷酶的原位染色检测以及蓝白斑筛选。第64页，讲稿共83张，创作于星期一X-gal水解第65页，讲稿共83张，创作于星期一筛选结果模式图第66页，讲稿共83张，创作于星期一蓝

18、菌落n建议用DH5做宿主菌。第67页，讲稿共83张，创作于星期一蓝白菌落第68页，讲稿共83张，创作于星期一电泳仪第69页，讲稿共83张，创作于星期一n经过双酶切、PCR等鉴定，送阳性克隆测序。n提取正确的克隆菌中的质粒，转入表达型的菌株，如BL21等。诱导表达蛋白第70页，讲稿共83张，创作于星期一鉴定方法第71页，讲稿共83张，创作于星期一 PCR鉴鉴定定第72页，讲稿共83张，创作于星期一 原原位位杂杂交交第73页，讲稿共83张，创作于星期一鸡的鸡的肌球蛋白的克隆和检出肌球蛋白的克隆和检出免疫学方法免疫学方法 第74页，讲稿共83张，创作于星期一蛋白质的纯化第75页，讲稿共83张，创作于

19、星期一谢谢！第76页，讲稿共83张，创作于星期一多利诞生的过程多利诞生的过程 为为什什么么震震惊惊和和惊惊呼呼，我我们们先先了了解解一一下下多多利利诞诞生生的的过过程程以以及及胚胚胎胎细细胞胞克克隆隆和和体体细细胞胞克克隆隆的区别这两个基本问题，对我们学习后面内容或许有所帮助和启发。的区别这两个基本问题，对我们学习后面内容或许有所帮助和启发。多利诞生的过程：多利诞生的过程：1.取出第一只成年母羊乳腺的普通细胞，分离基因备用。取出第一只成年母羊乳腺的普通细胞，分离基因备用。2.取取出出第第二二只只母母羊羊未未受受精精的的卵卵细细胞胞，取取出出基基因因换换上上第第一一只只羊羊乳乳腺腺细细胞胞基基因

20、因（“掉掉包包”），放放电电激激活活该该卵卵细细胞胞，使使之之象象正正常常受受精精卵卵一一样样进进行行细细胞胞分分裂裂，直直至至一一定定阶段，胚胎成熟。阶段，胚胎成熟。3.将将成成熟熟的的胚胚胎胎移移植植到到第第三三只只母母羊羊子子宫宫中中发发育育，妊妊娠娠（同同正正常常一一样样），最最后后产产下下多利。多利。这样一只与第一只羊基因百分之百一样的复制品诞生了。这样一只与第一只羊基因百分之百一样的复制品诞生了。第77页，讲稿共83张，创作于星期一第78页，讲稿共83张，创作于星期一第79页，讲稿共83张，创作于星期一目的基因高效表达规律目的基因高效表达规律1.目的蛋白无须变形和复性就具有生物活性

21、的表达方式2.对于翻译后需要修饰蛋白质结构，能够进行目的蛋白结构修饰的表达方式3.能够将目的蛋白分泌到细胞周质、特别是分泌到细胞外的分泌型表达方式4.降低不含目的基因细胞的比例，保持目的基因的稳定性，使目的基因在宿主细胞内长时间超持和表达5.通过选择好的培养方法和能够进行高密度培养的细胞，提高细胞密度6.在宿主细胞选择、质粒构建、培养基设计都应该考虑有利于产物的分离提纯第80页，讲稿共83张，创作于星期一n概述n基因克隆工具酶n基因克隆载体n目的基因的分离n基因克隆操作过程n目的基因在宿主中的表达第81页，讲稿共83张，创作于星期一CIAP去除5磷酸外源DNA限制性内切酶酶切5P3OH5P3OH5P5P3OH3OHT4连接酶连接5OH5OH3OH转化E.Coli限制性内切酶酶切载体多克隆位点3OH筛选重组子，测序第82页，讲稿共83张，创作于星期一感感谢谢大大家家观观看看2023/4/9第83页，讲稿共83张，创作于星期一