医学分子生物学.pptx

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1、一、RNA干扰（RNA interferenc，RNAi）的发现 1990年，Napoli矮脚牵牛花实验Plant Cell,1990 第1页/共28页 1995年，郭苏和导师坎菲思（Kenneth KemphuesKenneth Kemphues）Potent and specific genetic interference bydouble-stranded RNA in Caenorhabditis elegans 1998年，安德鲁法尔（Andrew Z.Fire）克雷格梅洛（Craig C.Mello）Nature,1998秀丽新小杆线虫秀丽新小杆线虫par-1基因Cell,199

2、5第一篇以“RNA 干扰”命名该现象及阐述机制的文章第2页/共28页2001年，托马斯塔什尔（Thomas Tuschl）20012001年，美国年，美国科学科学杂志评选杂志评选 年度十大科学进展年度十大科学进展 Elbashir SM and Tuschl T.Nature,2001第一篇探讨哺乳动物细胞中RNA干扰现象的文章Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells20022002年，美国年，美国科学科学杂志评选杂志评选 年度十大科学进展之首年度十大科学进展之首 第3

3、页/共28页2001年，Bernstein E 分离鉴定果蝇Dicer Role for a bidentate ribonuclease in the initiation step of RNA interference Nature,2001 2006年，Jennifer Doudna X射线衍射晶体分析技术Structure basis for double-Stranded RNA processing by DicerScience,2006纯化并结晶 Giardia intestinalis Dicer 第4页/共28页2006年，美国斯坦福大学医学院 安德鲁法尔（Andrew

4、Z.Fire）for their discovery of RNA interference gene silencing by double-stranded RNAThe Nobel Prize in Physiology or Medicine 2006 Andrew Z.Fire Craig C.Mello 马萨诸塞大学医学院 克雷格梅洛（Craig C.Mello）获得诺贝尔医学和生理学奖第5页/共28页二、RNA干扰(post-transcriptional gene silencing，PTGS)的一种形式。RNAi是指外源双链RNA进入细胞后，引起与其序列同源的特异基因mRNA

5、 降解的现象属于转录后基因沉默antisense复制、转录翻译水平 knock-outDNA水平RNAi转录后水平基因沉默优点：方便快捷 高特异性功能：分析特定基因在细胞内的功能。高效性 作用广泛性第6页/共28页“Immune System”of the Genome Antiviral Defense Suppress Transposon Activity Response to Aberrant RNAs第7页/共28页三、RNA干扰机制1、启动阶段：dsRNA被Dicer逐步切割成siRNA（small interfering RNA）2、效应阶段:Risc形成：siRNA与蛋白质聚

6、集形成Risc （Risc，RNA-induced silencing complex）Risc激活：siRNA双链解开。激活的Risc定位到同源mRNA上，降解该mRNARiscRiscRisc53第8页/共28页四、RNA干扰过程中的关键元件1.dsRNA（double strand RNA）RNA病毒：ssRNAdsRNARNA指导的RNA聚合酶（RNA dependent RNA polymerase,RdRp）RdRp3OH5p5p3OH3OH5pRdRp 人工导入dsRNA第9页/共28页2.DicerRNase III家族成员核酸内切酶，特异性识别并切割dsRNA dsRNA结合

7、结构域（dsRNA-binding domain,dsRBD）RNase III催化结构域解旋酶结构域（helicase domain）dsRNAsiRNADicera front view of the crystal structure of Giardia intestinalis Dicer ATP依赖PAZ结构域第10页/共28页3.siRNA duplex结构：双链3端突出2个核苷酸2125个核苷酸3OH5p5p3OH21 nucleotides2 nt overhang 第11页/共28页4.Risc（RNA-inducing silencing complex）RNA诱导的沉默

8、复合物组分：siRNAAgo（Argonaute protein family）结合募集siRNARNA helicase（RNA解旋酶）形成单链siRNARiscRisc正义链反义链反义链激活的RiscATP依赖RNase（内切酶、外切酶）切割目标mRNA3OH5pRisc反义链降 解第12页/共28页5.RdRp（RNA dependent RNA polymerase）RNA依赖的RNA聚合酶放大效应：微量siRNA，明显干扰效应可能机制：siRNA 重复利用 目的目的mRNAmRNA直接扩增直接扩增3OH5pRdRpRisc反义链激活的Risc53Dicersecondary siRN

9、Aprimary siRNA第13页/共28页mechanism of RNAi第14页/共28页脱靶效应（off-target）正义链干扰 正义链修饰 反义链seed-region活性反义链修饰 剂量依赖 cocktail smart poolRiscRiscATP依赖（+）（-）（+）（-）Risc（-）mRNARisc（+）on-targetoff-target正义链干扰目标mRNA非目标mRNA第15页/共28页反义链seed-region活性（+）（-）5533seed region 27 核苷酸（-）RiscmRNAmRNAmRNARiscRisc335535目标mRNA非目标mR

10、NA第16页/共28页五、RNA干扰研究的一般技术路线1、目的基因的确定2、siRNA序列的设计3、获得siRNA产物4、siRNA转移5、RNA干扰效果检测第17页/共28页第18页/共28页第19页/共28页第20页/共28页siRNA转移（1）脂质体介导的转染（2）病毒介导的感染（3）电穿孔RNA干扰效果检测（1）mRNA：RT-PCR、定量PCR、Northern。（2）蛋白质：Western、ELISA、免疫荧光（3）生理生化表型参数：第21页/共28页六、微小RNA（microRNA，miRNA）1、miRNA：广泛存在于真核细胞中的一组短小的、不编码蛋白质的RNA家族，由约22n

11、t组成的单链RNA。2、miRNA的发现：The C.elegans heteroch ronic gene lin24 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-141993年，Lee et al，Cell线虫，lin-4 lin-142000年，Reinhart et al，Nature 线虫，let-7The 21nucleo tide let-7 RNA regulates developmental timing in Caenorhabditis elegans拟南芥，水稻斑马鱼，果蝇鼠，人第22页/共28页3

12、、miRNA的成熟：长的内源性转录本（pri-miRNA）70nt 茎环结构miRNA前体（pre-miRNA）miRNA双链 miRNA单链-Risc复合物micro RNA基因组pri-miRNApre-miRNApre-miRNAmiRNA duplexDicer单链miRNADrosha RNaseRisc活化miRNA胞核胞浆Exportin53553miRNA duplexRisc（+）（-）Risc（+）（-）第23页/共28页目标mRNA354、miRNA与目标mRNA的作用模式：3UTR 不完全互补，抑制翻译。编码区完全互补，降解mRNA。（类似siRNA与目标mRNA的结合

13、与降解）上述两种模式均具备。55、miRNA的生理功能：时空性表达（组织特异性和阶段特异性）控制个体发育353lin-4：第一、二期let-7：第三、四期和成虫期第24页/共28页 miRNA 产生：基因组（正常）来源：内源转录本直接来源：发夹状pre-miRNA 结构：单链互补性：不完全互补或完全互补特异性：相对较低 作用部位：3UTR 或编码区 对基因的影响：抑制翻译或降解目标 mRNA 生理功能：调节内源基因的表达 控制个体发育 siRNA 病毒感染、转座子移位、导入dsRNA（异常）病毒RNA或转基因（外源）长链dsRNA 单链 完全互补 较高 编码区或UTR 降解目标 mRNA 抵抗

14、病毒感染、抑制转座子活性miRNA与与siRNA的比较：的比较：第25页/共28页均为Dicer的切割产物：长度均为22nt左右 siRNA duplex miRNA duplex均需Argonaute家族蛋白的存在，同为Risc的组分 两者进化关系上可能的推论：siRNA是miRNA的补充 miRNA在进化中替代了siRNAmiRNA与与siRNA的联系：的联系：第26页/共28页七、反义RNA（antisenseRNA）从基因组中非编码区转录的一段能与目标mRNA序列互补配对的单链RNA，可阻断该目标mRNA翻译成蛋白质。siRNAmiRNAantisenseRNA来源来源外源外源基因组基因组基因组基因组长度长度2130nt22nt更长更长配对配对严谨严谨不严谨不严谨严谨严谨方式方式转录后转录后翻译、转录后翻译、转录后 复制、转录（后）、翻译复制、转录（后）、翻译第27页/共28页谢谢您的观看！第28页/共28页